CN104614510B - 检测心脏损伤的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及检测患者心脏损伤的方法。本发明还涉及治疗鉴定为患有心脏损伤的患者的方法。本发明进一步涉及评价为治疗患者受损心脏而设计的正在进行的治疗方案的功效的方法。

Description

检测心脏损伤的方法
本分案申请是基于申请号为200880021887.5，申请日为2008年05月12日，发明名称为“检测心脏损伤的方法”的中国专利申请的分案申请。
相关申请的交叉参考
本申请依据35USC § 119(e)要求2007年5月10日提交的美国临时申请系列No.60/928,541的优先权，在此特意将该申请全部引入作为参考。
发明领域
本发明涉及医学诊断领域。更特别地，本发明涉及检测患者体内心脏损伤的方法。本发明还涉及治疗鉴定为患有心脏损伤的患者的方法。本发明还涉及评价设计用来治疗患者受损心脏的正在进行中的治疗方案的功效的方法。
发明背景
该申请中提及了几个出版物和专利文件，以更全面地描述本发明所属领域的进展情况。这些出版物和文件每篇的公开内容在此引入作为参考。
心力衰竭在原因上与损害心脏的多种病症相关，包括冠心病，伴有或没有心脏病发作；高血压；影响心肌的疾病、感染或毒素；和心瓣膜的疾病。心力衰竭的发作可以快速发生，从几天至几周，但更常见的是随着心脏逐渐和渐进地变弱，在几年的过程中缓慢发展。
针对患者体内癌细胞负荷降低的治疗干预常常(如果不是总是)伴随各种有害的副作用。实际上，用作治疗各种癌症的化疗剂的细胞生长抑制剂常常呈现出潜在的致命副作用，包括心脏毒性。细胞抑制治疗中常用的药剂包括大环内酯类柔红霉素及其前药，佐柔比星，阿霉素(亚德里亚霉素)和表柔比星，以及合成的抗生素米托蒽醌。大环内酯类，例如，代表一类基于柔红糖胺和四氢-萘并萘-二酮的化疗剂。将这些化合物用于治疗各种癌症，包括白血病和淋巴瘤，和乳房、子宫、卵巢和肺的实体肿瘤。除了在正在接受化疗的患者体内观察到的预期的不利反应，如脱发和恶心以外，涉及大环内酯给药的治疗干预因这类化合物的明显心脏毒性而复杂化和受到限制。与大环内酯使用相关的心脏毒性与给药的总剂量相关并且常常是不可逆的。这些化合物的抑制细胞效应和心脏毒性是由于(至少部分地)由大环内酯结合细胞膜成分引起的膜流动性和渗透性的改变所引起的。还认为心脏中自由基形成和大环内酯代谢产物的蓄积引起心脏损伤。心脏毒性常常呈现于心电图(EKG)异常和心律失常中或表现为心肌病，其最终可能导致充血性心力衰竭。
发明概述
本发明涉及提供新的诊断方法，用于筛选患者以鉴定呈现出心脏损伤病征的那些。然后用药物制剂治疗如此鉴定的患者，该药物制剂用于治疗在此所述的心脏损伤。在本发明的特定方面中，提出了筛选患者的方法，以鉴定呈现出由于例如心脏毒性、高血压、瓣膜障碍、心肌梗塞、病毒性心肌炎或硬皮病引起的心脏损伤信号的那些。在特定的方面中，本发明集中于鉴定呈现出由化疗干预引起的心脏毒性的患者。这些患者的归类用来鉴定需要治疗干预以缓解心脏毒性的短期和长期影响的患者亚组。可以用药物制剂治疗如此鉴定的患者亚组，该药物制剂用于治疗与使用心脏毒性剂量的药物或化学物质相关而产生的心脏损伤。在其中鉴定的患者的心脏损伤是由于正患有的病症(如高血压、瓣膜障碍、心肌梗塞、病毒性心肌炎或硬皮病)引起的情况下，也可以配制合适的药物制剂来治疗患有心脏损伤的患者。
本发明还包括根据心脏损伤的程度或类型将患者分级的方法，该知识指导熟练的医师来选择合适的治疗方案。本发明还包括评价治疗方案的功效的方法。
本发明的新方法是基于以下发现：完整的心脏组织中心脏肌钙蛋白I(cTnI)和心脏肌钙蛋白T(cTnT)的胞内水平变化可以用作心脏损伤存在的指示。更具体地，本发明已经发现了完整心脏组织中胞内cTnI和cTnT水平的降低作为诊断标记来鉴定处于心脏损伤风险中或经历心脏损伤的患者。可以从患者摘除心脏组织，并使用本领域已知的分子成像实验方案在体外测试或在体内分析。
使用任一种方法，将对于患者的心脏组织确定的胞内cTnI和cTnT水平与表达野生型或正常水平的胞内cTnI和cTnT的对照心脏组织的胞内cTnI和cTnT水平相比较。通过下列方法容易确定患者心脏组织中降低水平的胞内cTnI和/或cTnT，即，定量蛋白水平，这可以使用标准方法来实现，和分析结果以确定相对于对照胞内cTnI和cTnT水平的统计学上显著的下降在患者的心脏组织中是否明显。将显示出降低的胞内cTnI和/或cTnT水平迹象的患者作上标记，以使用选定的合适组合物进行治疗，从而恢复(至少部分地)正常的心脏功能，如通过胞内cTnI和cTnT水平的升高或胞内cTnI和cTnT正常水平的恢复所反映的。
在本发明的实施方案中，通过测定心脏功能正常患者的心脏组织中cTnT或cTnI任一种胞内水平来建立心脏组织中cTnT或cTnI任一种的对照或正常胞内水平。在本发明的另一个实施方案中，通过在能够引起心脏损伤的治疗开始之前确定患者心脏组织中cTnT或cTnI任一种的胞内水平来建立心脏组织中cTnT或cTnI任一种的对照或正常胞内水平。
在本发明的一个方面中，心脏损伤是心脏毒性、高血压、瓣膜障碍、心肌梗塞、病毒性心肌炎或硬皮病的结果。在本发明的再一个方面中，心脏毒性是由使用化疗剂或辐射的治疗所引起的。
通过测量治疗过的患者的心脏组织中的胞内cTnI和cTnT水平来评价设计用来至少部分地恢复正常心脏功能的治疗方案的功效也在本发明的范围之内。根据本发明，相对于治疗前测定的胞内cTnI和cTnT水平，治疗过的患者的心脏组织内的胞内cTnI和cTnT水平的升高是治疗正起作用以恢复心脏功能的阳性指示。
应当理解心脏组织中cTnI或cTnT任一种的胞内水平或心脏组织中cTnI和cTnT两者的胞内水平可以用作心脏组织活动和/或功能的指示。这适用于本发明的所有方面，包括涉及评价或诊断心脏损伤的方法，涉及相对于特定的治疗方案将患者分级的方法和涉及评价治疗方案的功效的方法。
