CN104634802B - 一种用于测量从活的生物细胞跨细胞膜转运被分析物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于测量从活的生物细胞跨细胞膜转运被分析物的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供一种或多种表达多个离子通道的活的生物细胞，所述细胞载有被分析物；b)从所述细胞穿过离子通道卸载至少部分所述被分析物；c)使用x‑射线荧光测量所述被分析物，其中所述x‑射线荧光测量使用了装配有微聚集X‑射线管的能量色散x‑射线荧光分光仪。

Description

一种用于测量从活的生物细胞跨细胞膜转运被分析物的方法
本申请为国际申请日2009年7月1日、国际申请号 PCT/US2009/049444于2011年1月4日进入中国国家阶段、申请号 200980125952.3、发明名称“用于测量被分析物跨屏障转运的方法和装置”的分案申请。
相关申请/要求优先权
本申请涉及并要求2008年7月1日提交的名称为用于测量化学物质跨细胞膜转运的免标记测定法的临时申请No.US61/133,697；以及 2009年2月20日提交的名称为用于测量跨膜转运的方法和装置的临时申请No.US61/208,115的优先权；并且这些临时申请并入本文作为参考。
政府的权利
本发明根据美国国立卫生研究院授予的合同号1R43GM080781-01 在美国政府的支持下进行。美国政府享有本发明的某些权利。
技术领域
本发明涉及用于测量跨膜转运率的方法和装置。
背景技术
对潜在重要药物的鉴定常常需要测量这些药物对离子跨膜转运的影响。例如，一些药物所产生的危及生命的毒性与心脏复极化延迟或与离子的迁移有关的QT间期延长有关。例如，近来有数种药物退市的原因就是其对细胞膜转运系统有影响。
离子通道是无所不在的允许离子跨细胞膜转运的成孔蛋白。离子通道促进特定离子种类(例如，Na+，K+，Ca2+，Cl-)在细胞小室之间和/或跨过具有不同离子选择性的外部细胞膜的迁移。离子通道为动态结构，其对外界因素，如电压梯度，配体和机械力产生应答。制药工业开发出了改变离子通道功能的治疗法。例子包括抗癫痫剂，如钠离子通道阻滞剂卡马西平，抗高血压剂二氢吡啶类钙通道阻滞剂(络活喜)和用于糖尿病的磺脲类钾通道开放剂(亚莫利)。近来，离子通道靶向药物的总年销售额为200亿美元。
对于药物开发，离子通道是较难的分子靶点。困难缘于适宜高通量筛选分析形式的缺乏，离子通道生物物理学的复杂性，以及药物的潜在结合位点和结合模式的范围。
对用于测量离子的跨膜转运率的更简单方法的需求仍然存在。
因此，本发明的目的在于提供用于测量离子的跨膜转运率的方法和装置。
本发明的其它目的，优点和新特征一部分将在下面的描述中提及，一部分对本领域技术人员而言可以通过研究下文而变得显而易见，或者通过本发明的实施来获悉。本发明的目的和优点可以通过权利要求书中特别指出的仪器和组合物来了解和获得。
附图简述
合并入并形成说明书的一部分的附图说明了本发明的实施方案，并与描述一起起到解释本发明的原则的作用。在图中：
图1显示了本发明的方法的流程图；
图2显示了本发明的方法的另一流程图；
图3显示了本发明的装置的示意图；
图4显示了本发明的装置的另一示意图；
图5显示了水中x射线的1/e衰减深度计算值的曲线
图6显示了一组铷流出率数据。
图7显示了铷流出率对抑制剂浓度的曲线。
图8显示了本发明的装置的示意图。
图9显示了本发明的装置的示意图。
图10显示了本发明的装置的示意图。
发明内容
简而言之，本发明包括用于测量从细胞转运被分析物的方法。该方法包括提供一种或多种载有被分析物的细胞的步骤。然后从细胞上卸载至少部分被分析物。随后用x射线荧光测量被分析物。
