CN104640975A - 用于制备富含由微藻产生的叶黄素的组合物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于制备富含由微藻具体地由属于小球藻属的微藻产生的、更确切地由普通小球藻产生的叶黄素的组合物的方法,其特征在于所述方法包括以下步骤系列:1)从微藻生物质制备细胞裂解物;2)用一种极性溶剂,优选乙酸乙酯处理裂解的微藻生物质,以获得包含来自初始生物质的叶黄素和脂类的一种油树脂;3)借助一种非极性溶剂,在此是一种处于超临界压力下的流体,提取在步骤2)中获得的油树脂,以获得富含主要由甘油三酸脂组成的非极性脂类的一个部分、以及富含叶黄素的一个不溶部分;并且4)回收由此得到的富含叶黄素的部分。
Description
发明领域
本发明涉及一种用于获得富含由微藻更具体地是由小球藻科的微藻产生的、甚至更确切地由普通小球藻产生的叶黄素的组合物的方法。
现有技术水平的呈现
类葫萝卜素在某种程度上是在非常大量的生物有机体中广泛分布的橙色素或黄色素。它们是脂溶的并且通常可易于由有机体模拟。
它们属于萜类化合物的化学家族,形成自异戊二烯结构与脂肪族结构或脂环族结构的聚合反应。普遍公认的是,它们遵循类似于脂类的那些代谢途径的代谢途径。
它们是由所有绿色植物合成的,并且是由很多真菌和细菌(包括蓝藻细菌)以及由所有藻类合成的。它们是由动物在它们的食品中吸收的。
类葫萝卜素具有抗氧化剂特性,并且已经对其针对预防癌症以及其他人类疾病进行了研究。
类葫萝卜素天然存在于可食用的叶子、花和果实中,并且易于获得自花(例如万寿菊)、浆果类、以及根组织(例如胡萝卜)。
类葫萝卜素的代表性实例包括α-胡萝卜素、β-胡萝卜素和番茄红素。
β-胡萝卜素和番茄红素一般以游离的非组合形式存在,这种形式被限制在植物细胞的叶绿体内。
胡萝卜醇(Xanthophyll)是通过添加氧原子(醇、酮、环氧等官能团),衍生自胡萝卜素的黄色分子。
在某些黄色或橙色水果和蔬菜中,胡萝卜醇是丰富的,这些水果和蔬菜例如是桃、芒果、番木瓜、西梅、南瓜和橙子。
它们还被发现于植物细胞的叶绿体或有色体中,具体地在某些黄色的、橙色的或红色的花的花瓣中,以及在藻类中,例如在褐藻(褐藻纲)中,在那里它们掩蔽了叶绿素。
胡萝卜醇是尤其有助于眼睛健康的抗氧化剂。
胡萝卜醇的实例包括叶黄素(lutein)、虾青素、角黄素、玉米黄素、隐黄素、等。
一些胡萝卜醇存在于植物的花中,例如万寿菊中,一般是处于酸(例如棕榈酸和豆蔻酸)的二酯的形式。
一般而言,游离形式的类葫萝卜素还存在于绿色植物、绿叶和绿色植物质的叶绿体中,这些绿色植物例如是苜蓿、菠菜或羽衣甘蓝。
当它们以食品或作为食品补充剂被消耗时,游离形式的类葫萝卜素具有更好的吸收。
叶黄素是在眼睛的黄斑中以及在视网膜的中心部分以高浓度被发现的具有式4-[18-(4-羟基-2,6,6-三甲基环己-1-烯-1-基)-3,7,12,16-四甲基十八碳-1,3,5,7,9,11,13,15,17-壬烯-1-基]-3,5,5-三甲基环己-2-烯-1-醇的胡萝卜醇色素。
在过滤掉紫外光波长以防止对眼球晶状体以及对黄斑的损伤中,它在其中起到重要作用。
此外,叶黄素具有抗氧化剂特性,这使之有可能保护富含多不饱和脂肪酸的黄斑,对抗光诱导的自由基。
身体不能产生叶黄素,因此,必须通过膳食摄取。
因此,叶黄素已经变得日益用于营养补充剂,以便预防和/或治疗与年龄相关的黄斑变性(或ARMD)、白内障、以及色素性视网膜炎引起的失明。
叶黄素提取物的最常见来源精确地说是金盏花,它包含已知最高水平之一的叶黄素,并且具有仅包含低浓度的其他类葫萝卜素的优点。
通过用溶剂提取,从菊科的法国万寿菊(万寿菊)的花中常规地获得处于晶态形式的叶黄素,以产生一种油树脂(包含70%的叶黄素)。
然后通过进行其他系列的提取,用溶剂(己烷、戊烷、二氯甲烷、乙醇、甲醇)或使用1,2-丙二醇和盐酸钾,纯化该油树脂。
这种两步模式的提取是例如描述在国际专利申请WO2012/064186中。
这两种方法产生一种最终产物,该最终产物已经除去了99%至99.9%的有机提取溶剂。