根据本发明，心脏组织中降低的cTnI和/或cTnT mRNA水平也表示心脏损伤，并可以用来将患者群分级。因此，正常cTnI和/或cTnT mRNA水平的部分或完全恢复也是如上所述就蛋白水平而论的治疗功效的阳性指示。
一般来说，本发明涉及动物，更具体地，涉及哺乳动物，更特别地，涉及人。因此，患者优选是动物，包括但不限于如奶牛、猪、马、鸡、猫、狗等的动物，并且优选哺乳动物，最优选人。因此，术语“患者”或“病人”可以用来指人。
本发明还包括联合治疗方案，其中将GGF2或由神经调节蛋白基因编码的表皮生长因子样(EGFL)结构域和蛋白酶体抑制剂一起来给药，以治疗心脏损伤。用于本发明中的示例性蛋白酶体抑制剂是Proscript 519，其是有效的和选择性的蛋白酶体抑制剂。在本发明中有用的其他蛋白酶体抑制剂包括VelcadeTM和乳胞素。另外的蛋白酶体抑制剂是本领域技术人员已知的。实际上，蛋白酶体抑制剂已经用作治疗剂，用于治疗各种疾病，包括一些癌症和神经变性疾病。
本发明还包括GGF2或由神经调节蛋白基因编码的表皮生长因子样(EGFL)结构域在制备药物中的用途，该药物给予通过本发明的诊断方法鉴定为呈现出心脏损伤的患者。本发明进一步包括GGF2或由神经调节蛋白基因编码的表皮生长因子样(EGFL)结构域和蛋白酶体抑制剂一起在制备药物中的用途，该药物给予通过本发明的诊断方法鉴定为呈现出心脏损伤的患者。
从以下优选实施方案的描述和从权利要求书中将清楚本发明的其他特征和优点。
附图简述
图1A-1C显示了存活图(A)、柱状图(B-C)和免疫印迹(C)。对于存活分析(A)，给小鼠注射单剂量的阿霉素[20mg/kg，腹膜内(i.p.)]，使用或没用伴随的注射NRG1(0.75mg/kg，s.c.每日)。通过Kaplan-Meier方法分析十四天存活。关于血清肌酸激酶(CK)水平的测定(B)，在对照、Dox-处理和阿霉素注射后四天Dox-NRG1处理的小鼠中测量血清CK水平。图1C显示了NRG1注射减轻了小鼠中阿霉素诱导的cTnI、cTnT和cTnC蛋白水平的下调。用阿霉素(20mg/kg，i.p.)处理小鼠，使用或没用伴随的NRG1注射(0.75mg/kg，s.c.每日)。阿霉素处理后五天，通过Western印迹分析测量cTnI、cTnT和cTnC的蛋白水平。
图2A-D显示了探测的免疫印迹，来检测所示的蛋白。图2A揭示了NRG1减轻了新生大鼠心肌细胞(RNCM)中阿霉素诱导的cTnI和cTnT蛋白水平的下调。在NRG1(20ng/ml或50ng/ml)的存在或不存在下，用阿霉素(1μM)处理RNCM。阿霉素处理后48小时，通过Western印迹分析测量cTnI和cTnT蛋白水平。图2B显示了erbB2的抑制消除了NRG1对cTnI和cTnT的作用。在AG879(10μM)和AG1478(10μM)的存在和不存在下，用阿霉素(1μM)和NRG1(20ng/ml)处理RNCM。通过Western印迹分析来分析cTnI和cTnT的蛋白水平。如图2C中所示的，在LY294002(10μM)、Akt i(5μM)、PD98059(50μM)和雷帕霉素(10nM)的存在下，用阿霉素和NRG1处理RNCM。通过Western印迹分析来分析cTnI和cTnT蛋白水平。图2D显示了在放线菌酮(5μg/ml)、Z-VAD(100μM)或MG132(10μM)的存在下，用阿霉素或阿霉素+NRG1处理RNCM。通过Western印迹分析来测量cTnI和cTnT的蛋白水平。
图3A-3D显示了免疫印迹(A、C、D)和柱状图(B)。图3A呈现了其中在不同天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂(20μM)的存在下用阿霉素(1μM)处理RNCM的结果。通过Western印迹分析来测量cTnI和cTnT的蛋白水平。图3B显示了阿霉素处理的RNCM中天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶激活的作用。用Dox、Dox+NRG1或Dox+NRG1+LY处理细胞。通过天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶激活测试来分析天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶激活。图3C显示了NRG1降低了阿霉素诱导的细胞色素C释放。用Dox或Dox+NRG1处理RNCM。通过细胞分级分离和Western印迹分析来分析细胞色素c释放。图3D揭示了NRG1降低了阿霉素诱导的cTnI的遍在化。用Dox或Dox+NRG1处理RNCM。用cTnI抗体使细胞裂解物免疫沉淀并用遍在蛋白抗体探测。
图4A-4B显示出溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶(A)和免疫印迹(B)。图4A揭示了NRG-1抑制了阿霉素诱导的cTnI、cTnT和心脏特异性转录因子的mRNA水平的下调。用Dox或Dox+NRG1处理RNCM。通过定量RT-PCR分析cTnI、cTnT、GATA4、MEF2c和NKX2.5的mRNA水平。图4B显示了NRG1抑制了阿霉素诱导的翻译分子的脱磷酸作用。用Dox、Dox+NRG1或Dox+NRG1+LY来处理RNCM。通过Western印迹分析来分析mTOR、P70S6K、S6、4EBP和EIF4G的脱磷酸水平。
图5A-5C显示了存活图(A)、柱状图(B)和免疫印迹(C)。图5A显示了阿霉素处理的小鼠中的存活分析，该小鼠具有结构域阴性PI3K(dnPI3K)的心肌细胞-特异性超表达。用单剂量的阿霉素(20mg/kg，腹膜内)处理小鼠，使用或未使用伴随的NRG1治疗(0.75mg/kg，s.c.)。通过Kaplan-Meier方法分析十四天存活。图5B描绘了阿霉素处理的dnPI3K小鼠中的血液动力学测量。用单剂量的阿霉素(20mg/kg，膜膜内)处理小鼠。阿霉素处理后六天进行血液动力学测量。图5C显示了用Dox或Dox+NRG1处理的dnPI3K小鼠中的cTnI蛋白水平。