本发明还包括用于测量向细胞内转运被分析物的方法。该方法包括提供一种或多种细胞；增加细胞内被分析物的量；以及用x射线荧光测量被分析物的步骤。
本发明还包括用于测量化学物质跨细胞屏障转运的装置。该装置包括有入口，出口和用于在交换腔室中的溶液期间保留细胞的机构的腔室。该腔室还有至少一个半透过X-射线的位置。该装置还包括定向至通过腔室中的半透过X-射线位置对细胞进行分析的X-射线荧光分光仪。
具体实施方式
简而言之，本发明涉及用x射线荧光(XRF)测量化学物质跨膜转运的有效率。
本发明的方法的实施方案显示在图1中。该实施方案包括提供载有被分析物的细胞的步骤。然后将细胞暴露于导致其卸载被分析物的条件下。用x射线荧光测量被分析物。优选地，被卸载的被分析物从一个体积中基本上去除，所述体积由入射到细胞上的x射线荧光激发光束的面积，以及被分析物在水中的至少一种特征性信号的1/e深度的5倍的深度来确定。
本发明的方法的另一实施方案显示在图2中。该实施方案包括提供细胞，然后装载被分析物，以及用x射线荧光测量被分析物的步骤。优选地，在细胞负载之前，在一个体积中，被分析物基本上被耗尽，所述体积由入射到细胞上的x射线荧光激发光束的面积，以及被分析物在水中的至少一种特征性信号的1/e深度的5倍的深度来确定。
在本发明的方法的两种实施方案中，相似组分和步骤的特性是相同的。
细胞优选为活的优选表达离子通道的生物细胞。应该理解的是，细胞可以是组织的一部分；或者，术语细胞可以指有膜的亚细胞组分，如线粒体；或其它提供有限的被分析物转运的亚细胞组分，如内质网，或微胞(micelle)等。更优选的是，细胞过量表达离子通道。通常，细胞应基本上被物理屏障，如膜或壁限定，所述物理屏障封闭了大量物质，如被分析物，水，蛋白质，DNA和其它生物化学物质。物理屏障具有的特性为暴露于不同刺激物时，其可以使被分析物以不同速率通过。例如，物理屏障可以是包括离子通道或其它膜蛋白的细胞膜，其中离子通道在抑制剂或激活剂存在下使离子以不同速率通过。优选细胞是粘附性的。与本发明相容的细胞系的例子有可获自法国CreaCell, Biopolis,5,avenue duGrand Sablon,38700La Tranche的hERG CHO-Kl细胞系。
被分析物优选包括原子序数大于10的化学元素，更优选选自锌，镉，铊，钠，钾，铷，铯，镁，钙，钡，锶，氯，溴和碘的化学元素。更优选的是，被分析物包括具有至少一种能量为2.5KeV或2.5KeV以上的特征性x射线荧光发射信号的化学元素。细胞优选掺入一定量的被分析物，以使一定体积内的细胞群含有至少10pg被分析物，所述体积由入射到样品上的来自x射线荧光仪器的x射线激发光束的面积，以及水衰减时被分析物的至少一种特征性x射线信号的1/e衰减深度的 5倍的深度来确定；1KeV至20KeV间的x射线能量的1/e深度见图5。更优选细胞包括，掺入或内化一定量的被分析物，以使一定体积内的细胞群含有10nmol至5mol浓度的被分析物，所述体积由入射到样品上的来自x射线荧光仪器的x射线激发光束的面积，以及1/e衰减深度的5倍的深度来确定。
细胞优选为固定化的；本文中的固定化的含义是，数量等于x射线荧光测量开始时位于x射线荧光激发光束的光路中的细胞的至少1％的细胞在x射线荧光激发光束的光路中保留的时间大于x射线荧光测量的测量时间。更优选的是，本文中的固定化的含义是，数量等于x 射线荧光测量开始时位于x射线荧光激发光束的光路中的细胞的至少 1％的细胞在x射线荧光激发光束的光路中保留至少10s。