在销售前,晶态叶黄素可以掺入玉米油的悬液中。
例如在文献中,专利US 4 048 203、US 5 382 714和US 5 648 564传授了用于纯化来自万寿菊花瓣的、处于脂肪酸酯形式的叶黄素的方法,其中用烃基溶剂处理干万寿菊花瓣。
相对于从绿色植物提取叶黄素,它可能是有利的,因为它并不需要皂化并且然后裂解以释放处于游离形式的叶黄素的额外步骤,当它被消耗时,所述形式有望用于更好的吸收。
然而,从植物提取和纯化叶黄素、还有胡萝卜素、以及脂肪酸不是非常经济的,因为它需要很多昂贵的纯化步骤和大量时间从而从存在于植物材料中的大量其他化合物中分离它们。
此外,万寿菊花的叶黄素含量仍然很低(0.3mg/g的干物质)。
因此,在使用微藻作为这种类胡萝卜素的替代来源方面,存在与日俱增的兴趣。
例如,已经提出缪里尔藻属(Muriellopsis)的微藻,若夫小球藻(Chlorella zofingiensis),阿尔默瑞栅藻(Scenedesmus almeriensis)和原始小球藻型作为叶黄素的潜在来源。
尽管如此,描述的叶黄素生产力仍不够高,不足以在工业规模上经济地实行。
已经描述了多个程序,例如国际申请WO 89/006910的程序,用以从培养的藻类细胞中获得叶黄素或富含叶黄素的组合物。
在专利EP 1 808 483中,更具体地,使用的方法由以下组成:在真空下离心、沉淀或过滤,以便浓缩细胞,并且干燥浓缩的细胞。
然后优选地将干燥的细胞生物质在真空下的包装中或优选地通过将氮气引入塑料袋中以除去氧气而储存在低温下(例如-20℃或甚至更低)。
专利EP 1 808 483还推荐将抗氧化剂和乳化剂添加至收获的细胞悬液中。
除了回收富含叶黄素的生物质,专利EP 1 808 483描述了使叶黄素具有更好的生物利用率的可能性。优选的方法进而包括使收集的细胞破裂,并且干燥它们,以便获得叶黄素或富含叶黄素的组合物。
推荐使用标准珠磨机,在珠磨机中在适当的抗氧化剂(以便防止叶黄素氧化)的存在下,生物质的悬液崩解在水中的悬液中。
干燥后,获得了“小型的颗粒”型的粉状产物。由此获得的粉末可以进而直接用于旨在用于人类消费的食品应用中,例如食品补充剂,或用作与其他成分的混合物,例如水产养殖中的鱼粉。
在另一方法中,叶黄素可以借助用于用非极性溶剂进行提取的方法来浓缩,以便将其配制在食品补充剂或药用产品中。
尤其已经在植物领域描述了用非极性溶剂或用超临界流体提取叶黄素。
因此,在专利US 6 106 720中,例如描述了用于从藻类、从胡萝卜汁、或从番茄皮提取类胡萝卜素的方法,所述方法包括在特别高的压力和温度条件下(450至1200巴并且50℃至300℃),在一个柱中,用水预饱和超临界二氧化碳流。
在专利US 4 632 837中,描述了用于从食用香草(例如莳萝、龙蒿叶和含羞草花)的新鲜植物产生浓缩的提取物的方法,所述方法包括在0至40℃的温度下并且在80-200巴的压力下,用超临界CO2进行提取,并且在20至60巴的压力并且0至20℃的温度下,用乙醚或戊烷分离提取物。
专利US 4 466 923描述了通过同时应用从60℃至80℃的温度和从700至1200巴的压力,从豆科植物种子、从谷物胚芽以及从动物的肉,进行脂类的超临界CO2提取。
专利US 5 120 558就其本身而言描述了用于从香料(例如鼠尾草、香子兰、胡椒、芹菜、姜或肉桂)进行提取的方法,采用了超临界CO2的所述方法是在400和600巴之间并且80℃至120℃的温度下,连续用四个提取池进行,并且从香料进行分级分离,从而获得油树脂。
因此,所有这些方法尤其已经被用于高等植物,并且它们中没有一个提示可能将此类方法外推以用于一般而言从微藻、并且特别是从小球藻提取叶黄素。
此外,清晰可见的是,据此这些方法受制于该缺陷,有必要通过实施高的压力和温度操作条件、或通过将其与另一种非极性有机溶剂进行组合来改进超临界流体的溶解能力。
因此,本发明的根本问题是提供用于获得富含由微藻产生的叶黄素的组合物的替代方法。
发明概述
本发明的主题是用于制备富含由微藻更具体地由小球藻科的微藻产生的、甚至更具体地由普通小球藻产生的叶黄素的组合物的方法,其特征在于该方法包括:
