CN104622948A

CN104622948A - 防治水产动物细菌性疾病的中西复合药物及其制备方法

Info

Publication number: CN104622948A
Application number: CN201510070985.XA
Authority: CN
Inventors: 郭伟良; 周永灿; 王文慧; 胡文婷; 吴学贵; 谢珍玉; 王世锋
Original assignee: Hainan University
Current assignee: Hainan University
Priority date: 2015-02-11
Filing date: 2015-02-11
Publication date: 2015-05-20
Anticipated expiration: 2035-02-11
Also published as: CN104622948B

Abstract

本发明公开了一种防治水产动物细菌性疾病的中西复合药物，所述中西复方药物按重量份数由鸡血藤丙酮提取浸膏55～120份和硫酸链霉素1～3份组成；本发明中西复合药物采用拌料投喂或药浴的使用方法；本发明采用中西药配伍使用技术，通过中西药互补优势和协同抗菌，降低抗生素类药物的使用剂量，降低链球菌耐药性、缩短疗程和休药期，解决水产养殖动物细菌性疾病的危害和药物残留等制约水产养殖业快速发展的瓶颈问题。提高养殖成活率、产品品质和养殖效益，促进水产养殖业的健康快速发展。

Description

防治水产动物细菌性疾病的中西复合药物及其制备方法

技术领域

本发明涉及防治水产养殖动物细菌性疾病药物。

背景技术

随着水产养殖地域的扩展、养殖规模的扩大、集约化水平的提高、养殖环境的变化、养殖种苗因过于追求快速生长而抗病力降低、抗生素滥用导致病原耐药提高等，水产养殖病害日益严峻，其中细菌性疾病是最常见也是危害最严重的水产疾病，具有病原种类多、流行范围广、死亡率高等特点，对水产养殖业造成了严重的经济损失。

近年来，由无乳链球菌和海豚链球菌等病原引起的链球菌病对水产养殖业造成了严重危害，该病发病速度快、流行范围广、死亡率高，广泛危害罗非鱼、虹鳟、斑点叉尾鮰、牙鲆和多耙等淡海水养殖鱼类，特别对罗非鱼等热带养殖鱼类危害尤为严重。2009年我国广东、海南、福建和广西等地养殖罗非鱼链球菌发病率为20％～50％，死亡率达50％～70％；2011年以来，罗非鱼链球菌病不仅发病时间提前，而且危害范围扩大，逐渐向原来不发病的小规格鱼种和鱼苗蔓延，损失极为惨重。由于许多水产养殖人员缺乏科学用药知识，在养殖生产中为防治该病暴发常常滥用药物，导致病原耐药性增强和防治难度增加。此外，由于链球菌存在多种耐药和免疫逃避途径，进一步加大了该病的防治难度，在耐药途径方面，仅针对阳离子抗菌肽的耐药途径就存在改变细胞表面电荷、青霉素结合蛋白调节、菌毛调节等途径；在免疫逃避方面，研究较多的有荚膜多糖抗原、Alp家族、β蛋白、C5a肽酶、Lmb、FbsA、Sip等介导的途径，其中荚膜多糖抗原含有末端唾液酸的成分，是抗吞噬细胞功能的重要因子，β蛋白具有与人IgA和因子H结合能力，有助于免疫逃避。水产养殖中抗生素等违禁药物的滥用还使罗非鱼等养殖产品药物残留超标，严重影响产品品质和消费者安全。中西复合药物是将中草药与化学药品进行合理配伍，以临床疗效为依据，经科学评价后制备的复方制剂。中西复合药物可集化学药高效快速治标的优势和中草药多靶位发挥功效的优势，既克服了因大量使用抗生素而易产生耐药性、造成环境污染、药物残留等缺点，也解决了中草药作用温和、起效慢、用量大等不足，通过优势互补和协同作用，不仅显著提高了疗效和缩短疗程，还有效避免了耐药性和药物残留等缺陷，使中西药配伍在临床上的使用越来越普遍。