图6A-D显示了GGF2的氨基酸和核酸序列。
图7显示了EGFL1的氨基酸和核酸序列。
图8显示了EGFL2的氨基酸和核酸序列。
图9显示了EGFL3的氨基酸和核酸序列。
图10显示了EGFL4的氨基酸和核酸序列。
图11显示了EGFL5的氨基酸和核酸序列。
图12显示了EGFL6的氨基酸和核酸序列。
发明详述
通常，当患者到医院报告胸痛时，采取以下的诊断步骤来评价患者心脏的状况，并确定所鉴定的任何问题的严重程度。首先，询问患者来汇编症状的一览表，使得健康护理医师可以排除非心脏相关的问题。其次，进行心电图(EKG)阅读，心电图记录了由心脏产生的电波。EKG是用于测定与心脏状况相关的胸痛严重程度和测量心脏损伤程度的必需工具。还进行了验血来检测特定因子升高的血清水平，某些因子如肌钙蛋白和肌酸激酶(CK)，以及肌酸激酶的心脏特异性更强的亚型(CK-MB)，其表示了心脏损伤。CK、CK-MB和肌钙蛋白的血清水平的升高是由于这些分子在心肌细胞死亡后的释放所引起的，并且因此用作坏死的血清标记。随着作为长期缺血结果的心肌细胞死亡，例如，细胞膜破裂，将胞内内含物释放至胞外流体空间中，从该处进入淋巴细胞，并随后进入血流中。成像测试，包括心回波图和灌注闪烁扫描法，也可以用于诊断内容中。
心脏坏死可用的最特异性标记是心脏肌钙蛋白。这些蛋白是心肌细胞收缩装置的组成部分。两种心脏肌钙蛋白，cTnI和cTnT，已经商业化，并且已经证明了这些标记的检测对于最小水平心肌损伤的检测是可靠而特异性的测试。心脏肌钙蛋白，如CK-MB，在细胞膜破裂时从死亡的心肌细胞中释放出来，并且最终在血液中可检测到。坏死作为长期心肌缺血的结果发生，但也可以是由其他诱因(如感染、创伤或充血性心力衰竭)引起的心肌细胞损伤引起的。
本发明在多个方面不同于现有技术中描述的那些程序。开始，其涉及测量完整心脏组织中的cTnI和cTnT的胞内水平，而不是这些标记的血清水平。此外，本发明已经发现了完整心脏组织中胞内cTnI和cTnT水平的降低作为诊断标记来鉴定处于心脏损伤风险中或经历心脏损伤的患者。该方法与那些标记的血清水平的测量明显相反，血清水平的提高表示心脏损伤。此外，这些标记的血清水平的提高是心脏损伤的急性或短暂标记，而完整心脏组织中cTnI和cTnT胞内水平的测量作为反应心脏状况的稳定标记。根据本发明，呈现出完整心脏组织中胞内cTnI和cTnT水平降低的患者的鉴定还提供了一种筛选方法，使用该方法将患者分成不同的种类，用于随后的治疗。将显示出降低的胞内cTnI和cTnT水平迹象的患者作上标记，以使用选定的合适组合物来治疗，以恢复(至少部分地)正常的心脏功能，如该标记水平恢复所反应的。
用于包含在这样的组合物中的示例性治疗剂是神经胶质生长因子2(GGF2)。图6A-6D中呈现了GGF2的氨基酸和核酸序列。治疗组合物还可以包括其他示例性多肽，如由神经调节蛋白基因编码的表皮生长因子样(EGFL)结构域，如图7-12中所示的，并且描述于美国专利号(USPN)5,530,109中，在此以其整体引入作为参考。
为了更清楚地阐述本发明的参数，使用以下的定义：
如本说明书和所附权利要求中所用的，单数形式“一种(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数指代物，除非文中另外清楚地指出。因此，例如，“该方法”包括一种或多种方法，和/或在此所述的和/或本领域技术人员在阅读该公开内容后将变得清楚的类型的步骤。
可以给予含有本发明的分子或化合物的组合物，用于诊断和/或治疗处理。在诊断应用中，将组合物给予患者，以确定患者是否具有心脏损伤和/或关于预期的治疗方案将患者分级、在治疗应用中，将组合物以足以治疗患者的含量给予诊断为具有心脏损伤的患者，由此至少部分抑制疾病及其并发症的症状。将足以实现该目的的量限定为“治疗有效量或剂量”。对于该用途有效的量将取决于疾病的严重程度以及患者的体重和一般状况。
如在此所用的，短语“心脏组织的对照样品”指的是其cTnI和cTnT的胞内水平在正常范围内的心脏组织样品。基于如在此提供的和本领域已知的实验来建立cTnI和cTnT的胞内水平的正常或野生型范围，在这些实验中，如由熟练的医师所确定的，具有健康心脏功能的患者的心脏组织被用作与未知相比较的标准品。表示正常心脏的标准品，例如，可以获自对没有心脏病迹象的尸体进行的新鲜尸体解剖。
相似地，术语“对照或正常水平”指的是如在此所述建立或确定的并且本领域理解为在与健康功能相关的范围内的水平。就本发明而论，健康功能指的是健康的心脏功能，其可以通过本领域技术人员使用标准方法来测定，所述的标准方法如测量收缩和舒张压，测量指示蛋白如CK、CK-MB和肌钙蛋白的血清水平，进行EKG和/或给予应力测试。熟练的医师将会知道一般被认为是这些蛋白的正常血清水平的那种状态。
例如，关于CK的血清水平，已经提出了各种研究，并且已经建立了一般指导。在一项这样的研究中，例如，怀疑患有心肌梗塞(MI)并具有280IU/L或更高的血清肌酸激酶水平的患者非常可能已经患有MI；具有80至279IU/L的血清肌酸激酶水平的患者很可能已经患有MI；具有40至79IU/L的肌酸激酶水平的患者不太可能已经患有MI；具有低于40IU/L的肌酸激酶水平的患者更不太可能已经患有MI。关于被认为是CK或肌钙蛋白的正常血清水平的那种状态，应当理解不同的医院已经建立了变化甚微的标准。此外，熟练的医师将会知道在医师工作的特定临床环境(例如，特定的医院)中的公认标准。
肌钙蛋白也被认为是用于心脏损伤的敏感性和特异性的标记。实际上，认为血清肌钙蛋白I(sTnI)的检测对于MI的诊断比肌酸激酶-MB浓度更精确，并且提供更有用的预后信息。sTnI的检测还可以早期鉴定具有急性冠状综合症并处于提高的死亡风险中的那些患者。sTnI对于具有总肌酸激酶少量增加的患者中不太严重的缺血性心肌损伤的检测比肌酸激酶-MB浓度更灵敏，并且避免了与使用肌酸激酶-MB作为围术期MI诊断标记相关的假性诊断的高发生率。在一项研究中，例如，具有中度升高的血清肌钙蛋白I(0.4-2.0μg/L)的患者与没有相似升高的患者相比时，具有显著更高的死亡率和更长的重症监护和留院时间。在中度升高的肌钙蛋白浓度范围内，较高的滴定度与提高的死亡风险、更长的留院和重症监护时间以及较高的心肌梗塞发病率相关。用β-阻断剂和阿司匹林治疗呈现出等于或高于2μg/L的最大血清肌钙蛋白浓度的患者改善了他们的预后。