1)从微藻生物质制备细胞裂解物,
2)用极性溶剂处理裂解的微藻生物质,以获得包含来自初始生物质的叶黄素和脂类的油树脂,
3)借助处于在超临界压力下的流体的形式的非极性溶剂提取在步骤2)中获得的油树脂,以获得富含非极性脂类(主要由甘油三酸脂组成)的一个部分,以及富含叶黄素的一个不溶部分,并且
4)回收由此得到的富含叶黄素的部分。
在某些实施例中,步骤2)的极性溶剂选自下组,该组由以下各项组成:醇类(例如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、丁醇或异丁醇),酯类(例如乙酸乙酯、乙酸丙酯或乙酸丁酯),以及酮类(例如丙酮、环己酮、甲基乙基酮和甲基异丁基酮),单独或以组合形式采用,并且优选是乙酸乙酯。
在另一个实施例中,根据本发明所述的方法特征在于将在处于在超临界压力下的流体的形式的非极性溶剂置于10和50MPa之间、更优先在25和40MPa之间的压力下,并且置于35℃和90℃之间、并且优先在40℃和70℃之间的温度下。优选地,该非极性溶剂是二氧化碳。
在步骤1)中,通过研磨具有按重量计范围为从10%至15%的干物质含量的小球藻科的微藻的生物质,可以获得细胞裂解物。在进行步骤2)之前,可以将步骤1)中获得的细胞裂解物浓缩至按重量计大于15%、优选按重量计范围为从20%至30%的干物质含量。
在某些实施例中,该方法的步骤2)包括用极性熔剂(优选是乙酸乙酯)提取细胞裂解物的一个步骤,以及从获得的有机相除去该极性溶剂的一个步骤。可以通过在真空下或在减压下蒸发来进行溶剂的除去。
另外本发明的主题是通过根据本发明的方法获得的富含叶黄素的组合物,以及所述富含叶黄素的组合物用于制备药用组合物、食品补充剂或食品的用途。
最后,根据本发明的另外主题是用于制备包含叶黄素的组合物的方法,该组合物选自食品补充剂、食品和药用组合物,所述方法包括:
a)通过进行根据本发明的方法,从微藻生物质中制备富含叶黄素的部分并且
b)从在步骤a)中获得的富含叶黄素的部分获得所述组合物。
附图
图1呈现了在生物质研磨前(深灰色的图)和生物质研磨后(浅灰色图),普通小球藻的总类胡萝卜素(胡萝卜素和叶黄素)的测定。结果被表示为相对于生物质的干重,叶黄素或胡萝卜素的质量百分比。
针对进行该方法的步骤2),测试了不同的提取溶剂。图2示出了针对通过用不同溶剂提取细胞裂解物而获得的叶黄素(浅灰色图)和胡萝卜素(深灰色图)的提取结果。从左至右:乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、己烷和环己酮。产率被表示为叶黄素或胡萝卜素的质量百分比。
图3说明了细胞裂解物的干物质含量对步骤2)中获得的胡萝卜素(深灰色图)和叶黄素(浅灰色图)提取率的影响。从左至右:包含24%干物质的浓缩的小球藻细胞裂解物(小球藻DM:24%)、包含11%干物质的浓缩的小球藻细胞裂解物(小球藻DM:11%)和未经研磨未经裂解的生物质(对照)。
图4示出了在在起始生物质中(浅灰色图)和在获得自这些生物质的油树脂中(深灰色图)的叶黄素的含量(相对于干重的质量%)。从左至右:研磨和离心的小球藻生物质(包含24%干物质(DM)的浓缩的细胞裂解物),非离心的、研磨的小球藻生物质(包含11%干物质的细胞裂解物),非裂解的小球藻生物质(对照)。
发明详细说明
因急于开发用于获得富含由微藻更具体地由小球藻科的微藻产生的、甚至更具体地由普通小球藻产生的叶黄素的组合物的更有效方法,本申请公司已经开发了自主研究并且成功地改编了超临界流体提取技术,以便保证富集叶黄素。
因此,本发明涉及用于制备富含由微藻更具体地由小球藻科的微藻产生的、甚至更具体地由普通小球藻产生的叶黄素的组合物的方法,其特征在于该方法包括以下步骤系列:
1)从微藻生物质制备细胞裂解物,
2)用极性溶剂处理裂解的微藻生物质,以获得包含来自初始生物质的叶黄素和脂类的油树脂,
3)借助非极性溶剂(在这一情况下,是在超临界压力下的流体)提取在步骤2)中获得的油树脂,以获得富含非极性脂类(主要由甘油三酸脂组成)的一个部分、以及富含叶黄素的一个不溶部分,