本发明是以水产链球菌等病原为研究对象，通过研究抗生素与中草药配伍对抗菌效果的影响和它们之间的交互作用，筛选具有协同作用的抗生素和中草药。采用高效液相色谱-质谱-质谱(HPLC-MS-MS)分析技术研究应用中西复合药物后抗生素在罗非鱼体内的药代动力学规律，制定中西药复方制剂的安全高效配伍使用方案，减少抗生素的使用量，降低链球菌的耐药性和避免抗生素的药物残留，促进水产养殖业的健康和可持续发展。

发明内容

本发明的目的是提供了高效、来源广泛、不易引起病原菌耐药的中西复合药物，同时建立其科学、合理的使用方法；按此使用方法，这些中西复合药物可对水产养殖动物链球菌等细菌性疾病进行安全高效防治。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供一种防治水产动物细菌性疾病的中西复合药物，所述中西复方药物按重量份数由鸡血藤丙酮提取浸膏55～120份和硫酸链霉素1～3份组成；所述鸡血藤丙酮提取浸膏制备方法如下步骤：

A、将鸡血藤50℃烘干至恒重，粉碎，过40目筛；

B、按液料比为10：1(ml：g)加入丙酮，50℃提取1～3h，过滤；

C、在步骤B的滤渣中按液料比为10：1加入丙酮，50℃提取1～3h，过滤；

D、合并步骤B和步骤C的滤液，减压蒸馏将丙酮全部回收，获取鸡血藤丙酮提取浸膏；

所述硫酸链霉素符合《中国兽药典》2010年版标准的市售；

所述鸡血藤符合《中国兽药典》2010年版标准的市售；

所述鸡血藤丙酮提取浸膏用量是按其抑菌活性为0.62IU土霉素/mg计算，根据抑菌活性调整其用量。本发明中所述的鸡血藤丙酮提取浸膏均按此法进行应用。

本发明中西复合药物的应用方法：采用拌料投喂或药浴的使用方法。拌料投喂方法：将鸡血藤丙酮提取浸膏85份和硫酸链霉素2份融入适量的水，然后喷洒拌入饲料，使饲料中鸡血藤丙酮提取浸膏浓度为3.43g/Kg、硫酸链霉素浓度为0.08g/Kg，按鱼体重1～2％投喂，早晚各投喂一次，连续投喂7d，休药期要为15d以上；药浴方法：用含鸡血藤丙酮提取浸膏3.43g/L和硫酸链霉素0.08g/L药液浸泡病鱼30min，每天浸泡两次，连续7d，休药期为15d以上。

本发明的中西复合药物具有如下优点和有益效果：采用微孔板法进行初筛、琼脂扩散法进行复筛敏感的中草药和抗生素，采用化学计量学方法筛选具有协同作用的中草药和抗生素，避免因沿用人用或兽用中西药成方而不适于水产养殖动物的情况。以水产链球菌为研究对象，进行筛选和组合，通过体外抑菌实验和鱼体实验，本发明的中西复合药物可有效防治水产养殖动物细菌性疾病。尤其是对于罗非鱼链球菌病，用于预防，保护率可达到100％，而用于治疗，治愈率可达50％以上。采用中西药配伍使用技术，通过中西药互补优势和协同抗菌，降低抗生素类药物的使用剂量，降低链球菌耐药性、缩短疗程和休药期，解决水产养殖动物细菌性疾病的危害和药物残留等制约水产养殖业快速发展的瓶颈问题。提高养殖成活率、产品品质和养殖效益，促进水产养殖业的健康快速发展。