关于胞内cTnI和cTnT的正常水平，通过使用确定蛋白水平的标准方法(如在此教导的和本领域已知的那些)评价正常的心脏组织来建立这样的测定。降低的胞内cTnI和cTnT水平，如表示受损或患病心脏的那些，被确定为这些蛋白相对于建立的正常水平的降低。例如，相对于健康心脏组织(正常对照)，待测试损伤的心脏组织中cTnI和cTnT水平至少50％的降低作为待测试心脏组织受到损伤的阳性指示，并且从其取出受损组织的患者将得益于如在此教导的那些治疗干预。在更特别的实例中，相对于健康心脏组织(正常对照)，待测试损伤的心脏组织中cTnT水平至少75％的降低作为待测试心脏组织受到损伤的阳性指示，并且从中取出受损组织的患者将得益于如在此教导的那些治疗干预。
本领域技术人员还将会知道大量关于正常和患病心脏组织中胞内cTnI和cTnT的活性和水平的科学文献。关于正常和患病心脏组织中胞内cTnI和cTnT的参考文献的实例包括：Latif等(2007，J Heart Lung Transplant 26:230-235)；Birks等(2005，Circulation112(9Suppl):I57-4)；Day等(2006，Ann NY Acad Sci 1080:437-450)；VanBuren等(2005，Heart Fail Rev 10:199-209)；de Jonge等(2005，Int J Cardiol 98:465-470)；Wen等(2008，J Biol Chem Apr 22，Epub ahead of print)；Li等(2008，Biochem Biophys ResCommun 369:88-99)；Robinson等(2007，Circ Res 101:1266-1273)；Solzin等(2007，Biophys J 93:3917-3931)；(Chen等(2007，Cardiovasc Toxicol 7:114-121)；Solaro等(2007，Circ Res101:114-115)；Kubo等(2007，J Am Coll Cardio 49:2419-2426)；Day等(2007，J Mol Med 85:911-921)；Milting等(2006，Mol Call Cardiol 41:441-450)；在此将每篇的全部内容引入作为参考。
在本发明的另一个实施方案中，如通过测定治疗方案之前和之中(或之后)的蛋白水平所确定的，胞内cTnI和cTnT水平的提高证明了该方案的治疗功效并提供了该方案促进正常心脏功能恢复的证据。实际上，胞内cTnI和cTnT水平的改善可以用作改善的心脏功能的替代终点(即，打算用来替代临床终点的生物标记)。然而，如果胞内cTnI和cTnT水平保持在降低的水平或在治疗干预后进一步降低，那么熟练的医师将会对于待治疗的患者重新考虑该方案的价值，并改变或可能地缩短该治疗方案。
如在此所用的，“防止”指的是获得或产生疾病或障碍的风险降低，即，在疾病发作之前引起至少一种疾病的临床症状没有在暴露于疾病诱发剂或易患病的患者中产生。
术语“预防”与“防止”相关，并且指的是其目的为防止，而不是治疗或治愈疾病的方法或程序。预防性方法的非限制性实例包括给予疫苗；将低分子量肝素给予由于例如固定而处于血栓形成风险中的住院患者；在去疟疾是地方病或接触疟疾风险高的地理区域就诊之前，给予抗疟疾药，如氯喹。
在一个实施方案中，术语任何疾病或障碍的“治疗”指的是改善疾病或障碍(即，停止疾病或降低其至少一种临床症状的表现、程度或严重性)。在另一个实施方案中，“治疗”指的是改善至少一个物理参数，其可能通过患者是不能辨别的。再一个实施方案中，“治疗”指的是调节疾病或障碍，身体上的(例如，可辨别症状的稳定)、生理上的(例如，物理参数的稳定)或两者。
用于分离组织的入侵性程序
心肌活检是常见程序，其中在胸廓切开术过程中或在开胸外科手术过程中，通过导管从心脏获得心脏组织。其通常用于诊断心力衰竭的病因学。在组织学上和生化上分析心脏组织。这些测试的结果在诊断心力衰竭的诱因中是有用的。对于临床环境中心肌活检的综述，参见Veinot(2002，Can J Cardiol.18(3)：287-96)，在此将其完整的公开内容引入作为参考。
心肌活检的结果指出心力衰竭是如硬皮病、病毒性心肌炎、药物毒性这样的诱因或许多心力衰竭诱因的结果。该诊断将指出哪个(如果存在)治疗干预是有用的，并且应当使用。
心肌活检(或心脏活检)是入侵性程序，其中将例如活检刀(在末端带有抓取装置的小导管)用于获得可以分析的小块心肌组织。心肌活检可以用于评价心脏移植排斥和诊断心肌炎(心脏的炎症)。
尽管熟练的医师知道使用导管进行心肌活检的基础实验方案，其实质上包括以下内容：使用局部麻醉以使患者的颈部或腹股沟麻木；医师将塑料导入器外壳(短的、中空的管子，通过其来放置导管)插入麻木部分的血管中；通过外壳插入活检刀并穿至患者的右心室；并且使用活检刀的抓取装置从心脏收集样品。在该程序的过程中，通常使用x-射线相机来正确地放置活检刀。样品大约为针头大小。收集足够数量的样品时，取出导管并通过紧压来控制局部的出血。
已经常规地测量了心肌事件后血流中的某些蛋白，以预测和诊断心肌是否受到损伤以及损伤的程度。这些蛋白包括，但不限于，肌酸激酶和肌钙蛋白。检测血流中这些和其他蛋白的特异性亚型是蛋白从心肌中释放出来的诊断，并因此是损伤的诊断。血清中这些指示蛋白的检测通常用于怀疑其中为心脏事件的急性情况中，并且已经证明了在确定用于患者的最佳治疗中是有用。尽管在急性情况中是有用的，但在心脏事件后超过几天的血流中心脏蛋白水平在诊断或预测心力衰竭中是没有价值的，它们在确定心脏病的病因学或正确的治疗过程中也没有任何价值。因为血液中的心脏蛋白水平没有升高，除了心脏事件后即刻。
