CN104630326A - 断肠草鉴别的引物及pcr方法 - Google Patents

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袁媛
李旻辉
崔占虎
蒋超
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Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，涉及中药及中药材鉴定领域，特别涉及一种能够特异鉴定断肠草的PCR扩增方法及其特异引物。使用此方法鉴别断肠草与金银花，只通过简单的DNA提取、PCR特异性扩增、电泳检测即可完成对样品的鉴别。具有操作简单、特异性强、重复性好等优点。主要用于断肠草与金银花之间的快速鉴定。

Description

断肠草鉴别的引物及PCR方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及中药及中药材鉴定领域，特别涉及一种能够特异鉴定断肠草的PCR扩增方法及其特异引物。 
背景技术
断肠草为马前科植物钩吻Gelsemium elegans(Gardn.el Champ)Benth.的茎藤。又名胡蔓藤、野葛、水莽草、大茶叶、烂肠草，是一种剧毒草药。有祛风攻毒、消肿、止痛之功效。可治湿疹、痈肿、风湿痹痛等。 
近年来由于误服断肠草而中毒的事故在各地不断发生，对其也进行了许多研究，证实断肠草的根、茎、叶子的主要成分为钩吻素子、钩吻素寅、钩吻素卯等。调查发现误将断肠草为金银花煮水当凉茶喝而中毒的事件时有发生，在断肠草中毒的78例临床事件中，发现43例为因误将断肠草为金银花煮水当凉茶喝而中毒，18例为将断肠草根为其他草药煮水喝而中毒(李文升.急性断肠草中毒78例临床分析，医学信息，2011，24(9)：5872)。因此，建立一种用于鉴别钩吻和金银花的方法非常重要。 
黄伟雄等采用色谱的方法通过分析钩吻碱成分对断肠草中进行鉴定(黄伟雄，李汴生，范山湖，等.应用TLC法鉴定断肠草中钩吻碱，华南预防医学，2008，34(1)：60)，但这种方法比较繁琐，不利于推广。近年来发展的以分子生物学为基础的检测方法如DNA barcoding和位点特异性PCR等克服了药材传统鉴别方法准确度不高、主观性大等缺点。对断肠草与金银花之间的分子鉴别还尚未见报道，本发明通过特异性PCR的方法实现了断肠草与金银花的快速、准确鉴别。在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中所提及的PCR方法及引物。 
发明内容
本发明的目的是提供一种断肠草的PCR引物及其鉴定方法，该PCR鉴定方法操作简单、样品量少，能快速、准确的将断肠草从其易混淆的金银花样品中鉴定出来，为断肠草鉴定提供了一种实用的技术。 
1、一种鉴定断肠草的特异引物F1、F2，其序列为： 
F1：5’-TCTCCGCCCTCTGCTCTA-3’， 
F2：5’-GGAAGAAAGGAGTTTTTATGAGG-3’。 
2、一种断肠草的PCR鉴定方法，其特征在于，包括下列步骤： 
a)从所述材料中提取到DNA样品； 
b)用权利要求1所述的引物进行PCR反应，扩增反应体系包括：10×buffer缓冲液2μL，dNTP1.6μL，引物各0.5μL，EX Tap酶0.2μL，DNA0.5μL，灭菌蒸馏水14.7μL。反应条件：解链温度95℃，时间5min，退火温度57℃，时间30s，复性温度72℃，时间为1min40s，35个循环后72℃延伸，时间为7min； 
c)电泳所述扩增产物，如果存在分子量约为300bp的单一条带，则确定所检材料为断肠草。 
附图说明
图1：断肠草、金银花、山银花及水银花PCR鉴别结果 
1.断肠草(广西)；2.断肠草(贵州、安徽药市)；3.空白对照；4.金银花(河南)；5.金银花(广西)；6.金银花(江苏)；7.金银花(北京)；8.山银花(广西)；9.山银花(云南)；10.山银花(贵州)；11.水银花(贵州)；M.DNA分子量标准：从上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp 