4)回收由此得到的富含叶黄素的部分。
微生物优先地是属于小球藻科的微藻,甚至更优先地是普通小球藻。
因此,根据本发明的方法的第一步在于制备微藻生物质的细胞裂解物。
已知在封闭的、总体上管状的光生物反应器中(在那里可能以高浓度注射二氧化碳)如何常规地培养小球藻属的微藻并且更具体地为普通小球藻。
在自养条件下的这些培养常规地使得有可能获得约50至80g/l的普通小球藻微藻的一个浓度。
此外,然后通过本领域技术人员已知的任何手段,例如离心,进行生物质的回收和浓缩。
在本发明的背景下,由此收集并且进而浓缩的微藻生物质可以具有10%和15%之间的干物质含量,优选地约11%的干物质含量。
为了提取感兴趣的分子,包括类葫萝卜素,细胞研磨步骤(即制备细胞裂解物的步骤)通常是必要的。
为了在非变性条件下提取感兴趣的分子,优选地是进行细胞研磨,最可行地是在冷条件下、在惰性气氛下并且在黑暗中。
事实上,增加的温度和光能够引发分子的氧化。
因此,在根据本发明的方法的某些实施例中,步骤1包括通过研磨从微藻生物质制备细胞裂解物。优选地,微藻生物质具有关于它的总重量,按重量计范围为从10%至15%的干物质含量。在另一个优选实施例中,该研磨步骤是在冷的条件下、在黑暗中并且在惰性气氛下进行。
如将在以下举例说明的,本申请公司推荐以再循环或通过模式使用珠磨技术。然而,为了增加感兴趣的分子的提取率,可以在浓缩的微藻生物质上考虑研磨,并且可以在溶剂相中进行研磨。
在光学显微镜(放大倍数X40)下监测研磨的有效性,当在显微镜的视野中不再存在任何可见的完整细胞时,裂解就是完全的。
如将在以下举例说明的,这一研磨步骤仅产生了至多10%的总类胡萝卜素的损失。
根据本发明的方法的第二步由以下组成:用极性溶剂处理裂解的微藻生物质,以获得包含来自初始生物质的叶黄素和脂类的油树脂。
术语“极性溶剂”旨在指具有非零偶极矩的任何溶剂。
该极性溶剂选自下组,该组由以下各项组成:甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、丁醇和异丁醇,酯类(例如乙酸乙酯、乙酸丙酯或乙酸丁酯),以及酮类(例如丙酮、环己酮、甲基乙基酮和甲基异丁基酮),单独或以组合形式采用,并且优选是酯,并且甚至更优选是乙酸乙酯。
本上申请公司推荐使用乙酸乙酯作为提取溶剂,因为如将在以下举例说明的,在所有测试的溶剂中,证明它是最有效的并且此外毒性较小。
可以从有机部分除去提取溶剂,优选通过蒸发(例如在真空下或在减压下),借此获得油树脂。
如将在以下举例说明的,通过消耗在根据本发明的方法的以上步骤中制备的包含11%干物质的普通小球藻生物质,用乙酸乙酯的重复提取使得有可能按5至10倍的因子浓缩叶黄素,并且实现约70%的提取率。
因此,在根据本发明的方法的某些实施例中,步骤2包括用极性溶剂优选乙酸乙酯提取细胞裂解物的至少一个步骤,这使得所述提取步骤可能被重复。可以重复该提取步骤,直至相对于步骤1中获得的细胞裂解物中初始存在的叶黄素的重量而言,获得按重量计至少50%、优选至少60%、或甚至至少65%的叶黄素产率。因此,可以重复该提取步骤从2至8次,典型地5次。
在每个提取步骤,极性溶剂/细胞裂解物体积比的范围可以是从1:3至3:1。例如,可以使用约1:1的体积比。
可以合并有机部分(上清液)并且可以通过蒸发(优选在真空下或在压力下)除去极性溶剂,至少部分地除去,由此导致获得油树脂。
任选地,因为水是限制因子,本申请公司还推荐在进行用极性溶剂提取之前,增加浓缩细胞裂解物(例如通过离心)的一个步骤,因为这使得有可能使总体提取率增加至少10%。还可以使用脱水基质考虑该提取。
因此,包含24%干物质的裂解生物质的浓缩使得有可能获得80%的提取率。
因此,在根据本发明的方法的某些实施例中,在进行制备油树脂的步骤2之前,将在步骤1中获得的细胞裂解物进行浓缩,优选浓缩至按重量计大于15%、优选按重量计范围为从20%至30%的干物质含量。典型地,可以将细胞裂解物浓缩至约22%至26%、例如24%的干物质含量。可以通过离心进行这一浓缩步骤。