相反，本发明描述了心肌活检来预测哪些患者响应保护心脏的、恢复心脏的和其他心力衰竭治疗的用途。预测哪些患者将响应这些治疗将通过促进确保正确的患者接受特异性治疗来改善治疗，并显著地限制了接受具有很少价值并因此只将患者暴露于潜在的严重副作用风险中的治疗的患者数量。因此，心肌活检和某些蛋白含量的测定可以证明哪些患者正在响应某些治疗和应当对哪些患者持续治疗。
在此呈现的数据表明，如所预测的，心脏攻击后即刻，可以检测血流中的某些蛋白，包括肌酸激酶和肌钙蛋白。该数据还证明了可以测量取自在血流中的心脏蛋白已经恢复至正常的低水平很久以后的心肌样品的心肌蛋白的稳定下降。这些数据还表明用神经调节蛋白治疗衰弱的心脏可以防止减退期并恢复患病心脏的心脏蛋白含量。这种恢复与提高的存活和心脏生理学相关。
此外，这些数据证明神经调节蛋白可以恢复损伤后心肌的肌钙蛋白含量。肌钙蛋白是心脏收缩性能必需的关键蛋白。因此，肌钙蛋白含量的恢复对于恢复正常的心脏生理学是重要的。心肌活检中心肌肌钙蛋白含量测量来确定降低的肌钙蛋白心肌含量是否是降低的心脏功能的组成部分的用途将帮助预测哪些患者可以响应心脏恢复性治疗，如给药神经调节蛋白。此外，心肌肌钙蛋白含量测量可以用作确定哪些患者响应心脏恢复性治疗如神经调节蛋白的测试。知道患者何时顺利地响应治疗将帮助预测这样的患者是否以及何时应当再次治疗、观察或停止治疗。心肌肌钙蛋白含量测量可以用来优化给予待使用心脏恢复性治疗来治疗心脏病的个体患者的剂量。相似地，在其中发生心肌肌钙蛋白水平持续下降的慢性疾病状态中，心肌肌钙蛋白水平的维持可以表示心脏保护性治疗的成功，如正发生着的疾病存在下的神经调节蛋白。以这种方式，心肌肌钙蛋白水平相似地可以用于预测对治疗的响应和给药剂量的优化。
对于GGF2或神经调节蛋白的EGFL结构域的给药剂量，例如，最初可以为约100mg/kg和基于患者响应滴定至较高水平的给药剂量，包括患者心脏组织中cTnI和cTnT胞内水平的测定。
一旦分离，可以通过在此提供的实施例中所述的和本领域已知的方法来确定心脏组织中的cTnI和cTnT胞内水平。例如，可以使用各种技术(包括但不限于免疫印迹分析，酶联免疫吸附测定法(ELISA)和质谱)分析分离的心脏组织的细胞裂解物和从其产生的沉淀物。实际上，已经研发了ELISA实验方案以利用高亲和性的、心脏特异性的抗体(M11.7)来检测心脏特异性肌钙蛋白T。该测定的检测极限低于使用交叉反应抗体1B10的第一代ELISA实验方案的检测极限(分别为0.0123μg/L与0.04μg/L)。
检测体内肌钙蛋白I和T水平的方法
分子成像领域中的技术进展使得非入侵的、高分辨率的体内成像技术成为可能，该技术能够使医师在分子和细胞水平诊断和评价治疗功效。实际上，术语分子成像“广义地被定义为细胞和分子水平的生物过程的体内表征和测量”。参见Weissleder等(Radiology219:316-333，2001)，在此将其整体引入作为参考。核成像，例如，其包括正电子发射断层扫描(PET)，微PET，单正电子发射计算化断层扫描(SPECT)和平面成像，通常包括使用作为检测探针的特异性放射性药物来观察内源和表达的蛋白质。例如，PET能够产生三维图像和体内功能过程的图谱，这有助于细胞内的细胞成分和分子相互作用的实时分析。PET可以用作医学和研究工具。关于医学应用，其广泛用于临床肿瘤学中，使肿瘤成像和检测转移，以及用于各种脑病，尤其是与痴呆相关的那些脑病的临床诊断中。对患者进行重复PET分析的能力使熟练的医师能比较随着时间的结果，使得可以例如评价疾病进展和选定的治疗方案的功效。PET也已经用作研究工具，绘制正常的人脑和心脏功能的图谱。
备选的扫描方法包括x-射线计算化断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)、功能性磁共振成像(fMRI)和超声波。成像扫描如CT和MRI非常适于观察体内的器官解剖变化，而如上所述，PET扫描仪，如SPECT和fMRI，具有分辨率来检测分子水平的变化，甚至在解剖水平的变化明显之前。根据目标组织的类型和功能，成像扫描如PET通过使用呈现出不同吸收速率的放射性标记的分子探针来实现该目的。在各种解剖结构中区域血流的改变也可以利用PET扫描观测和定量。根据所用放射性同位素的相容性，以上扫描技术中的一些可以结合使用，使得提供更全面的信息，这提高了临床测定的准确度。以下将参照SPECT成像来讨论这。
如上所述，核成像技术，如PET、微-PET、SPECT和平面成像，涉及使用反射性药物作为检测探针来观察内源或表达的蛋白。编码胞内酶的成像标记基因和编码细胞表面蛋白或受体的成像标记基因已经被成功地用于各种实验系统中以在体内使特异性的分子成像。还可以通过标记表示特定胞内酶的水平和/或活性的副产物来测定胞内酶的活性。例如，PET和微PET使用正电子标记的分子，使代谢、细胞通讯和基因表达中所涉及的过程成像。分子成像技术描述于Kim(Korean J Radiology 4:201-210，2003)中，在此将其整体引入作为参考。
PET扫描中所用的放射性核素通常是具有短半衰期的同位素，如11C(～20分钟)，13N(～10分钟)，15O(～2分钟)和18F(～110分钟)。将这些放射性核素引入通常被身体利用的化合物中，如葡萄糖、水或氨，然后注射至体内，以追踪它们的分布。将这样标记的化合物称为放射性示踪剂。这些放射性示踪剂的短半衰期限制了临床PET主要使用用18F标记的示踪剂，其具有110分钟的半衰期，并可以在使用前转运合理的距离，或限于使用82Rb，其可以在便携式产生器中形成并用于心肌灌注研究。