具体实施方式

实施例一

鸡血藤丙酮提取浸膏116份，硫酸链霉素1份，制备成鸡血藤丙酮提取浸膏23.20mg/ml+硫酸链霉素0.20mg/ml的中西复合药液；

实施例二

鸡血藤丙酮提取浸膏116份，硫酸链霉素3份，制备成鸡血藤丙酮提取浸膏23.20mg/ml+硫酸链霉素0.60mg/ml的中西复合药液；

实施例三

鸡血藤丙酮提取浸膏69.5份，硫酸链霉素2份，制备成鸡血藤丙酮提取浸膏13.92mg/ml+硫酸链霉素0.40mg/ml的中西复合药液；

实施例四

鸡血藤丙酮提取浸膏81.25份，硫酸链霉素1份，制备成鸡血藤丙酮提取浸膏32.48mg/ml+硫酸链霉素0.40mg/ml的中西复合药液；

实施例五

鸡血藤丙酮提取浸膏56份，硫酸链霉素1份，制备成鸡血藤丙酮提取浸膏27.84mg/ml+硫酸链霉素0.50mg/ml的中西复合药液；

实施例六

鸡血藤丙酮提取浸膏62份，硫酸链霉素1份，制备成鸡血藤丙酮提取浸膏18.56mg/ml+硫酸链霉素0.30mg/ml的中西复合药液；

实施例七

鸡血藤丙酮提取浸膏85份，硫酸链霉素2份，制备成鸡血藤丙酮提取浸膏20.23mg/ml+硫酸链霉素0.48mg/ml的中西复合药液；

试验：

1、抑菌效果：

(1)以0.03mg/ml的土霉素作为阳性对照，采用琼脂扩散测定中西复合药物的对罗非鱼无乳链球菌抑制活性，结果如表1。

表1各中西复合药液的抑菌效果

(2)采用梯度稀释法测定鸡血藤丙酮提取浸膏、硫酸链霉素和中西复合药物(鸡血藤丙酮提取浸膏85份，硫酸链霉素2份)的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)，结果如表2。由表2的结果可以看出，中西复合药物MIC和MBC中的硫酸链霉素和鸡血藤丙酮提取浸膏浓度显著低于单方硫酸链霉素和鸡血藤丙酮提取浸膏的MIC和MBC浓度，表明中西复合药物的抑杀菌效果优于单方硫酸链霉素和鸡血藤丙酮提取浸膏。

表2鸡血藤丙酮提取浸膏、链霉素和中西复合药物的MIC和MBC

(3)抗菌谱以0.03mg/mL土霉素为对照，采用琼脂扩散法测中西复合药物(鸡血藤丙酮提取浸膏20.23mg/ml+硫酸链霉素0.48mg/ml)对17菌的抑菌作用，结果如表3，结果显示中西复合药物除了对韦氏弧菌、藤黄微球菌和铜绿假单胞菌3种菌抑菌效果较差，对其余14种菌均有明显的抑菌效果，其中对需钠弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、轮虫弧菌、副溶血弧菌、大肠杆菌、无乳链球菌、海豚链球菌抑菌效果优于对照组。

表3中西复合药物抗菌谱

2、实体试验

(1)在养殖场，挑选体长10～15cm、健康、活力好的罗非鱼，在水泥池中暂养3d，暂养期间不投喂任何饲料，然后运回实验室，暂养于水族箱(75cm×60cm×65cm)中，每个水族箱20尾，加水深35cm，水体24h连续充氧，每天投喂鱼体重2.0％的罗非鱼饲料，每天换水一次，每次换水量1/5，水体水温为30±2℃，桶中水体透明度为32cm后继续暂养7d，将暂养好的罗非鱼分成2个空白对照组和10个给药组，每组20尾，对照组投喂罗非鱼日常饲料，给药组分成浓度一(鸡血藤丙酮提取浸膏18.90g/Kg+硫酸链霉素0.89g/Kg)、浓度二(鸡血藤丙酮提取浸膏11.81g/Kg+硫酸链霉素0.35g/Kg)、浓度三(鸡血藤丙酮提取浸膏5.91g/Kg+硫酸链霉素0.17g/Kg)、浓度四(鸡血藤丙酮提取浸膏3.43g/Kg+硫酸链霉素0.08g/Kg)、浓度五(鸡血藤丙酮提取浸膏1.71g/Kg+硫酸链霉素0.04g/Kg)5个含药浓度梯度组，每个浓度梯度2个平行组，按鱼体重2％进行投喂，一日两次，连续投喂14d，开始投喂含药饲料后以浓度为3.7×10⁵cfu/ml罗非鱼无乳链球菌菌悬液腹腔注射对罗非鱼进行攻毒，连续养殖并观察14d，结果如表4。