根据本发明的方法的第三步在于:用非极性溶剂(在这一情况下,是在超临界压力下的流体)提取在步骤2)中获得的油树脂,以获得富含非极性脂类(主要由甘油三酸脂组成)的一个部分、以及富含叶黄素的一个不溶部分。
富含叶黄素的不溶部分,换言之,富含叶黄素的组合物,对应于尚未由在超临界压力下的流体带走的油树脂的部分。
富含非极性脂类(主要由甘油三酸脂组成)的部分,对应于由在超临界压力下的非极性溶剂带走并且因此在使用的温度和压力条件下在所述溶剂中可溶的部分。
该方法的第三步使得能够选择性提取非极性脂类,然后通过蒸发溶剂(将溶剂进行冷凝并回收),将提取物分级分离,并且回收富含非极性脂类(主要由甘油三酸脂组成)的膏状物(通常称为“凝结物”);在除去在这一残余物中残余地存在的在超临界压力下的流体之后,在处于超临界压力下的流体中不溶的残余物富含叶黄素,由此该叶黄素得以高度浓缩并且相对于初始生物质以高产率回收。
已知处于超临界状态(即处于以下这种状态,该状态表征为:在纯物质的情况下,对应地高于临界压力和温度的压力和温度,或在混合物的情况下,位于在图(压力、温度)上表现的临界点的包迹外的代表点(压力、温度))的流体,对于非常多的物质而言,展现出处于压缩气体状态的这一相同流体中观察到的溶解能力与其没法比的高溶解能力;同样的情况适用于“亚临界”液体,即处于以下这种状态的液体,该状态表征为:在纯物质的情况下,大于临界压力的压力和小于临界温度的温度,或在混合物的情况下,大于成分的临界压力的压力和小于这些成分的临界温度的温度。
为了语言上的便利,惯例意味着术语“压缩流体”用于置于显著大于大气压的压力下的任何流体;术语“在超临界压力下的流体”用于置于大于它的临界压力的压力下的流体,即是实际的超临界流体或称为如上定义的“亚临界”的液体;同样,术语“液化气体”用于一种置于小于其临界压力和其临界温度的压力和温度下的液体,其组成为当在大气压下并且在环境温度下时处于气体状态的化合物。
在处于超临界压力下的流体的溶解能力方面的相当多的并且可调节的变化用于很多的提取(固体/流体)、分级分离(液体/流体)、分析色谱法或制备色谱法、处理材料(陶瓷、聚合物、等)的方法中;还在此类溶剂中进行化学反应或生物化学反应。
应注意,二氧化碳的物理化学特性、以及还有它的临界坐标(临界压力:7.4MPa和临界温度:31℃)使得在很多应用中它是优选溶剂,尤其是因为它并不示出任何毒性并且它可非常便宜地大量获得;作为一种非极性溶剂的达到超临界压力的二氧化碳,有时已经向它添加了由将显著改变溶解能力的极性有机溶剂组成的助溶剂,尤其是关于具有某些极性的分子,乙醇通常被用于这一目的。
然而,在超临界压力下,更有利地一些化合物是用具有2和5个碳原子之间、并且更有利地在2和4个碳原子之间的轻烃提取。
如本领域技术人员已知的,采用在超临界压力下的流体进行的提取产生了日益用于很多应用的具有非常高品质的提取物。
使用在超临界压力下的流体的方法的主要优点之一在于可以易于从提取物和固体分离溶剂(流体)。
超临界流体的其他重要优点之一在于它们相对于混合物的成分而言的“可改变的”选择性。这一非常高的选择性与超临界流体的具体特性相关,并且特别是与在超临界压力下的二氧化碳的那些特性相关:可以通过调节流体的压力和温度来精细地调节溶解能力;已经发现,“温和的”条件是最具选择性的,因为溶剂都是选择性越强,它的溶解能力越低。
因此,在根据本发明的方法的某些实施例中,在步骤3),将处于在超临界压力下的流体的形式的非极性溶剂置于10和50MPa之间、更优先在25和40MPa之间的压力下,并且置于35℃和90℃之间、并且优先在40℃和70℃之间的温度下。在其他实施例中,在步骤3)中,处于在超临界压力下的流体的形式的非极性溶剂是二氧化碳。
在进行步骤3)时,本申请公司优选使用纯二氧化碳,而不是已经添加了将增加其溶解能力的助溶剂的二氧化碳,并且选择在10和50MPa之间、更优先在25和40MPa之间的操作压力,以及在35℃和90℃之间、并且优先在40℃和70℃之间的温度。
举例而言,可以使用处于25至30MPa(典型地约28MPa)的压力下并且在40℃至50℃(典型地约45℃)的温度下的CO2进行步骤3)。