SPECT是使用γ射线的核医学断层扫描成像技术的实例。与使用γ相机的常规核医学平面成像非常相似。然而，与平面成像不同，SPECT可以提供真实的3D信息。通常作为穿过患者的截面切片来呈现该信息，但对于呈现可以按照需要来改变。通过γ相机成像获得的图像是放射性核素3-维分布的2-维图。因为SPECT获取与平面γ相机成像非常相似，相同的放射性药物可以用于任一种实验方案。如果使用可替换类型的核医学扫描来检查患者，例如，但图像是非诊断性的，可以使用SPECT进行随后的成像扫描，通过重新装配相机，用于SPECT图像获取，同时将患者保持在桌上或将患者移动到SPECT仪器上。
SPECT还可以用于心脏门控获取。为了获得关于心脏在其周期的各个部分的差别信息，可以使用门控心肌SPECT来获得心动周期的各个部分过程中关于心肌灌注、厚度和心肌收缩性的定量信息。还用于帮助计算左心室射血分数、搏出量和心输出量。
心肌灌注成像(MPI)是功能性心脏成像的实例，其用于诊断缺血性心脏病。其基于以下的原理：受损的或患病的心肌接受比应力条件下正常心肌少的血流。简而言之，给予心脏特异性放射性药物，例如，99mTc-替曲膦(MyoviewTM，GE healthcare)或99mTc-甲氧异腈(Bristol-Myers Squibb)，在该给药后，将心率升高来诱导心肌应力。根据标准实践，提高的心率通常是锻炼诱发的或使用腺苷、多巴酚丁胺或潘生丁药物引发的。应力诱发后进行的SPECT成像揭示了放射性药物的分布，并且因此揭示了心肌不同部位的相对血流。通过将应力图像与随后在休息时获得的一组图像比较来进行诊断。
因为肌钙蛋白是细胞骨架和酶的结构组分，因此预见分子成像技术能在体内测量胞内cTnI和cTnT水平。
实际上，心脏肌钙蛋白T以高浓度存在于肌细胞中，同时在胞内和结构上结合的蛋白集合中。胞内集合占据6％，而肌原纤维中的含量对应于心肌细胞中总肌钙蛋白T质量的94％。鉴于肌细胞中通常存在的高水平，标记肌钙蛋白T的任一个或两个集合将产生足够的用于观察的信号，具有合理的准确度和分辨率。
一种设想用于观察体内心脏组织中肌钙蛋白复合物的潜在方法利用了该复合物的钙(Ca2+)结合特性。已知横纹肌中的收缩通过Ca2+与肌钙蛋白(Tn)结合来启动，更特别的通过Tn的Ca2+结合亚基(TnC)来启动，其导致肌球蛋白结合肌动蛋白，产生力并收缩。通过肌动蛋白丝上的肌球蛋白结合位点的可用性来调节力的水平，肌动蛋白丝通过肌动蛋白表面上的原肌球蛋白(Tm)的位置来控制。Tn的抑制亚基(TnI)在Ca2+不存在下结合肌动蛋白，锚定Tm，使得抑制肌球蛋白结合。当Ca2+结合TnC时，其诱导强烈的TnI-TnC相互作用并削弱TnI-肌动蛋白相互作用，导致提高的Tm可动性和肌动蛋白上强烈的肌球蛋白结合位点的暴露。此外，肌球蛋白结合肌动蛋白导致交联桥形成，认为这进一步从阻断位置中置换出Tm，并且是骨骼肌中肌动蛋白丝的最大激活所需的。
鉴于以上的特性，熟练的医师将会想象使用Ca2+放射性核素来观察体内心脏组织中的细胞骨架成分，并且更特别地，观察肌钙蛋白水平。或者，可以用放射性核素标记特异性识别cTnI或cTnT的小分子并给予患者来观察这些蛋白的胞内水平。熟练的医师将预见各种标记的探针在本发明方法中的实用性，包括配体、抗体和cTnI或cTnT的底物和/或与cTnI或cTnT反应的蛋白。
如USPN5,324,502中所述那些的放射性核素也可以用于本发明方法的优势中，用于使心肌组织成像。如USPN5,324,502中所述的，通过形成放射性金属离子与金属螯合配体的亲脂性、阳离子的复合物来制备这样的放射性药物，金属螯合配体含有三胺和四胺的Schiff碱加合物，带有任选取代的水杨醛。这些亲脂性、阳离子的放射性复合物在心肌组织中呈现出高吸收和保持力。可以将根据本发明的优选镓-68(III)复合物用于使心脏成像，使用正电子发射断层扫描。在本发明的一个方面中，这样的放射性药物可以用作将结合肌钙蛋白的药剂的摄入靶向心脏组织的工具。
药物组合物
本发明还提供药物组合物。这样的组合物含有治疗有效量的药剂和药物学上可接受的载体。在特定的实施方案中，术语“药物学上可接受的”表示由联邦政府或洲政府的管理机构批准或列于美国药典或其他公认的药典中，用于动物中，更特别地用于人中。术语“载体”指的是与治疗剂一起给予的稀释剂、助剂、赋形剂或载体。这样的药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当将药物组合物静脉内给药时，水是优选的载体。盐水溶液以及含水葡萄糖和甘油溶液也可以用作液体载体，特别是用于注射液。
合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳浊液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、持续释放制剂等的形式。可以将组合物配制成栓剂，使用传统的粘合剂和载体，如甘油三酯。口服制剂可以包括标准载体，如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的实例描述于E.W.Martin的“Remington’s Pharmaceutical Sciences”中，在此将其整体引入作为参考。这样的组合物含有治疗有效量的化合物，优选纯化形式的，与合适量的载体一起，使得提供适于给予患者的形式。制剂应当适合给药方式。
在特定的实施方案中，根据常规程序将组合物配制成适于静脉内给予人的药物组合物。通常，用于静脉内给药的组合物是无菌等渗含水缓冲液中的溶液。在需要的情况中，组合物还可以包括增溶剂和局部麻醉剂，如利多卡因，以减轻注射部位的疼痛。通常，在单位剂型中分开或混在一起提供各种成分，例如，作为密封容器中干燥的冻干粉末或无水浓缩物，密封容器为表明活性剂含量的安瓿或小药囊。在通过输液给予组合物的情况中，可以用含有无菌药物级水或盐水的输液瓶将其分配。在通过注射给予组合物的情况中，可以提供无菌注射水或盐水的安瓿，使得在给药之前将成分混合。