将细胞固定化的方法的例子包括以下方法：细胞可以通过保留细胞并允许第一溶液和第二溶液通过的滤器来固定。优选细胞通过附着于固体支持物来固定，所述固体支持物如泡沫，片材，薄膜，膜，支架，凝胶，粘附因子，粘附细胞系，组织，差异扩散速率(differential diffusion rates)，流体力(fluidic forces)，或分化细胞或其它细胞可以附着的表面。细胞可以是粘附性的，或者是组织或其它分化细胞团的一部分。如果使用泡沫，优选开孔泡沫，最优选部分网状开孔泡沫。
被分析物可以方便地通过除去支持细胞的任何溶液，并加入第二溶液来卸载。第二溶液可以在除去第一溶液后加入，例如，倒出第一溶液或从第一溶液中滤出细胞，然后加入第二溶液。或者可以将第二溶液加入到第一溶液中，以使第二溶液替换第一溶液。第二溶液是方便添加一种或多种刺激物以释放被分析物的方法。刺激物优选包括至少一种选自以下目录的物质：诱导被分析物穿过物理屏障的化学物质，抑制被分析物穿过物理屏障的化学物质，其中被分析物基本上被耗尽的溶剂，诱导离子通道活性的化学物质，以及抑制离子通道活性的化学物质；这种离子通道活性的抑制可以是直接的，例如，抑制剂与离子通道结合；或者是间接的，例如，化学物质通过与辅助蛋白或辅因子等结合来抑制离子通道活性；抑制的机制对本发明实现功能而言并不重要。第一溶液可以方便地通过用第二溶液替换或稀释第一溶液来去除。第一溶液也可以通过引流，倾泻，或以其它方式物理移动大部分的第一溶液，同时用或不用第二溶液替换它的方法去除。如果细胞暴露于第二溶液，第二溶液优选具有与第一溶液不同的组成。第二溶液优选包括一种或多种以下化学物质：替换被分析物的化学物质，如用钾离子替换铷离子；诱导通道活性的化学物质，如高浓度的钾；和改变离子通道活性的化学物质，如阿司咪唑，西沙必利，或特非那定。组成的差异的例子可以是一种或多种溶质的本体或浓度，或溶剂，包括溶剂混合物的本体。优选第一溶液与第二溶液之间的差异在于第二溶液中的被分析物基本上被耗尽。在本文中，“基本上被耗尽”的意思是，当细胞首先被置于第二溶液中时，第二溶液中被分析物的浓度小于细胞中被分析物浓度的至少10倍。更优选的是，“基本上被耗尽”表示当细胞首先被置于第二溶液中时，第二溶液中被分析物的浓度小于细胞中被分析物浓度的至少100倍。
细胞通过x射线荧光进行分析。可以与本发明一起方便使用的x 射线荧光分光仪的例子有装配了微聚焦X-射线管，多毛细管x射线聚焦光学镜，锂漂移硅固体检测器，处理用电子器件，和供应商提供的操作软件的EDAX Eagle XPL能量色散X-射线荧光分光仪；以及配有准X-射线管和Si(Li)检测器，处理用电子器件，和供应商提供的操作软件的KevexOmicron model 952-102。X-射线荧光分光仪优选包括可移动台，更优选可以在至少两个维度移动的台，最优选可以在至少三个维度移动的台。优选x-射线源发射多色x-射线，或者，x射线管的测量光谱或由碳氢化合物样品散射的x-射线的测量光谱所包括的x-射线具有至少两种不同的相差至少0.5KeV的能量。
被分析物优选在其与细胞位于相同位置时进行测量，因为这样可以允许实时或近实时测量，并且容易分析被分析物的流出量测定值，但是，被分析物也可以在细胞溶解后，被分析物从细胞卸载后测量，或者还可以测量细胞中负载的被分析物与细胞暴露于其的被分析物的量之间的差异。通过例如溶解细胞或干燥细胞来去除或减少基质可以得到优越的测量限度。
本发明的方法的实施方案可以很容易地组合应用。
在一段时间内或使用不同的第一溶液或第二溶液，可以获得多个测量值。这允许计算动力学参数和抑制常数，如IC50。