因此,本申请公司已经发现,可能从根据本发明的方法的步骤3期间获得的凝结物选择性地提取甘油三酸脂型的非极性脂类,而不提取将由此在非提取的提余液中高度浓缩的叶黄素。
在一个具体实施例中,根据本发明所述的方法包括以下特征中的一个或多个(1、2、3、4、5或6个):
-微藻是小球藻属的,并且更具体地是普通小球藻物种,和/或
-步骤1)包括通过研磨,从具有按重量计范围为从10%至15%、典型地为约11%的干物质含量的微藻生物质制备细胞裂解物,和/或
-将步骤1中获得的细胞裂解物浓缩为具有按重量计大于15%、优选地范围为从20%至30%的干物质含量,和/或
-步骤2)包括用极性溶剂优选乙酸乙酯提取细胞裂解物,并且从获得的一个或多个有机相中除去该极性溶剂的至少一个步骤,以便获得油树脂,和/或
-在步骤2)中,重复提取步骤,直至相对于初始包含在细胞裂解物中的叶黄素的重量而言,获得按重量计至少50%的叶黄素提取率,和/或
-在步骤3)中,用处于超临界压力(优选是在10和50MPa、更优选在25和40MPa之间的压力)下并且在35℃和90℃之间、优选在40℃和70℃之间的温度下的CO2提取步骤2)中获得的油树脂。
不言自明,除了以上提到的那些,根据本发明的方法可以包括例如将步骤4)中获得的富含叶黄素的组合物包装的一个步骤。
另外本发明的主题是通过根据本发明的方法所获得的富含叶黄素的组合物。
根据本发明的一个另外的主题是根据本发明的富含叶黄素的组合物用于制备食品补充剂或药用组合物的用途。根据本发明所述的食品补充剂和药用组合物可以预期用于人类或用于动物。
另外本发明的主题是用于制备包含叶黄素的组合物的方法,该组合物选自食品补充剂和药用组合物,所述方法包括:
a)通过进行根据本发明的方法,从微藻生物质中制备富含叶黄素的部分并且
b)从在步骤a)中获得的富含叶黄素的部分获得所述组合物。
步骤b)一般包括将富含叶黄素的部分与从食品和/或药用观点可接受的一种或多种赋形剂或载体进行混合,以便获得希望的食品补充剂或希望的药用组合物。食品补充剂或药用组合物可以处于粉末、片剂、悬液、糖浆、不然则是口服溶液的形式。
富含叶黄素的部分还可以用于制备旨在用于给人类或动物食用的食品。另外本发明的主题是用于制备食品的方法,所述方法包括:
a)通过进行根据本发明的方法,从微藻生物质中制备富含叶黄素的部分并且
b)从在步骤a)中获得的富含叶黄素的部分获得所述食品。
步骤b)一般包括将富含叶黄素的组合物与一种或多种食品成分进行混合,以及还有多个步骤,例如烹调或冷却步骤。
本发明将通过以下实例更清楚地得以理解,这些实例旨在为说明性的和非限制性的。
实例1:从普通小球藻生物质制备浓缩了叶黄素的油树脂
#步骤1:制备具有11%至12%的干物质含量的普通小球藻生物质
使用光生物反应器中的常规发酵,在发酵结束时易于获得具有约78g/l的微藻浓度的生物质。通过在韦斯伐利亚(Westfalia)型NA7离心机中离心,浓缩所述生物质。由此将生物质浓缩至约120g/l。
#步骤2:细胞研磨
然后使用Netzsch Labstar搅拌器珠磨系统,处理由此培养并且进而根据步骤1的操作条件进行浓缩的微藻生物质。
在再循环模式下,处理6升的步骤1期间回收的包含12%干物质的生物质。
因此,该产物经历反复穿过0.54升研磨室,该室85%填充有直径为600μm的ζ珠型(Netzsch)的瓷珠。按12m/s的圆周速度搅拌这些珠,这使得有可能在2h内研磨几乎所有的微藻细胞。通过显微镜观察监测研磨质量,直至在显微镜视野中没有可见的细胞。
为了限制产物的温度升高,研磨室具有夹套,这使得有可能维持冷的条件。还通过由优莱博(Julabo)F32型低温恒温器供应的处于4℃的冷水的再循环,对研磨进料罐进行冷却。
在图1中呈现了测定在这一细胞研磨步骤期间获得的总类胡萝卜素的结果。图1呈现了在研磨前和研磨后,普通小球藻的总类胡萝卜素(胡萝卜素和叶黄素)的测定(相对于干重的质量%)。细胞研磨产生了合理的10%叶黄素损失和20%胡萝卜素损失。
#步骤3:用溶剂提取
