CN104623682B - 一种用于抑制HeLa细胞生长的磁性靶药的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于抑制HeLa细胞生长的磁性靶药的制备方法。该方法通过先合成Fe3O4/PPy复合纳米球，然后将Fe3O4/PPy复合纳米球通过简单的脱掺杂处理，获得表面氨基更多的Fe3O4/PPy复合纳米球；然后采用耦合化学方法，使Fe3O4/PPy表面氨基和MTX分子中的羧基以酰胺键的形式形成共价键，制备了磁性靶药。本发明不仅制备方法简单，而且制得的磁性靶药具有药物缓释功能，对能够过度表达叶酸受体的肿瘤细胞具有靶向特异性，能够有效抑制肿瘤细胞生长。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于抑制HeLa细胞生长的磁性靶药的制备方法，属于磁性纳米复合材料制备技术领域。
背景技术
据文献记载(Adv.Drug Del.Rev.,2008,60,1252-1265.)，适合在生物相关领域应用的磁性纳米复合物需要具备四个基本特征：合适的颗粒尺寸、生物相容性、超顺磁性和高磁响应性及功能化的表面。功能化的表面是指颗粒表面有能够和生物分子接枝、形成共价键的官能团或功能基，以保证接枝后的磁性纳米复合物在生物体内输运过程中的稳定性。
磁性颗粒是否适合在生物体内应用，颗粒尺寸至关重要。颗粒尺寸过小，容易被肾脏清除；颗粒尺寸过大，容易被网状内皮组织吞噬；因此，合适的颗粒尺寸为30～150nm(J.Phys.D:Appl.Phys.2009,42,224003-1-9；Histochem.Cell Biol.,2008,130,845-875.)。对于磁性晶粒，磁响应性和超顺磁性都具有尺寸依赖性。以Fe3O4晶粒为例，在结晶度相似的情况下，磁响应性随着晶粒尺寸的增大而增高；但是，具有超顺磁性的Fe3O4晶粒的尺寸范围为20～30nm(Angew.Chem.Int.Ed.,2007,46,4342-4345.)。若颗粒在溶液中分散性较好(类单分散)，由于晶粒尺寸较小，受布朗运动作用力的影响，此类磁性纳米粒子在外加磁场作用下很难从溶液中分离(ACS Appl.Mater.Interfaces,2012,4,5633-5642.)；换言之，此类磁性纳米粒子的磁响应性低，加上晶粒尺寸小，不合适在生物体内使用。
增大磁性晶粒尺寸至适合在生物体内应用的范围(30～150nm)，固然能相对提高其磁响应性，但是会导致磁性晶粒由超顺磁性向铁磁性(剩磁和矫顽力较大)的转变。因此，如何控制晶粒尺寸，在提高磁性颗粒磁响应性的同时又能保持其超顺磁性，是磁性颗粒在生物体内得以应用的关键。研究者发现，由尺寸小于30nm的Fe3O4的初级粒子自组装而形成的Fe3O4纳米团簇，能够满足上述要求。此类Fe3O4纳米团簇多采用多元醇还原法制备(J.Phys.Chem.C,2007,111,5281-5285；J.Phys.Chem.C,2011,115,18923–18934；Angew.Chem.Int.Ed.,2009,48,5875-5879.)。
聚吡咯(PPy)是一种表面富含氨基的导电聚合物，具有合成简单、表面性质可以调变的特点。在四氧化三铁/聚苯胺和四氧化三铁/聚吡咯磁性微/纳米复合物的制备及应用领域，研究人员做了大量工作(CN102701277A；20141061728.9；Dalton Trans.2013,42,1820-1826；Synth.Met.2013,171,1-6.)。中国专利文献(申请号201410617728.9)公开了通过简单的脱掺杂处理，可以使聚吡咯表面被酸掺杂剂遮蔽的氨基释放出来，增加其表面氨基含量。
甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)是一种叶酸类似物和二氢叶酸还原酶抑制剂，它通过与肿瘤细胞中过度表达的叶酸受体的特异性结合，抑制肿瘤细胞中的二氢叶酸还原酶，使二氢叶酸不能还原成有生理活性的四氢叶酸，从而使嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸生物合成过程中一碳基团的转移受阻，导致肿瘤细胞DNA的生物合成受到抑制，阻碍其生长和繁殖(J.Mater.Chem.,2009,19,6400-6406.)。需要指出的是，要使接枝MTX的磁性靶药在生物体内起有效作用，必须使MTX以共价键的方式接枝到磁性载体上(Langmuir,2005,21,8858-8864.)。为此，研究者发展了多种改善磁性载体表面的方法。例如，用大分子或聚合物修饰磁核表面，其中包括聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙二醇–三氯三嗪复合物等(Small,2006,2,785-792.；J.Mater.Chem.,2007,17,3354-3362；J.Mater.Chem.,2009,19,6400-6406.)。然而，所有这些方法中，磁性复合载体的制备过程繁琐，且对磁性复合载体在生物体内应用应具备的特征缺乏考虑。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种用于抑制HeLa细胞生长的磁性靶药的制备方法，该法以Fe3O4纳米球形颗粒为原料，以吡咯为单体，通过原位聚合反应、脱掺杂处理，制备Fe3O4/PPy复合纳米球形颗粒；然后通过耦合反应，将MTX接枝到Fe3O4/PPy表面，获得Fe3O4/PPy/MTX磁性靶药。该方法获得的Fe3O4/PPy/MTX磁性靶药不仅满足适合在生物体内应用的特征，而且具有药物缓释性能，并对HeLa细胞有靶向特异性，能显著抑制HeLa细胞的生长。
一种用于抑制HeLa细胞生长的磁性靶药的制备方法，其特征在于，步骤如下：
a.在搅拌条件下，将乙酰丙酮铁溶解于乙二醇中，乙酰丙酮铁在乙二醇中的浓度为14.3～25mg/mL，再加入醋酸钠和聚乙二醇，醋酸钠和乙酰丙酮铁的物质的量之比为(3～6):1，乙酰丙酮铁和聚乙二醇的质量比为(2～4):1，搅拌0.5～1h后，得混合液A；
b.将混合液A转移至内衬为聚四氟的高压反应釜中，混合液在高压反应釜中的填充率为70～84％，封釜，升温至190～200℃，保温反应20～36h，将温度降至室温，得混合液B；将混合液B中的固体进行磁分离，留固体，将固体水洗至水溶液呈中性，磁分离，得固体C；
c.往上述固体C中加入0.1～0.5mol/L的盐酸水溶液，固体C在盐酸水溶液中的浓度为5～10mg/mL，超声分散0.5～1h，磁分离，留固体，往固体中加入体积浓度为1～3％的吡咯乙醇溶液，超声分散0.5～1h，得混合液D；
所述固体C的质量与吡咯的体积之比为1:(1～1.5)，单位g/mL；
d.往混合液D中加入浓酸，然后将混合液温度降至2～10℃，滴加氧化剂的水溶液，保温搅拌1.5～3h，得混合液E，将混合液E中的固体进行磁分离，留固体，将固体水洗至水溶液呈中性，磁分离，得固体F；
其中，混合液E中氢离子的浓度0.05～0.1mol/L；
e.将固体F分散在浓度为1～2mol/L的氨水中，室温下搅拌3～6h，磁分离，留固体，将固体水洗至水溶液呈中性，磁分离，得固体G；
所述的固体F在氨水中的浓度为5～10mg/mL；
f.向固体G中加入甲氨蝶呤(MTX)的二甲亚砜溶液，甲氨蝶呤的浓度为1.5～5mg/mL，固体G与甲氨蝶呤的质量比为(3.33～6.67):1，再加入耦合剂的水溶液，用碱调混合液的pH为8.2～8.8，在36～38℃避光条件下搅拌12～24h，得混合液H；
所述耦合剂为失水剂和添加剂按物质的量之比为(3～6):1比例的混合，失水剂选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)或N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)，添加剂选自N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或N-羟基硫代琥珀酰亚胺(S-NHS)；