具体实施方式
1材料 
所用材料如表1所示，包括： 
表1样品来源表 
2鉴别引物设计 
选择通用引物psbA-trnH(t rnH：5’-CGC GCA TGG TGG ATT CAC AAT CC-3’psbA：5’-GTT ATG CAT GAA CGT AAT GCT C-3’)对断肠草样品进行扩增，搜索Genbank中金银花的psbA-trnH序列(Genbank登录号：GU1353313.1；JN045253.1)，然后进行同源比对，根据其变异区设计一对特异引物F1、F2，序列为下： 
F1：5'-TCTCCGCCCTCTGCTCTA-3’，F2：5’-GGAAGAAAGGAGTTTTTATGAGG-3’。 
3DNA提取 
选取无霉变的干燥药材约0.03g，置于粉碎机中研磨粉碎，过40目筛。将粉末转移到2.0mL的微量离心管中，加入900μL已灭菌的CTAB提取液(2％CTAB，100mmol/L Tris-HCl pH=8.0，20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl)、0.02g PVP40000、10μL β-巯基乙醇充分振荡混匀，65℃水浴1.5h-2h，期间轻摇2-3次。结束后取出冷却至室温，加入900μL氯仿-异戊醇(24：1)，充分振荡混匀，12000×g离心10min。取上清，加入等体积氯仿-异戊醇(24：1)，充分振荡混匀，12000×g离心10min。取上清，加入2/3体积预冷的异丙醇溶液，-20℃放置0.5h以上。取出，12000×g离心10min，弃上清，沉淀用70％乙醇洗涤两次，37℃挥干乙醇，用适量灭菌水溶解，-20℃保存。 
4PCR扩增 
PCR反应在200μLPCR反应管中进行，反应总体积20μL，包括以下试剂：2.0μL10×buffer缓冲液，1.6μL dNTP(2.5mM)，0.25μL鉴别引物F1(5μM)，0.25μL鉴别引物F2(5μM)，0.25μL通用引物1F(5μM)，0.25μL通用引物724R(5μM)，0.2μLTaqDNA聚合酶(Takara公司，Extaq5UμL-1)，0.5μL模板DNA，14.7μL无菌双蒸水。 
PCR反应液配制完后，轻轻震荡混匀，将PCR管放入PCR仪中，进行如下反应：解链温度95℃，时间5min，退火温度57℃，时间30s，复性温度72℃，时间为1min40s，35个循环后72℃延伸7min，获得扩增产物。取3μL扩增产物，采用1％的琼脂糖凝胶，在电压100-150V下电泳15分钟，凝胶成像系统下观察并拍照。 
断肠草与金银花的电泳结果如图1，结果可见，断肠草能够扩增出片段大小分别约为1000bp和300bp的两条带，而金银花则只扩增出片段大小约为300bp的单一条带，表明该体系能将断肠草与金银花准确的鉴别出来。 

Claims (2)

1.一种鉴定断肠草的特异引物F1、F2，其序列为：F1：5'-TCTCCGCCCTCTGCTCTA-3’，F2：5'-GGAAGAAAGGAGTTTTTATGAGG-3’。
2.一种断肠草的PCR鉴定方法，其特征在于，包括下列步骤：
a)从所述材料中提取到DNA样品；
b)用权利要求1所述的引物进行PCR反应，扩增反应体系包括：10×buffer缓冲液2μL，dNTP1.6μL，引物各0.5μL，EX Tap酶0.2μL，DNA0.5μL，灭菌蒸馏水14.7μL；反应条件：解链温度95℃，时间5min，退火温度57℃，时间30s，复性温度72℃，时间为1min40s，35个循环后72℃延伸，时间为7min；
c)电泳所述扩增产物，如果存在分子量约为300bp的单一条带，则确定所检材料为断肠草。
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