表4拌料投喂不同浓度中西复合药物对罗非鱼链球菌病的疗效

组别	实验鱼总数(尾)	累积死亡鱼总数(尾)	死亡率(％)	保护率(％)
					对照	20	10±0.0	50.0±0.0	--
浓度一	20	8±0.0	40.0±0.0	20.0±0.0
					浓度二	20	5±0.0	25.0±0.0	50.0±0.0
浓度三	20	2.5±0.7	12.5±3.5	75.0±7.1

浓度四	20	0.0±0.0	0.0±0.0	100.0±0.0
					浓度五	20	3.5±0.7	17.5±3.5	65.0±7.1

(2)在养殖场，挑选体长10～15cm、健康、活力好的罗非鱼，在水泥池中暂养3d，暂养期间不投喂任何饲料，然后运回实验室，暂养于水族箱(75×60×65cm)中，每个水族箱20条，加水深35cm，水体24h连续充氧，每天投喂鱼体重2.0％的罗非鱼饲料，每天换水一次，每次换水量1/5，水温为30±2℃，桶中水体可见度为32cm后继续暂养7d，将暂养好的罗非鱼分成4个组，一组20条，其中2组按鸡血藤丙酮提取浸膏3.43mg/Kg+硫酸链霉素0.08mg/Kg(浓度四)单次拌料投喂给药，投喂量为鱼体重的2％，分别在0、2、4、8、12、24、48、96、192、384、720h从这2组鱼中随机采集3尾罗非鱼肌肉样品。另外2组按鸡血藤丙酮提取浸膏3.43mg/Kg+硫酸链霉素0.08mg/Kg(浓度四)连续拌料投喂给药，每天早上9：00和下午17：00各投喂1次，投喂量为鱼体重的2％，连续投喂14d，第一次投喂后以浓度为3.7×10⁵cfu/ml罗非鱼源无乳链球菌菌悬液腹腔注射对罗非鱼进行攻毒，分别在停药后0、2、4、8、12、24、48、96、192、384、720h从这2组鱼中随机采集3尾罗非鱼肌肉样品。采用高效液相色谱-质谱-质谱(HPLC-MS-MS)方法监测罗非鱼肌肉样品中的硫酸链霉素含量，结果显示，单次拌料投喂给药的罗非鱼肌肉样品的硫酸链霉素在192h后低于0.3×10⁵(欧盟的药残限量标准)，而连续拌料投喂给药的罗非鱼肌肉样品的硫酸链霉素在720h后低于0.3×10⁵。

结果表明，本发明中西药组合对罗非鱼苗的无乳链球菌病治愈率达80.00％以上，有着显著的治疗效果。

以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。

Claims

1.一种防治水产动物细菌性疾病的中西复合药物，其特征在于所述中西复方药物按重量份数由鸡血藤丙酮提取浸膏55～120份和硫酸链霉素1～3份组成；所述鸡血藤丙酮提取浸膏制备方法如下步骤：

A、将鸡血藤50℃烘干至恒重，粉碎，过40目筛；

B、按液料比为10：1加入丙酮，50℃提取1～3h，过滤；

所述鸡血藤丙酮提取浸膏用量是按其抑菌活性为0.62IU土霉素/mg计算，根据抑菌活性调整其用量。

2.如权利要求1所述的防治水产动物细菌性疾病的中西复合药物，其特征在于：所述的中西复合药物的优选重量份数为：鸡血藤丙酮提取浸膏85份，抑菌活性为0.62IU土霉素/mg，硫酸链霉素2份。

3.如权利要求1所述的防治水产动物细菌性疾病的中西复合药物，其特征在于：将中西复合药物溶于水后拌入饲料投喂或药浴方式使用。