然后用具有不同极性的溶剂,例如酯类(包括乙酸乙酯、乙酸丙酯和乙酸丁酯)、酮类(例如环己酮),以及非极性溶剂(例如己烷),对按照步骤2获得的经研磨的微藻材料进行稀释。以1:1(V生物质/V溶剂)体积比,单独测试每种溶剂。
然后在搅拌下、在黑暗中并且在环境温度下,进行提取,持续一个小时,所有操作都是在聚丙烯管中进行的。
在接触1小时后,通过在贝克曼库尔特爱兰歌娜(BeckmanCoulter Allegra)64R离心机中,在20000g离心15分钟,分离该混合物。在单次提取后,针对每种测试溶剂的上清液,进行类胡萝卜素测定。
在图2中呈现了提取率结果。
图2呈现了针对不同溶剂的总类胡萝卜素(叶黄素和胡罗卜素)提取率:乙酸乙酯(纯度>99.5%),乙酸丙酯(纯度>99.5%),己烷(纯度>95%)和环己烷(纯度>95%)。Y轴:提取百分比。
用乙酸乙酯、乙酸丙酯和环己酮获得了最好的叶黄素提取。在单次提取时进行的这些测试使得能够回收约40%的叶黄素。
与乙酸丙酯相比,环己酮和乙酸乙酯具有针对胡萝卜素的非常好的提取率。
这一筛选还证明,酯的脂肪链越长,叶黄素提取率就越倾向于下降;因此这一结果引向了待使用的溶剂的特征。
虽然乙酸乙酯和环己酮示出了非常类似的提取率,但是乙酸乙酯是优选的,因为这一溶剂正如环己酮一样有效,但是尤其是毒性更小。
#步骤4:浓缩经研磨的细胞材料
通过在贝克曼库尔特(Beckman Coulter)J20XP转子JLA中,以6000g离心3min,对步骤2中获得的经研磨的细胞材料的一部分进行浓缩。
针对3种不同样品进行油树脂的制备:
-经研磨然后通过离心进行浓缩的生物质(24%的干物质),
-经研磨、未浓缩的生物质(11%的干物质),
-未经研磨、未浓缩的对照(11%的干物质)。
#步骤5:油树脂的制备–通过消耗,用乙酸乙酯进行提取
在1升的耐化学产物的聚丙烯烧瓶中,混合1比1体积比的经研磨的生物质和乙酸乙酯(纯度99.8%以上)。
然后在黑暗中,并且在环境温度下,搅拌这一混合物。在1小时的接触后,通过在贝克曼库尔特(Beckman Coulter)J20XP转子JLA中,以12227g离心15分钟,分离该混合物。
在黑暗中,将由此获得的上清液(约0.4升)放在一个烧瓶中备用。对于沉淀物,在此用溶剂进行提取。摄取体积与先前等分的体积一致。
对相同的生物质沉淀物进行这一操作5次。仍在黑暗中,然后将5份上清液合并在被分析的一个部分(F)中。
图3呈现了在通过消耗步骤4中制备的生物质(即经研磨的生物质(具有24%和11%的干物质含量(DM)和未经研磨的生物质)进行提取期间,使用乙酸乙酯针对获得的3个部分的叶黄素和胡萝卜素提取率。
对于包含24%的DM的生物质样品,最好的提取率达到了80%叶黄素回收和90%类胡萝卜素回收。
在一次提取后,已经有40%的叶黄素回收(1,3),但是在5次连续提取后,产率达到了70%。
这一幅图还示出,与针对初始生物质(以11%的DM)相比,针对浓缩的生物质(以24%的DM)的产率要高10%。因此,反应产率受水的存在的限制。
针对未经研磨的对照,叶黄素和胡萝卜素的总的缺失证明了细胞裂解对于感兴趣分子的回收而言的重要性。
#步骤6:油树脂的制备–总类胡萝卜素的浓缩
然后将步骤5中制备的不同部分F转移至与旋转蒸发器(Rotavapor)R-215型的真空下的布奇(Buchi)瑞士旋转蒸发器连接的2升琥珀色圆底烧瓶中。
然后在200毫巴的真空下,并且在50℃下,进行溶剂蒸发,持续2h。
在图4中编辑了获得的不同结果,该图示出,在生物质和油树脂中的叶黄素含量(相对于干重的质量%)。
油树脂最终干物质含量是从65%至80%,并且对于100g的干油树脂而言,叶黄素的量是在2至3g的范围内。
从包含24%DM的浓缩的经研磨的普通小球藻材料提取油树脂使得实现了叶黄素的7倍浓缩。
实例2:用超临界流体对富含叶黄素的油树脂的提取
·步骤1:细胞裂解物的制备
生物质是以根据实例1的条件裂解的普通小球藻的水性悬液的形式存在。在下表1中给出了干物质含量的测量和色素的定量分析。
表1
·步骤2:获得油树脂
在3升烧瓶中,在机械搅拌下,按1050g的生物质(包含1260mg的总类胡萝卜素,其中包括368mg的叶黄素)和500g的乙酸乙酯的比例,将裂解的生物质与乙酸乙酯混合,持续两小时。通过离心轻轻倒出由此获得的混合物,回收上清液,并且使沉淀物经受第二次提取。