本发明的装置的实施方案显示在图3中。装置2包括定向于分析腔室6中的细胞12的X-射线荧光分光仪4。腔室6包括入口8和出口 10。腔室6还包括用于保留细胞12的滤器或细胞可以附着于其上的表面或其它用来保留细胞12的机构；如果使用泡沫，泡沫优选为开孔泡沫或部分网状泡沫；优选用于保留细胞12的机构足以在交换基本上围绕细胞12的溶液时保留细胞12。用于保留细胞12的机构优选为一个或多个粘附细胞可以附着的表面。腔室6的至少一部分必须半透过或透过x射线。腔室6可以是独立的单元，或者是保留细胞的管道的一部分。
细胞12应具有物理屏障，如膜或壁，其基本上封闭了大量材料，如被分析物，水，蛋白质，DNA和其它生物化学物质。该物理屏障具有当其暴露于不同刺激物时使被分析物以不同速率通过的特性。例如，物理屏障可以是具有多个离子通道的细胞膜，其中多个离子通道在抑制剂或激活剂存在下使离子以不同速率通过。优选细胞为粘附性的。
X-射线荧光分光仪4包括x-射线激发源和x-射线检测器。可以与本发明一起使用的x-射线荧光分光仪的例子有装配了微聚焦X-射线管，多毛细管x-射线聚焦光学镜，锂漂移硅固体检测器，处理用电子器件，和供应商提供的操作软件的EDAX Eagle XPL能量色散X-射线荧光分光仪；以及配有校准的X-射线管和Si(Li)检测器，处理用电子器件，和供应商提供的操作软件的Kevex Omicron model 952-102。x- 射线荧光分光仪优选包括可移动台，更优选可以在至少两个维度移动的台，最优选可以在至少三个维度移动的台。优选x射线源发射多色 x-射线，或者，x射线管的测量光谱或由碳氢化合物样品散射的x-射线的测量光谱包括的x-射线具有至少两种不同的相差至少0.5KeV的能量。
腔室6的半透过或透过x射线的部分具有这样的特性，即半透过 x射线的位置使被分析物位于半透过x-射线位置1微米内的部分所发射的，与半透过x射线位置垂直，并且入射到半透过x射线位置上的最高能量x-射线荧光信号的至少0.1％通过。
腔室6优选不过滤被分析物，更优选不包括被分析物，最优选不包括与使用x射线荧光测量的被分析物的成分相同的成分。腔室6优选为生物相容性的，以使腔室6与第一溶液或第二溶液接触的表面对细胞无毒性；在本文中，对细胞无毒性的意思是，腔室6的表面在30min 内不杀死大于50％的细胞。腔室6还任选地允许细胞附着于其至少一个内表面上；该内表面可以是腔室6内的泡沫。
用于保留细胞12的机构可以是滤器(即，保留细胞但允许溶液通过的构件)或细胞可以附着的表面。滤器的例子有再生纤维素滤器。优选地，用于保留细胞12的机构为粘附性细胞可以附着的表面。如果使用细胞可以附着的表面；表面的例子有聚苯乙烯，聚碳酸酯，和聚氨酯；表面的例子有片材，薄膜泡沫，和其它形状。表面任选地用化学物质处理，以促进细胞附着，例如，用I型胶原或多聚-L-赖氨酸或蚀刻处理。用于保留细胞12的机构优选这样布置，以使一定体积内的细胞12含有至少10pg被分析物，所述体积由入射到样品上的来自x- 射线荧光仪器的x-射线激发光束的面积，以及水衰减时被分析物的至少一种特征性x-射线信号的1/e衰减深度的5倍的深度来确定；1KeV 至20KeV的x-射线能量的1/e深度在图5中显示。更优选用于保留细胞12的机构这样布置，以使一定体积内的细胞12含有10nmol至5mol 浓度的被分析物，所述体积由入射到样品上的来自x-射线荧光仪器的 x-射线激发光束的面积，以及水衰减的被分析物的至少一种特征性x 射线信号的1/e衰减深度的5倍的深度来确定。
任选并且优选地，装置2进一步包括流控制器，以改变进入腔室的溶液。该流控制器可以包括能提供具有梯度浓度的不同溶质或溶剂的溶液的泵。
本发明的装置的实施方案可以很容易地组合应用，例如，在单个塑料块中蚀刻或雕刻多个拷贝的装置2，或将多个独立装置2连在一起。