g.将混合液H进行磁分离，留固体，将固体水洗至水溶液呈中性，磁分离，将固体在40～60℃真空干燥，得磁性靶药。
根据本发明优选的，所述步骤a中搅拌速度均为300～400r/min；优选的，所述步骤a中聚乙二醇分子量为4000～8000；优选的，所述步骤a中醋酸钠为无水或水合醋酸钠；
根据本发明优选的，所述步骤c中吡咯乙醇溶液采用经过减压蒸馏处理过的吡咯单体配制。
根据本发明优选的，所述步骤d中的浓酸为质量浓度36～38％的盐酸、质量浓度63～65％的硝酸、质量浓度95～98％的硫酸或质量浓度70～72％的高氯酸。
根据本发明优选的，所述步骤d中的氧化剂为过硫酸铵、过硫酸钾、三氯化铁或六水合三氯化铁，氧化剂与吡咯的物质的量之比为(0.5～1.5):1；
根据本发明优选的，所述步骤d中氧化剂的水溶液与混合液D的体积之比为(1～2):1。
根据本发明优选的，所述步骤f中甲氨蝶呤与耦合剂中添加剂的物质的量之比为1:(1～2)；
根据本发明优选的，所述步骤f中耦合剂的水溶液与甲氨蝶呤的二甲亚砜溶液的体积比为(1～2):1；
根据本发明优选的，所述步骤f中的碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、三甲胺或三乙胺之一，或者，氢氧化钠、氢氧化钾、三甲胺或三乙胺之一的水溶液；
上述抑制HeLa细胞生长的磁性靶药在制备抑制肿瘤细胞生长药物中的应用。
根据本发明优选的，上述磁性靶药的有效作用浓度为0.1～1mg/mL；优选的，有效作用浓度为0.3～0.5mg/mL。
本发明首先合成了具有超顺磁性、磁响应性高、颗粒分散均匀、颗粒尺寸满足生物体内应用要求的Fe3O4/PPy复合纳米球；将新合成的Fe3O4/PPy复合纳米球通过简单的脱掺杂处理，获得表面氨基更多的Fe3O4/PPy复合纳米球；然后采用耦合化学方法，使Fe3O4/PPy表面氨基和MTX分子中的羧基以酰胺键的形式形成共价键，制备了Fe3O4/PPy/MTX磁性靶药。并对所制备的磁性靶药在模拟生物体内环境下的缓释行为，以及其对HeLa细胞的抑制性能进行了测试。研究结果表明，所制备的Fe3O4/PPy/MTX磁性靶药不仅满足适合在生物体内应用的特征(即超顺磁性、磁响应性高、合适的颗粒尺寸、MTX和载体之间形成共价键)，而且具有药物缓释性能，并对HeLa细胞有靶向特异性，能显著抑制HeLa细胞的生长。
有益效果
1.本发明以乙酰丙酮铁为铁源，采用乙二醇还原法，合成了分散性好的Fe3O4纳米团簇，然后以吡咯为单体，采用原位聚合法，制备了Fe3O4/PPy复合纳米球，将Fe3O4/PPy复合纳米球进行脱掺杂处理，进一步提高了其表面氨基含量；
2.本发明所制备的脱掺杂Fe3O4/PPy复合纳米球具有超顺磁性、磁响应性高、分散性好、表面氨基含量高、颗粒尺寸满足生物体内应用的特点，适合用作磁性靶药的载体；
3.本发明采用耦合化学方法，将甲氨蝶呤(MTX)接枝到Fe3O4/PPy表面，制备了Fe3O4/PPy/MTX磁性靶药；该靶药不仅制备方法简单，而且具有药物缓释功能，对能够过度表达叶酸受体的肿瘤细胞(如HeLa细胞)具有靶向特异性，能够有效抑制肿瘤细胞生长。
附图说明
图1为实施例1和2所制备的脱掺杂Fe3O4/PPy的XRD图；
其中：(a)实施例1；(b)实施例2；
图2为实施例2所制备样品的Zeta-电位随溶液pH变化的关系曲线图；
其中：(a)脱掺杂Fe3O4/PPy；(b)掺杂态Fe3O4/PPy；(c)掺杂态PPy(用作对比)；
图3为实施例2所制备的脱掺杂Fe3O4/PPy样品的TEM图；
其中：(a)低倍图；(b)高倍图；
图4为实施例2所制备样品的FT-IR图；
其中：(a)Fe3O4；(b)脱掺杂Fe3O4/PPy；(c)Fe3O4/PPy/MTX；(d)MTX(用作对比)；
图5为实施例2所制备的Fe3O4和脱掺杂Fe3O4/PPy样品的室温磁滞回线图；
其中：(a)脱掺杂Fe3O4/PPy；(b)Fe3O4；
图6为细胞毒性实验结果的柱状图；
其中：(a)细胞成活率随磁性靶药(实施例2制备)浓度变化的关系图；(b)Fe3O4、脱掺杂Fe3O4/PPy、Fe3O4/PPy/MTX和单独MTX对细胞成活率的影响；
