CN104628692A

CN104628692A - 柠檬苦素类化合物,其药物组合物及其制备方法和用途

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Publication number: CN104628692A
Application number: CN201510064260.XA
Authority: CN
Inventors: 庄爱华
Original assignee: Individual
Current assignee: Hao Xiaochen
Priority date: 2015-02-09
Filing date: 2015-02-09
Publication date: 2015-05-20
Anticipated expiration: 2035-02-09
Also published as: CN104628692B

Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及从东风桔中分离得到的一种新的柠檬苦素类化合物Ⅰ，其药物组合物及其制备方法和用途。该化合物是一种新颖的柠檬苦素类化合物，体外试验证明能显著抑制人胰腺癌细胞增殖，可以用来制备治疗胰腺癌的药物。

Description

柠檬苦素类化合物,其药物组合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及从东风桔中分离得到的一种新的柠檬苦素类化合物Ⅰ，其药物组合物及其制备方法和用途。

背景技术

东风桔为芸香科酒饼勒属植物，始载于《岭南采药录》，目前为《全国中草药汇编》及《卫生部药品标准》中药成方制剂第三册附录收载。东风桔药用根与根茎，其性辛、苦，微温，归肺、胃、脾经，有祛风解表、化痰止咳、理气定痛的功效。海南、广西、广东、福建等地历来沿用本品治疗急、慢性气管炎，临床效果较好，另外有研究表明其具有较好的化痰、止咳、平喘之功效。东风桔作为一种民间用药，其疗效显著，而且广泛应用于各大医院复方中，引起了国内外学者的极大兴趣。随着研究的不断深入，东风桔的化学成分和药理活性越来越受到人们的重视。

东风桔包含的化学成分复杂多样，迄今为止主要分离得到挥发油、柠檬苦素类、生物碱、香豆素类、黄酮类等成分。其中，柠檬苦素类化合物是重要的活性成分。柠檬苦素类化合物是由大戟烷或甘遂烷型三萜衍生而来的一类高度氧化的四降三萜类化合物，是芸香科植物主要特征的化学成分，结构独特，具有明显的抗癌和抗菌等生物活性。近年来的研究比较多，主要集中在其化学结构、生物合成和生物活性等方面。芸香科植物中柠檬苦素类化合物主要分为3类：柠檬苦素苷元类、降解型柠檬苦素类和糖苷型柠檬苦素类，其中以苷元居多。

柠檬苦素类化合物具有明显抗癌和抗菌等生物活性，近年来的研究集中在其化学结构、生物合成和生物活性等方面。有学者研究了柠檬苦素等五种柠檬苦素类化合物对人肿瘤细胞株（L-60、SKOV-3、HeLa、NCI-SNU-1、H epG2和MCF-7）抑制增殖活性作用，结果发现五种檬苦素类化合物对人乳腺癌细胞MCF-7均具有明显的增殖抑制作用，且呈一定的剂量时间依赖关系。

发明内容

本发明的目的是提供一种从东风桔中分离得到的一种新的柠檬苦素类化合物Ⅰ，其药物组合物及其制备方法和用途。

本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：

本发明的新的柠檬苦素类化合物Ⅰ结构式如下：

本发明的药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物Ⅰ和药学上可接受的载体。

本发明的化合物Ⅰ的制备方法：东风桔干燥药材，室温条件下采用热回流法用75%乙醇提取3次，每次体积30L，合并乙醇提取液，减压回收，得醇浸膏。醇浸膏加适量水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取，萃取液浓缩得石油醚浸膏、乙酸乙酯浸膏和正丁醇浸膏。正丁醇浸膏用水混悬，过滤，滤液上D101大孔吸附树脂，乙醇-水系统梯度洗脱，收集60%-70%乙醇洗脱部分；60%-70%乙醇洗脱部分上硅胶柱层析，用二氯甲烷-甲醇按体积比20:1, 15:1, 10:1, 5:1, 2:1依次梯度洗脱，收集二氯甲烷-甲醇5:1洗脱部分，减压回收溶剂；取二氯甲烷-甲醇5:1洗脱部分进一步用正己烷-丙酮按体积比10:1, 5:1, 2:1依次梯度洗脱，收集正己烷-丙酮2:1洗脱部分，减压回收溶剂；正己烷-丙酮2:1洗脱部分进行反相硅胶柱层析，用甲醇-水80:20等度洗脱，收集3-4柱体积洗脱部位，浓缩；取浓缩物用半制备型高效液相色谱分离制备，甲醇-水75:25等度洗脱，得到纯的化合物Ⅰ。