本发明的装置的另一实施方案显示在图4中。装置102包括所布置的用于分析腔室106中的细胞的X-射线荧光分光仪104；尽管显示 X-射线荧光分光仪104通过腔室106的开口测量细胞，但应该了解的是，X-射线荧光分光仪104可以布置在任何允许其测量细胞的方向上，例如，如果腔室106的底面可半透过x射线，通过该表面测量细胞是可以接受的。腔室106还任选地包括用来保留细胞112的滤器和/或细胞可以附着于其上的表面，图示为细胞保留器114。细胞保留器114可以是泡沫，结构化表面，凝胶，组织样品，或其它用于保留细胞112 的机构。或者，可以使细胞沉降，例如，使用重力或离心或通过滤器减压，或其它将细胞从溶液分离的机构。腔室106的至少一部分必须半透过或透过x射线；腔室106的这种半透过或透过部分可以是腔室 106中的开口。腔室106可以是独立的单元，或者是含有多个拷贝的腔室106的多重单元的一部分。
腔室106和x-射线激发光束以及x射线检测器的定位必须允许细胞群的至少一部分占据由x射线激发光路与x射线检测器的可视容积的交集所确定的体积。优选腔室106和x射线激发光束以及x射线检测器的方向必须允许包括至少100pg被分析物的细胞群的至少一部分占据由x射线激发光路与x射线检测器的可视体积的交集所确定的体积。更优选腔室106和x射线激发光束以及x射线检测器的定向必须允许包括至少100pg被分析物的细胞群的至少一部分占据由x射线激发光路与x射线检测器的可视体积的交集所确定的体积，并且细胞与 x-射线荧光检测器之间的任何屏障使位于屏障的5μm内的被分析物发射的垂直于屏障的最高能量x-射线荧光信号的部分衰减小于约99.9％，或允许来自被分析物的最高能量x-射线荧光信号的至少0.1％通过。
X-射线荧光分光仪104包括x-射线激发源和x-射线检测器。可以与本发明一起使用的x-射线荧光分光仪的例子有装配了微聚焦X-射线管，多毛细管x-射线聚焦光学镜，锂漂移硅固体检测器，处理用电子器件，和供应商提供的操作软件的EDAX Eagle XPL能量色散X-射线荧光分光仪；以及配有校准的X-射线管和Si(Li)检测器，处理用电子器件，和供应商提供的操作软件的Kevex Omicron model 952-102。x- 射线荧光分光仪优选包括可移动台，更优选可以在至少两个维度移动的台，最优选可以在至少三个维度移动的台。优选x-射线源发射多色 x-射线，或者，x射线管的测量光谱或由碳氢化合物样品散射的x-射线的测量光谱所包括的x-射线具有至少两种不同的相差至少0.5KeV的能量。
本发明的装置的实施方案可以很容易地组合应用，例如，在单个塑料块中蚀刻或雕刻多个拷贝的装置102，或将多个独立装置102连在一起。
实施例1
将获自法国CreaCell,Biopolis 5,Avenue du Grand Sablon,38700 La Tronche的表达Human-ether-a-go-go的中国仓鼠卵巢细胞(hERG CHO-K1)置于T150培养瓶中，在37℃，5％二氧化碳的条件下于生长培养基中培养，生长培养基由F-12营养混合物(HAM，获自Invitrogen，目录编号21765-029)，10％胎牛血清(FBS)，抗生素-抗真菌剂(10,000 单位青霉素，10,000ug链霉素，25ug两性霉素B/mL，获自Invitrogen，目录编号15240-062)和1.2mg/ml遗传霉素(获自Invitrogen，目录编号10131-027)组成。当细胞达到约80％铺满时，将细胞用胰蛋白酶消化(使用胰蛋白酶-EDTA)并计数(采用血细胞计数器)。将细胞以0.1×106细胞/300μl生长培养基的浓度重悬浮于生长培养基中。