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，这些实施例只是为了阐述本发明的技术方案而不能视为对本发明权利要求内容的限制。
实施例中用到的吡咯购自上海彤源化工有限公司；
实施例中用到的无水乙醇购自天津市富宇精细化工有限公司；六水合三氯化铁、过硫酸铵、乙二醇购自天津科密欧化学试剂有限公司；
甲氨蝶呤(MTX)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(S-NHS)、N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)购自百灵威化学试剂有限公司；
配制磷酸盐缓冲溶液所需的磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和氯化钠购自国药集团上海试剂公司；
细胞毒性实验中用到的DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素购自Gibco生命技术公司(上海)；CCK-8试剂盒购自东仁化学科技(上海)有限公司；甲醛购自国药集团上海试剂公司；
本发明所制备样品的X-射线粉末衍射(XRD)图经德国Bruker D8Advance X-射线粉末衍射仪检测获得；透射电镜(TEM)照片经荷兰Philips Tecnai Twin-20U高分辨透射电子显微镜检测获得；红外光谱(FT-IR)图经日本岛津Shimadzu IRPrestige-21红外光谱仪检测获得；Zeta-电位数据经英国Malvern Zetasizer Nano-ZS90Zeta电位仪检测获得；样品的磁性能经美国Quantum Design MPMS XL-7超导量子干涉磁强计检测获得；细胞活性经美国Multiskan MK3自动酶标仪检测获得；HeLa细胞吞噬磁性靶药的照片经日本OlympusIX71荧光倒置显微镜检测获得。
实施例1
一种用于抑制HeLa细胞生长的磁性靶药的制备方法，步骤如下：
a.将1g乙酰丙酮铁溶解于70ml乙二醇中，加入0.7g无水醋酸钠和0.5g聚乙二醇4000，剧烈搅拌(300r/min)0.5h后，得混合液A；
b.将混合液A转移至内衬为聚四氟的100mL高压反应釜中，升温至190℃，保温反应20h，将温度降至室温，得混合液B；将混合液B中的固体进行磁分离，留固体，将固体水洗至水溶液呈中性，磁分离，得固体C；
c.往上述固体C中加入40mL 0.1mol/L的盐酸水溶液，超声分散0.5h，磁分离，留固体，往固体中加入溶有0.2mL吡咯(经过减压蒸馏处理)的乙醇溶液20mL，超声(100W，40kHz)分散0.5h，得混合液D；
d.往混合液D中加入167μL浓度为12mol/L的浓盐酸，然后将混合液温度降至2℃，滴加20mL溶有0.33g过硫酸铵的水溶液，保温搅拌1.5h，得混合液E，将混合液E中的固体进行磁分离，留固体，将固体水洗至水溶液呈中性，磁分离，得固体F；
e.将固体F分散在57mL浓度为1mol/L的氨水中，室温下搅拌6h，磁分离，留固体，将固体水洗至水溶液呈中性，磁分离，得固体G；
f.往固体G中加入溶有43mg甲氨蝶呤(MTX)的二甲亚砜溶液28.7mL，再加入溶有21.8mg N-羟基琥珀酰亚胺和117mg N,N’-二环己基碳二亚胺的水溶液57.4mL，用pH为11的三乙胺水溶液调混合液的pH为8.2，在36℃避光条件下搅拌24h，得混合液H；
g.将混合液H进行磁分离，留固体，将固体水洗至水溶液呈中性，磁分离，将固体在40℃真空干燥，制得磁性靶药。
实施例2
一种用于抑制HeLa细胞生长的磁性靶药的制备方法，步骤如下：
a.将2g乙酰丙酮铁溶解于80mL乙二醇中，加入4.62g三水合醋酸钠和0.5g聚乙二醇8000，剧烈搅拌(400r/min)1h后，得混合液A；