本发明的化合物可以配制成中性或盐的形式。药物学上可接受的盐包括用游离氨基形成的那些和用游离羧基形成的那些，游离氨基如源自盐酸、磷酸、醋酸、草酸、酒石酸等的那些，游离羧基如源自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、异丙胺、三乙胺、2-乙胺基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。
可以基于本发明的描述通过标准临床技术来确定在治疗心脏损伤中有效的本发明化合物的量。此外，可以任选使用体外测试来帮助鉴定最佳剂量范围。制剂中使用的精确剂量还将取决于给药途径和疾病或障碍的严重性，并且应当根据医师的判断和每位患者的情况来决定。然而，用于静脉内给药的合适剂量范围通常为约20-500微克活性化合物/公斤体重。对于鼻内给药的合适剂量范围通常为约0.01pg/kg体重至1mg/kg体重。栓剂通常含有0.5％至10％重量范围的活性成分；口服制剂优选含有10％至95％活性成分。有效剂量可以从剂量响应曲线推断出来，剂量响应曲线从体外或动物模型测试系统获得。
各种递送系统是已知的并可以用于给药本发明的化合物，例如，脂质体中的包囊、微粒、微胶囊、能够表达化合物的重组细胞、受体介导的胞吞作用(参见，例如，Wu和Wu(1987)J.Biol.Chem.262:4429-4432)，以及作为逆转录病毒或其他载体的一部分的核酸的构建。引入的方法可以是经肠或非肠道的，并包括但不限于皮层内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。可以通过任何方便的途径来给药化合物，例如，通过输液或弹丸注射，通过上皮或粘膜与皮肤内层吸入(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)，并可以与其他生物活性剂一起给药。给药可以是全身的或是局部的。此外，理想的是通过任何合适的途径将本发明的药物组合物引入中枢神经系统中，包括心室内和鞘内注射；可以通过心室内导管，例如，连接存储器(如Ommaya存储器)的导管，来促进心室内注射。还可以使用肺部给药，例如，通过使用吸入器或喷雾器，并使用雾化剂来配制。
在具体的实施方案中，可能期望局部给予本发明的药物组合物，例如，通过外科手术过程中的局部输液，局部应用，例如，通过注射，通过导管，或通过植入物，所述植入物是多孔、无孔或凝胶状材料，如sialastic膜，或纤维。
在另一个实施方案中，可以在载体(特别是脂质体)中递送化合物或药剂(参见Langer(1990)Science 249:1527-1533；Treat等，见Liposomes in the Therapy ofInfectious Disease and Cancer(传染病和癌症治疗中的脂质体)，Lopez-Berestein和Fidler(编辑)，Liss，纽约，pp.353-365(1989)；Lopez-Berestein，同上，pp.317-327；总地参见同上)。
在再一个实施方案中，可以在受控释放系统中递送化合物或药剂。在一个实施方案中，可以使用泵(参见Langer，同上；Sefton(1987)CRC Cri t.Ref.Biomed.Eng.14:201；Buchwald等(1980)Surgery88:507；Saudek等，1989，N.Engl.J.Med.321:574)。在另一个实施方案中，可以使用聚合材料(参见Medical Applications of Controlled Release(受控释放的医学应用)，Langer and Wise(编辑)，CRC Pres.，Boca Raton，Florida(1974)；Controlled Drug Bioavailability(受控药物生物利用率)，Drug Product Design andPerformance(药品设计和性能)，Smolen和Ball(编辑)，Wiley，纽约(1984)；Ranger和Peppas，J.，1983，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61；还可以参见Levy等(1985)Science 228:190；During等(1989)Ann.Neurol.25:351；Howard等(1989)J.Neurosurg.71:105)。在再一个实施方案中，可以在治疗靶(即，受损心脏)附近放置受控释放系统，从而只需要全身剂量的一部分(参见，例如，Goodson，见Medical Applications of ControlledRelease(受控释放的医学应用)，同上，vol.2，pp.115-138(1984))。其他受控释放系统在Langer的综述中有讨论(1990，Science249:1527-1533)。
除非另外限定，在此所用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同意义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用与在此所述的那些相似或等价的任何方法和材料，但现在将描述特定的方法和材料。在此提及的所有出版物都在此引入作为参考，用来公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。
实施例1
本发明人之前已经报道了GGF2(重组神经调节蛋白-1)提高了阿霉素处理的小鼠的存活和心脏功能。如在此所述的，本发明人已经在体内和体外心肌细胞中研究了GGF2是否防止阿霉素诱导的心脏肌原纤维损耗。在此呈现的结果已经导致产生了新发现：特定心脏蛋白的胞内表达水平是有用的正常心脏功能的指示。更具体地，本发明人已经发现了完整心脏组织中心脏肌钙蛋白I(cTnI)和心脏肌钙蛋白T(cTnT)的胞内水平变化可以用作心脏损伤的指示。在本发明的特定方面中，已经表明完整心脏中胞内cTnI和cTnT水平的降低是鉴定处于心脏损伤风险中或正在经历心脏损伤的患者的有用诊断标记。然后给这些患者选择如在此所述的合适的预防或治疗干预。完整心脏组织中胞内cTnI和cTnT水平的测定还可以用来有利于评价正在进行的治疗干预的功效，因为正常胞内cTnI和cTnT水平的恢复可以作为正在改善心脏功能或恢复正常心脏功能的治疗的阳性指示。