本发明的化合物Ⅰ在制备治疗胰腺癌药物中的应用。

本发明的上述药物组合物在制备治疗胰腺癌药物中的应用。

本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物Ⅰ，其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。

所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明药物可通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等；用于注射时，可制成灭菌的水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。

附图说明

图1：化合物Ⅰ的结构式；图2：不同浓度化合物Ⅰ作用SW1990细胞株24小时后的抑制率间关系。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

实施例1：

1、主要试剂：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷、甲醇、正己烷和丙酮均购自上海凌峰化学试剂有限公司。

2、提取分离方法：东风桔干燥药材8kg，室温条件下采用热回流法用75%乙醇提取3次，每次体积30L，合并乙醇提取液，减压回收，得醇浸膏655g。醇浸膏加1.5L水混悬，依次用石油醚1.5L、乙酸乙酯1.5L、水饱和正丁醇1.5L萃取，萃取液浓缩得石油醚浸膏、乙酸乙酯浸膏和正丁醇浸膏295g。正丁醇浸膏用1L水混悬，过滤，滤液上D101大孔吸附树脂，10%、30%、45%、60%、70%、95%乙醇溶液依次梯度洗脱，每个浓度冲洗4个柱体积，收集60%-70%乙醇洗脱部分90g；60%-70%乙醇洗脱部分上硅胶柱层析，用二氯甲烷-甲醇按体积比20:1, 15:1, 10:1, 5:1, 2:1依次梯度洗脱，收集二氯甲烷-甲醇5:1洗脱部分，减压回收溶剂得浸膏55g；取二氯甲烷-甲醇5:1洗脱部分进一步用正己烷-丙酮按体积比10:1, 5:1, 2:1依次梯度洗脱，收集正己烷-丙酮2:1洗脱部分，减压回收溶剂得浸膏18g；正己烷-丙酮2:1洗脱部分进行反相硅胶柱层析，用甲醇-水80:20等度洗脱，收集3-4柱体积洗脱部位，浓缩；取浓缩物用半制备型高效液相色谱分离制备，甲醇-水75:25等度洗脱，得到纯的化合物Ⅰ36mg。

3、结构确证：白色无定型粉末；HR-ESIMS显示[M+Na]⁺为m/z 461.1921，结合核磁可得分子式为C₂₆H₃₀O₆，不饱和度为12，说明该化合物是一个高度氧化且不饱和度高的化合物；红外IR显示羰基(1690 cm^-1)和碳碳双键(1650, 1618 cm^-1)存在；¹H-NMR（MeOH-d ₄, δppm, 600MHz）和¹³C-NMR（MeOH-d ₄,δppm, 150 MHz）数据见表1。结合二维谱及该类化合物核磁数据可确定其结构。

表1 ¹H NMR和¹³C NMR信号归属

实施例2：

1、材料

1.1 细胞株：人胰腺癌SW1990细胞株和正常人细胞株L-O2，购自中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所细胞库。

1.2 主要试剂：化合物Ⅰ为自制，纯度大于96%；胎牛血清，购自Hyclone公司；PBS，购自北京中杉金桥公司、DMEM，购自北京艾然生物科技有限公司、MTT，购自北京索莱宝科技有限公司、DMSO，购自Hyclone公司、NaHCO₃，购自北京中杉金桥公司、双抗青霉素及链霉素溶液，购自Hyclone公司、胰酶，购自美国Sigma公司。

1.3 主要仪器：CO₂恒温培养箱，购自美国Thermo公司，台式高速冷冻离心机，购自美国Sigma公司，酶标仪，购自美国Sigma公司，电子天平，购自赛多利斯科学仪器北京有限公司，超净工作台，购自苏净集团安泰公司，倒置XD-101型生物显微镜、自动涡旋混合器，均购自天津药典标准仪器厂，溶剂过滤器，购自天津药典标准仪器厂，恒温水浴箱，购自江苏荣华仪器制造有限公司。

2、方法

2.1 细胞复苏与培养：根据细胞的复苏“慢冻快融”的原则，取出冻存的人胰腺癌SW1990细胞株，迅速放入37℃恒温水浴箱内，将细胞面浸至水面以下不断摇动至融化，立即加入到配制好的DMEM培养基，置37℃、5% CO₂培养箱中培养，24h后换液1次，连续传代至对数生长期。

2.2 溶液的制备：精密称取化合物Ⅰ适量溶于DMSO中制得化合物母液，用DMEM培养液稀释得到一系列浓度不同的化合物Ⅰ溶液。置4℃冰箱中备用。

2.3 细胞计数 ①盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血细胞计数槽上。②制备计数用的细胞悬液：用吸管吸取细胞悬液、锥虫蓝染液（0.4%）各1滴，吹均匀。③将细胞悬液滴入计数板：吸取少量吹匀的细胞悬液沿盖片边缘缓缓滴入，至盖玻片下充满悬液。④统计4个大格的细胞数：将血细胞计数板放于显微镜的低倍镜下，观察计数。⑤计算原细胞悬液的细胞数。