b.将混合液A中转移至内衬为聚四氟的95mL高压反应釜中，升温至200℃，保温反应36h，将温度降至室温，得混合液B；将混合液B中的固体进行磁分离，留固体，将固体水洗至水溶液呈中性，磁分离，得固体C；
c.往上述固体C中加入40mL 0.5mol/L的盐酸水溶液，超声分散1h，磁分离，留固体，往固体中加入溶有0.6mL吡咯(经过减压蒸馏处理)的乙醇溶液20mL，超声(100W，40kHz)分散1h，得混合液D；
d.往混合液D中加入334μL浓度为12mol/L的浓盐酸，然后将混合液温度降至10℃，滴加20mL溶有3.51g六水合三氯化铁的水溶液，保温搅拌2h，得混合液E，将混合液E中的固体进行磁分离，留固体，将固体水洗至水溶液呈中性，磁分离，得固体F；
e.将固体F分散在57mL浓度为2mol/L的氨水中，室温下搅拌3h，磁分离，留固体，将固体水洗至水溶液呈中性，磁分离，得固体G；
f.往固体G中加入溶有171.2mg甲氨蝶呤(MTX)的二甲亚砜溶液34.2mL，再加入溶有81.8mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺和433mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液34.2mL，用pH为11的氢氧化钠水溶液调混合液的pH为8.8，在38℃避光条件下搅拌12h，得混合液H；
g.将混合液H进行磁分离，留固体，将固体水洗至水溶液呈中性，磁分离，将固体在60℃真空干燥，制得磁性靶药。
结果分析
经检测，图1a和b为实施例1和2中所制备的脱掺杂Fe3O4/PPy的XRD图。由图1可以看出，两Fe3O4/PPy样品的XRD谱图中各衍射峰的位置和文献(JCPDS no.88-0866)报道值吻合得很好，说明实施例1和实施例2制得的磁性靶药中的磁性组分为Fe3O4。
图2为实施例2中所制备的脱掺杂Fe3O4/PPy(图2a)、掺杂态Fe3O4/PPy(图2b)和掺杂态PPy(图2c)样品的Zeta-电位图(掺杂态PPy用作对比)。由图2可以看出，它们的等电点分别为4.4,8.2和8.3，这说明经过脱掺杂处理后，PPy壳层上有更多的表面氨基从掺杂剂的束缚中释放出来。此外，掺杂态Fe3O4/PPy(图2b)的等电点和掺杂态PPy(图2c)的等电点非常靠近，这说明Fe3O4/PPy复合物具有核–壳式结构。
图3是实施例2所制备的脱掺杂Fe3O4/PPy样品的TEM图。从样品的低倍TEM图(图3a)中能够看出样品颗粒的分散性较好，图高倍图(图3b)中能够清楚地看出样品具有核–壳式结构。重要的是，从图3中能够估算出所制备的Fe3O4/PPy磁性靶药载体的平均颗粒尺寸约为110nm，符合在生物体内应用对颗粒尺寸的要求范围(30～150nm)，其中PPy壳层的厚度范围为2～26nm。
图4是实施例2所制备的Fe3O4(图4a)、脱掺杂Fe3O4/PPy(图4b)、Fe3O4/PPy/MTX(图4c)和MTX(图4d)样品的FT-IR图。从图4b可以看出，脱掺杂Fe3O4/PPy样品具有Fe3O4(582cm–1)和PPy(1557,1475,1301,1205,1047,926,785cm–1)的特征峰，跟图4a中Fe3O4(573cm–1)的特征峰相比，峰位蓝移，说明PPy和Fe3O4之间具有较强的相互作用。图4c跟图4b相比，不仅Fe3O4和PPy的特征峰都在，而且多了MTX(图4d)的特征峰(3420,3160,1400cm–1)，且其峰位蓝移。这说明MTX以共价键方式接枝到了Fe3O4/PPy表面。
图5为实施例2所制备的Fe3O4和脱掺杂Fe3O4/PPy样品的室温饱和磁滞回线图。从图5可以看出，用作磁性靶药载体的Fe3O4/PPy具有较高的饱和磁化值(54.2emu/g)，这有利于磁性靶药在较弱的外加磁场下使用。重要的是，所制备的Fe3O4/PPy的矫顽力很小，仅为6Oe，这说明该磁性纳米复合物具有超顺磁性。
以上结果分析表明，采用本发明技术方案所制备的Fe3O4/PPy磁性载体，具有超顺磁性、磁响应性高，且颗粒分散性好、表面富氨基、颗粒尺寸满足生物体内的应用要求。
实施例3