在与以上相同的条件下,再次使用500g的乙酸乙酯,进行这一第二次提取。通过离心轻轻倒出由此获得的混合物,回收上清液,并且在与第二次提取相同的条件下使沉淀物经受第三次提取。
如此反复直至已经进行了五次提取操作,并且已经使用了2500g的乙酸乙酯。
将由此收集的上清液合并到一份溶液中,然后在真空下,在旋转蒸发器中蒸发该溶液,导致一方面回收了溶剂,另一方面回收了油树脂。
由此获得的油树脂的质量是11.95g,并且包含550mg的总类胡萝卜素,其中包括310mg的叶黄素。
·步骤3:用超临界流体提取
将在以上步骤期间获得的油树脂放置在由两个烧结金属过滤器封闭的圆柱状篮中,该篮自身放置在一个与用液体CO2填充并且流速是3kg/h的泵连接的加压容器中,然后将由此在28MPa下被压缩的流体加热至45℃,并且将该流体引入包含加载有油树脂的篮的加压容器中。
在已经加载有接触油树脂的溶质后,在维持于45℃的两个回旋分离器中,离开加压容器的流体的压力下降至5MPa:在分离器中分离并且回收溶质,并且将CO2排放至大气中。
在两小时的提取后,将加压容器减压并且打开,并且回收该篮。包含在该篮中的残余物是干粉形式,该干粉具有1.75g的质量,包含218mg的叶黄素,即相对于残余物的总重量,具有12%的叶黄素的质量含量。
Claims (10)
1.一种用于制备富含由微藻更具体地是小球藻科的微藻产生的、甚至更具体地是由普通小球藻产生的叶黄素的组合物的方法,其特征在于该方法包括:
1)从微藻生物质制备一种细胞裂解物,
2)用一种极性溶剂处理裂解的微藻生物质,以获得包含来自初始生物质的叶黄素和脂类的一种油树脂,
3)借助处于在超临界压力下的流体的形式的一种非极性溶剂提取在步骤2)中获得的油树脂,以获得富含主要由甘油三酸脂组成的非极性脂类的一个部分、以及富含叶黄素的一个不溶部分,并且
4)回收由此得到的富含叶黄素的部分。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于步骤2)的该极性溶剂选自下组,该组由以下各项组成:甲醇、乙醇、正丙醇和异丙醇、丁醇和异丁醇,酯类,例如乙酸乙酯、乙酸丙酯或乙酸丁酯,以及酮类,例如丙酮、环己酮、甲基乙基酮和甲基异丁基酮,单独或以组合形式采用,并且优选是乙酸乙酯。
3.如权利要求1和2中任一项所述的方法,其特征在于,将这种处于在超临界压力下的流体的形式的非极性溶剂置于10和50MPa之间、更优先在25和40MPa之间的压力下,并且置于35℃和90℃之间、并且优先在40℃和70℃之间的温度下。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法,其特征在于,这种处于在超临界压力下的流体的形式的非极性溶剂是二氧化碳。
5.如以上权利要求中任一项所述的方法,其特征在于,在步骤1中,该细胞裂解物是通过研磨具有按重量计范围为从10%至15%的干物质含量的小球藻科微藻的生物质获得的。
6.如以上权利要求中任一项所述的方法,其中在进行步骤2)之前,将在步骤1)中获得的细胞裂解物浓缩至按重量计大于15%、优选按重量计范围为从20%至30%的干物质含量。
7.如以上权利要求中任一项所述的方法,其中步骤2)包括用一种极性溶剂优选乙酸乙酯提取该细胞裂解物,并且从获得的有机相中除去该极性溶剂中的至少一个步骤。
8.一种通过如权利要求1至7中任一项所述的方法获得的富含叶黄素的组合物。
9.如权利要求8所述的富含叶黄素的组合物用于制备一种药用组合物、一种食品补充剂或一种食品的用途。
10.一种用于制备包含叶黄素的组合物的方法,该组合物选自一种食品补充剂、一种食品和一种药用组合物,所述方法包括:
a)通过进行如权利要求1至7中任一项所述的方法,从一种微藻生物质制备一个富含叶黄素的部分并且
b)从在步骤a)中获得的这个富含叶黄素的部分获得所述组合物。
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