2.4细胞铺板：取对数生长期细胞，用胰酶溶液（0.25%胰酶与0.02% EDTA等体积混匀）消化。将上述溶液用培养基稀释，使细胞悬液的细胞密度为9.28×10⁶个/mL，分别取100μL接种于96孔板中，孵箱中培养24h。

2.5 MTT法测定：37℃培养后，弃上清液，加入待测药物，于37℃、5% CO₂孵箱中培养24h，弃上清液，弃上清，加入100μl含0.5mg/ml的MTT无血清培养液培养4小时，加入100μl DMSO，放置于微型振荡仪上振荡10min，再置于酶标仪上570nm处测OD值。正常人细胞系L-O2 做毒性评价，每次实验重复3次。抑制率=（A对照组-A给药组）/A对照组×100%。

3、实验结果

附图2为不同浓度化合物Ⅰ (1, 5, 10, 15, 20, 25μM) 对人胰腺癌SW1990和L-O2细胞株作用24小时后的生长抑制情况，结果提示：随着化合物浓度增加，与相应不加化合物的对照组比较，人胰腺癌SW1990细胞增殖活性分别下降，提示该化合物呈浓度依赖性抑制胰腺癌细胞增殖。化合物Ⅰ不抑制正常肝细胞系L-O2 细胞的增殖。化合物Ⅰ作用于人胰腺癌SW1990细胞株的IC₅₀为9.5μM。

实施例3：

片剂的制备：按实施例1方法先制得化合物Ⅰ，以及利用有机酸（酒石酸、柠檬酸、甲酸、乙二酸等）或无机酸（盐酸、硫酸、磷酸等）制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:8的比例加入赋形剂，制粒压片。

实施例4：

口服液的制备：按实施例1方法先制得化合物Ⅰ，以及利用有机酸（酒石酸、柠檬酸、甲酸、乙二酸等）或无机酸（盐酸、硫酸、磷酸等）制成的盐，按常规口服液制法制成口服液。

实施例5：

胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物Ⅰ，以及利用有机酸（酒石酸、柠檬酸、甲酸、乙二酸等）或无机酸（盐酸、硫酸、磷酸等）制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:6的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。

实施例6：

注射液的制备：按实施例1方法先制得化合物Ⅰ，以及利用有机酸（酒石酸、柠檬酸、甲酸、乙二酸等）或无机酸（盐酸、硫酸、磷酸等）制成的盐，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。

实施例7：

无菌粉针的制备：按实施例1方法先制得化合物Ⅰ，以及利用有机酸（酒石酸、柠檬酸、甲酸、乙二酸等）或无机酸（盐酸、硫酸、磷酸等）制成的盐，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。

Claims

1.具有下述结构式的柠檬苦素类化合物Ⅰ：

药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物Ⅰ和药学上可接受的载体。

2.权利要求1所述的化合物Ⅰ的制备方法，其特征在于：东风桔干燥药材，室温条件下采用热回流法用75%乙醇提取3次，每次体积30L，合并乙醇提取液，减压回收，得醇浸膏。

3.醇浸膏加适量水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取，萃取液浓缩得石油醚浸膏、乙酸乙酯浸膏和正丁醇浸膏。

4.正丁醇浸膏用水混悬，过滤，滤液上D101大孔吸附树脂，乙醇-水系统梯度洗脱，收集60%-70%乙醇洗脱部分；60%-70%乙醇洗脱部分上硅胶柱层析，用二氯甲烷-甲醇按体积比20:1, 15:1, 10:1, 5:1, 2:1依次梯度洗脱，收集二氯甲烷-甲醇5:1洗脱部分，减压回收溶剂；取二氯甲烷-甲醇5:1洗脱部分进一步用正己烷-丙酮按体积比10:1, 5:1, 2:1依次梯度洗脱，收集正己烷-丙酮2:1洗脱部分，减压回收溶剂；正己烷-丙酮2:1洗脱部分进行反相硅胶柱层析，用甲醇-水80:20等度洗脱，收集3-4柱体积洗脱部位，浓缩；取浓缩物用半制备型高效液相色谱分离制备，甲醇-水75:25等度洗脱，得到纯的化合物Ⅰ。

5.权利要求1所述的化合物Ⅰ在制备治疗胰腺癌药物中的应用。

6.权利要求2所述的药物组合物在制备治疗胰腺癌药物中的应用。