上述磁性靶药在抑制HeLa细胞生长中的应用，步骤如下：
(1)取0.1g实施例2制备的磁性靶药用50mL体积浓度为75％的酒精杀菌24h，然后将杀菌后的磁性靶药分散在10mL pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，备用；
(2)将浓度为1.0×105/mL的Hela细胞悬液接种于96孔板，加入DMEM培养基100μL/孔，在37℃、5％CO2条件下培养24h，吸弃上清液，加入新DMEM培养基及磁性靶药，培养基中磁性靶药的浓度分别控制在0.1,0.2,0.3,0.4和0.5mg/mL；每组设置5个复孔；此外，设置阴性对照组以及毒性对照组，其中毒性对照组中Fe3O4、Fe3O4/PPy的浓度为0.44mg/mL，单独MTX的浓度为3μg/mL；
(3)将细胞置于37℃、5％CO2条件下分别培养24和48h，吸弃培养基，加入新DMEM培养基100μL/孔，加入CCK-8试剂盒10μL/孔，在37℃、5％CO2条件下培养2h；
(4)将自动酶标仪波长设置为450nm，测定96孔板每孔的吸光值，计算实验组与对照组吸光值之比，并计算细胞存活率；计算公式如下：
细胞存活率ω(％)＝(实验组OD值的平均值–空白对照组OD值的平均值)/(对照组OD值的平均值–空白对照组OD值的平均值)×100％
实验组OD值：具有培养基、细胞、CCK溶液和样品孔的吸光度；
空白对照组OD值：具有培养基和CCK溶液，没有细胞和样品孔的吸光度；
对照组OD值：具有培养基、细胞、CCK溶液，不加样品孔的吸光度。
结果分析
图6为细胞毒性实验结果图。图6a为HeLa细胞成活率随磁性靶药(实施例2制备)浓度变化的关系图。从图6a可以看出，随着磁性靶药在培养基中浓度的增加，在相同时间内细胞的成活率逐渐降低。当磁性靶药浓度为0.5mg/mL时，在24h时细胞的成活率只有11.1％，这说明所制备的磁性靶药对HeLa细胞生长有很好的抑制效果。值得注意的是，当磁性靶药浓度为0.3mg/mL时，在24和48h时，细胞的成活率分别为81.6％和30.9％。这说明所制备的磁性靶药具有很好的缓释效果。
图6b是相同浓度的Fe3O4、脱掺杂Fe3O4/PPy、Fe3O4/PPy/MTX及相当用量的单独MTX对细胞成活率的影响关系图。从图6b可以看出，Fe3O4和脱掺杂Fe3O4/PPy对HeLa细胞的生长几乎没有影响，这与文献报道的Fe3O4和PPy具有很好的生物相容性是一致的。而磁性靶药在48h时对细胞生长的抑制作用已相当明显，此时细胞成活率只有30.9％。另一方面，相当用量的单独MTX在24和48h时细胞的成活率分别为32.7％和38.5％，而此时对于有磁性靶药存在的情况下细胞成活率分别为81.6％和30.9％，这说明了本发明所制备的磁性靶药能够延长MTX在细胞质内的停留时间。
通过在相同时间内HeLa细胞对Fe3O4/PPy和Fe3O4/PPy/MTX颗粒的吞噬情况的差异，能够看出磁性靶药很容易被细胞吞噬，而Fe3O4/PPy较难被细胞吞噬，这说明了本发明所制备的Fe3O4/PPy/MTX磁性靶药对能够过度表达叶酸受体的HeLa细胞的靶向特异性。
以上结果分析表明，本发明所制备的Fe3O4/PPy/MTX磁性靶药不仅能显著抑制HeLa细胞的生长，而且具有靶向特异性和缓释功能。
Claims (11)
1.一种用于抑制HeLa细胞生长的磁性靶药的制备方法，其特征在于，步骤如下：
a、在搅拌条件下，将乙酰丙酮铁溶解于乙二醇中，乙酰丙酮铁在乙二醇中的浓度为14.3~25 mg/mL，再加入醋酸钠和聚乙二醇，醋酸钠和乙酰丙酮铁的物质的量之比为（3~6）:1，乙酰丙酮铁和聚乙二醇的质量比为（2~4）: 1，搅拌0.5~1 h后，得混合液A；
b. 将混合液A转移至内衬为聚四氟的高压反应釜中，混合液在高压反应釜中的填充率为70~84%，封釜，升温至190~200℃，保温反应20~36 h，将温度降至室温，得混合液B；将混合液B中的固体进行磁分离，留固体，将固体水洗至水溶液呈中性，磁分离，得固体C；