转移300 μl细胞悬液至聚氨酯泡沫(PUF)(30ppi，部分网状化，得自 McMaster-Carr，目录编号86225K11，切割成直径为1/4英寸的圆盘)，每cm2PUF事先在48孔板中经10μg来自牛皮的1型胶原(获自Sigma，目录编号C8919)预处理。将各个PUF置于37℃，5％二氧化碳的条件下孵育约24h，这时，将其转移至60mm直径的培养皿中，并用生长培养基覆盖，并在37℃，5％二氧化碳的条件下孵育至约80％铺满。然后每个PUF用Rb-/K-缓冲液冲洗3次，所述Rb-/K-缓冲液由经0.22um 滤膜滤过的，含有155.4mM氯化钠，2mM氯化钙，0.8mM磷酸二氢钠，1mM氯化镁，5mM葡萄糖和25mMHEPES缓冲液的pH 7.4的缓冲水溶液组成。
PUF通过在37℃，5％二氧化碳的条件下于8mL Rb+加样缓冲液中孵育3h来装载Rb离子，Rb+加样缓冲液由经0.22um滤膜过滤的，含有5.4mM氯化铷，150mM氯化钠，2mM氯化钙，0.8mM磷酸二氢钠，1mM氯化镁，5mM葡萄糖和25mM HEPES缓冲液的pH 7.4 的缓冲水溶液组成。如图6所示，通过在37℃，5％二氧化碳的条件下于不同浓度的特非那定的二甲亚砜(DMSO)溶液中孵育30min，用通道抑制剂处理PUF。然后各个PUF用Rb-/K-缓冲液冲洗3次，所述Rb-/K-缓冲液由经0.22um滤膜滤过的，含有155.4mM氯化钠，2mM 氯化钙，0.8mM磷酸二氢钠，1mM氯化镁，5mM葡萄糖和25mM HEPES缓冲液的pH 7.4的缓冲水溶液组成。
然后将3个独立的PUF倒置，层叠于图8所示装置202中。图8 显示的装置202包括腔室206，允许液体进入腔室206的入口208，以及允许液体流出腔室206的出口210。负载细胞的泡沫204包括3组如上文所述负载了铷的CHO-K1细胞的泡沫PUF。将负载细胞的泡沫204置于腔室206中。用Ultralene片(半透过X-射线的窗212)和o-形环 (扣环214)封闭腔室206。图8未显示x-射线荧光分光仪或流控制系统。图9显示了装置202除负载细胞的泡沫204，半透过x射线的窗 212和扣环214外的示意图。图10显示了包括装置202的装置302的示意图。装置302包括X-射线管302和X-射线检测器304，其布置成分析装置202中的细胞。装置302还显示了入口流控元件，包括将入口管308与装置202连接的入口连接件306，和将液体从入口贮液器 312经入口管308泵至装置202的泵310。装置302还包括出口流控元件，包括将装置202与出口管316连接的出口连接件314。出口管316 允许液体排出装置202，并到达出口贮液器318。
然后将入口管路用50mM K流动缓冲液(Flow Buffer)清洗，K 流动缓冲液由经0.22um滤膜滤过的，含有50mM氯化钾，150mM氯化钠，2mM氯化钙，0.8mM磷酸二氢钠，1mM氯化镁，5mM葡萄糖和25mM HEPES缓冲液的pH 7.4的缓冲水溶液组成。入口管路然后与流动设备入口相连。用装配有于25kV，0.1mA运行的Rh x射线管，锂漂移硅探测器，1mm准直仪的x-射线荧光分光仪读取静态x-射线荧光；之后，开启流动缓冲液泵。接着在流动条件下读取一段时间的x- 射线荧光。然后将不同抑制剂浓度的整组流动数据进行汇编，并如图6 所示作图。拟合图6所示各组流出量数据，得到铷流出率。然后如图7 所示，用描述铷信号损耗的流出率对所添加的特非那定的浓度作图，得到IC50。
实施方案的选择和描述是为了最好地解释本发明的原则及其实际应用，从而使本领域其它技术人员能够在各种各样的实施方案中，以及作出适用于预期的特定用途的各种修改的情况下最佳地利用本发明。本发明的范围由权利要求书限定。