c. 往上述固体C中加入0.1~0.5 mol/L的盐酸水溶液，固体C在盐酸水溶液中的浓度为5~10 mg/mL，超声分散0.5~1 h，磁分离，留固体，往固体中加入体积浓度为1~3%的吡咯乙醇溶液，超声分散0.5~1 h，得混合液D；
所述固体C的质量与吡咯的体积之比为1 :（1~1.5），单位g/mL；
d. 往混合液D中加入浓酸，然后将混合液温度降至2~10 ℃，滴加氧化剂的水溶液，保温搅拌1.5~3 h，得混合液E，将混合液E中的固体进行磁分离，留固体，将固体水洗至水溶液呈中性，磁分离，得固体F；
其中，混合液E中氢离子的浓度0.05~0.1 mol/L；
所述的浓酸为质量浓度36~38%的盐酸、质量浓度63~65%的硝酸、质量浓度95~98%的硫酸或质量浓度70~72%的高氯酸；
所述的氧化剂为过硫酸铵、过硫酸钾、三氯化铁或六水合三氯化铁，氧化剂与吡咯的物质的量之比为(0.5~1.5) : 1；
e. 将固体F分散在浓度为1~2 mol/L的氨水中，室温下搅拌3~6 h，磁分离，留固体，将固体水洗至水溶液呈中性，磁分离，得固体G；
所述的固体F在氨水中的浓度为5~10 mg/mL；
f. 向固体G中加入甲氨蝶呤(MTX)的二甲亚砜溶液，甲氨蝶呤的浓度为1.5~5 mg/mL，固体G与甲氨蝶呤的质量比为（3.33~6.67）: 1，再加入耦合剂的水溶液，用碱调混合液的pH为8.2~8.8，在36~38℃避光条件下搅拌12~24 h，得混合液H；
所述耦合剂为失水剂和添加剂按物质的量之比为（3~6）: 1比例的混合，失水剂选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐或N,N’-二环己基碳二亚胺，添加剂选自N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或N-羟基硫代琥珀酰亚胺；
g. 将混合液H进行磁分离，留固体，将固体水洗至水溶液呈中性，磁分离，将固体在40~60℃真空干燥，得磁性靶药。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤a中搅拌速度均为300~400 r/min。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤a中聚乙二醇分子量为4000~8000。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤c中吡咯乙醇溶液采用经过减压蒸馏处理过的吡咯单体配制。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤d中氧化剂的水溶液与混合液D的体积之比为(1~2) : 1。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤f中甲氨蝶呤与耦合剂中添加剂的物质的量之比为1 : （1~2）。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤f中耦合剂的水溶液与甲氨蝶呤的二甲亚砜溶液的体积比为(1~2) : 1。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤f中的碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、三甲胺或三乙胺之一，或者，氢氧化钠、氢氧化钾、三甲胺或三乙胺之一的水溶液。
9.权利要求1制备的抑制HeLa细胞生长的磁性靶药在制备抑制肿瘤细胞生长药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的磁性靶药的有效作用浓度为0.1~1mg/mL。
11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，有效作用浓度为0.3~0.5 mg/mL。
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