Claims (13)

1.用于测量从活的生物细胞跨细胞膜转运被分析物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供一种或多种表达多个离子通道的活的生物细胞，所述细胞载有被分析物；
b)从所述细胞跨离子通道卸载至少部分所述被分析物；
c)使用x-射线荧光测量所述被分析物，其中所述x-射线荧光测量使用了装配有微聚集X-射线管的能量色散x-射线荧光分光仪；以及
d)重复步骤b)和c)，以便在一段时间内获得多个测量值。
2.如权利要求1所述的用于测量从活的生物细胞跨细胞膜转运被分析物的方法，其中测量x-射线荧光包括使用多色x-射线束激发被分析物，以及使用x-射线检测器测量x-射线荧光。
3.如权利要求1所述的用于测量从活的生物细胞跨细胞膜转运被分析物的方法，其中被卸载的被分析物从一个体积中去除，所述体积由入射到细胞上的x-射线荧光激发光束的面积，以及被分析物在水中的至少一种特征性信号的1/e衰减深度的5倍的深度来确定。
4.如权利要求1所述的用于测量从活的生物细胞跨细胞膜转运被分析物的方法，还包括在测量x-射线荧光前减少基质。
5.如权利要求1所述的用于测量从活的生物细胞跨细胞膜转运被分析物的方法，其中在使细胞装载被分析物之前，在一个体积中，被分析物被耗尽，所述体积由入射到细胞上的x-射线荧光激发光束的面积，以及被分析物在水中的至少一种特征性信号的1/e衰减深度的5倍的深度来确定。
6.如权利要求1所述的用于测量从活的生物细胞跨细胞膜转运被分析物的方法，其中被分析物包括选自锌，镉，铊，钠，钾，铷，铯，镁，钙，钡，锶，氯，溴和碘的化学元素。
7.如权利要求1所述的用于测量从活的生物细胞跨细胞膜转运被分析物的方法，其中细胞被保留在腔室中，其中所述腔室的至少一部分半透过或透过x-射线。
8.如权利要求7所述的用于测量从活的生物细胞跨细胞膜转运被分析物的方法，其中所述腔室半透过x-射线的部分使被分析物位于半透过x-射线位置1微米内的部分所发射的，与半透过x-射线位置垂直，并且入射到半透过x-射线位置上的最高能量x-射线荧光信号的至少0.1％通过。
9.如权利要求1所述的用于测量从活的生物细胞跨细胞膜转运被分析物的方法，其中细胞为固定化的，以使得数量等于x-射线荧光测量开始时位于x-射线荧光激发光束的光路中的细胞的至少1％的细胞在x-射线荧光激发光束的光路中保留的时间大于x-射线荧光测量的测量时间。
10.如权利要求1所述的用于测量从活的生物细胞跨细胞膜转运被分析物的方法，其中细胞为固定化的，以使得数量等于x-射线荧光测量开始时位于x-射线荧光激发光束的光路中的细胞的至少1％的细胞在x-射线荧光激发光束的光路中保留至少10s。
11.如权利要求2所述的用于测量从活的生物细胞跨细胞膜转运被分析物的方法，还包括腔室，其中所述腔室和x-射线激发光束以及x-射线检测器的定位允许细胞群的至少一部分占据由x-射线激发光路与x-射线检测器的可视容积的交集所确定的体积。
12.如权利要求11所述的用于测量从活的生物细胞跨细胞膜转运被分析物的方法，其中占据由x-射线激发光路与x-射线检测器的可视容积的交集所确定的体积的细胞群的所述至少一部分包括至少100pg被分析物。
13.如权利要求12所述的用于测量从活的生物细胞跨细胞膜转运被分析物的方法，其中细胞与x-射线荧光检测器之间的任何屏障使位于屏障的5μm内的被分析物发射的垂直于屏障的最高能量x-射线荧光信号的部分衰减小于99.9％，或允许来自被分析物的最高能量x-射线荧光信号的至少0.1％通过。
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