材料和方法
材料
C57BL/6小鼠和Wistar大鼠获自Charles River实验室。阿霉素获自Bedford实验室。神经胶质生长因子2是Acorda Therapeutics,Inc.赠予的。MG132，放线菌酮和放线菌素获自Sigma。LY294002和PD98059来自Cell Signalling Technology。抗体获自以下卖方：肌钙蛋白I、GATA4和Nkx2.5来自Santa Cruz Biotechnology；α-横纹肌肌动蛋白、肌钙蛋白T、肌钙蛋白C、原肌球蛋白和心脏肌钙蛋白T来自Abcam；肌间线蛋白和α-辅肌动蛋白来自Sigma，心脏肌钙蛋白I来自GeneTex。MEM、Hank氏溶液和胎牛血清获自Invitrogen。用于细胞培养的所有其他试剂获自Sigma。
动物模型
将八至十周大的C57BL/6雄性小鼠用于分析，其中将心脏样品分离。将亚急性阿霉素心脏毒性模型用于该研究。用单剂量的阿霉素(20mg/kg，i.p.)处理小鼠。在阿霉素处理之前二十四小时、处理当天和处理后每天，用GGF2(0.75mg/kg，s.c.)或安慰剂(用于GGF2的配制缓冲液)处理小鼠。在阿霉素处理后4.5天，将小鼠处死。收集心脏样品(n＝3-4/组)，并在液氮中急冻。
关于那些其中测量了心脏功能的分析(如以下所详述的)，用单剂量的阿霉素(20mg/kg，i.p.)处理三个月大的C57BL/6小鼠。在阿霉素处理之前一天和阿霉素处理之后每天一次，将神经胶质生长因子2(GGF2-Dox，0.75mg/kg，s.c.，n＝74)或安慰剂(用于溶解GGF2的缓冲液，安慰剂-Dox，n＝73)注射至小鼠中。将没有用阿霉素处理的小鼠用作对照(n＝20)。在阿霉素处理后四天和两周，通过直接左心室(LV)插管来测定心脏功能。通过Kaplan-Meier方法分析两周存活。
新生心肌细胞培养
按照之前所述的(Okoshi等，Journal of Cardiac Failure.2004；10:511-518)，将新生心肌细胞解离。简而言之，将来自第0天-第3天Wistar大鼠的心室在胰蛋白酶和DNA酶II中解离。将细胞洗涤并预先涂布于100mm培养皿中含有5％胎牛血清的MEM中。30分钟后，将肌细胞悬浮于含有0.1mmol/L溴脱氧尿苷的相同培养基中，然后以500-1000细胞/mm2的密度涂布在100mm培养皿中。解离后四十八小时后，将培养基变成含有0.1％BSA的无血清MEM，并在刺激前培养过夜。
NRG1改善了阿霉素处理的小鼠的存活和心脏功能。
本发明的结果揭示了阿霉素处理后两周，与未处理的对照小鼠相比较，阿霉素处理的小鼠的存活明显下降。然后，与安慰剂处理的小鼠(Dox-安慰剂)相比，使用NRG1的伴随处理(Dox-NRG1)明显提高了阿霉素损伤小鼠的存活(图1A)。在阿霉素注射后五天进一步测定心脏功能，在该时间点，在阿霉素处理的小鼠中，存活开始下降。如表1中所示的，与对照(未处理)小鼠相比，在Dox-安慰剂和Dox-NRG1小鼠中，体重(BW)、心脏重(HW)和左心室重(LVW)都明显下降。与对照小鼠相比，Dox-安慰剂小鼠中通过胫骨长标准化的HW和LVW(HW/TL和LVW/TL)明显下降。然而，这些指标在Dox-NRG1和对照小鼠之间没有差异。与对照相比，Dox-安慰剂小鼠中的LV收缩压(LVSP)、心脏输出和dP/dt分钟明显下降。相反，在Dox-NRG1小鼠和对照小鼠之间，心脏功能的这些指示没有明显差异，表明与安慰剂处理的小鼠(Dox-安慰剂)相比，NRG1(Dox-NRG1)处理的小鼠心脏收缩功能的改善。还测定了血清肌酸激酶(CK)水平(心脏损伤的指标)来提供另外的心脏功能读出。如图1B中所示的，与对照小鼠相比，Dox-安慰剂和Dox-NRG1小鼠中的CK水平明显提高。然后，与Dox-安慰剂小鼠相比，Dox-NRG1小鼠中的CK水平明显下降。这些结果证明了NRG-1处理显著改善了阿霉素损伤小鼠中的存活和心脏收缩功能。
表1.Dox+安慰剂和Dox+NRG1处理的C57BL/6小鼠中血液动力学测量
*p<0.05；相对于对照p<0.01
NRG1缓解了体内心肌细胞中阿霉素诱导的cTnI和cTnT的下调。
阿霉素诱导的心脏毒性的一种机制是心脏肌原纤维的损失。如在此所述的，本发明人研究了体内NRG1注射是否抑制了阿霉素诱导的肌原纤维损失。在此呈现的结果证明心脏结构蛋白、α-横纹肌激动蛋白、α-辅肌动蛋白、肌钙蛋白T(TnT)、肌钙蛋白I(TnI)、肌钙蛋白C(TnC)和原肌球蛋白的水平在阿霉素处理的心脏中明显下降。体内NRG1注射明显提高了阿霉素损伤的心脏中cTnI、cTnT和cTnC的蛋白水平(图1C)，但对α-横纹肌激动蛋白、α-辅肌动蛋白和原肌球蛋白的蛋白水平没有作用。
NRG1消除了体外心肌细胞中阿霉素诱导的cTnI和cTnT蛋白的下调。
为了进一步研究NRG1如何抑制阿霉素诱导的cTnI和cTnT下调的机制，本发明人使用新生大鼠心肌细胞培养物(NRCM)进行了体外研究。如图2A中所示的，阿霉素明显降低了NRCM中cTnI和cTnT的蛋白水平；然而，NRG-1的存在维持了这些蛋白在阿霉素处理的细胞中的水平。这些结果进一步证明了通过erbB2、PI 3K、Akt、mTOR或ERK的抑制剂阻断了NRG1的这些作用(图2B和2C)，但没有受到erbB4(图2B)、p38或PKC的抑制剂的阻断。即时的结果还表明放线菌酮(蛋白翻译抑制剂)阻断了NRG1的预防性和/或恢复性作用(图2D)，但没有受到放线菌素D(转录抑制剂)的阻断。Z-VAD(pan-天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂)和MG132(蛋白酶体抑制剂)消除了阿霉素诱导的cTnI和cTnT的下调(图2D)，但没有被巴佛洛霉素A1(溶酶体抑制剂)消除。
NRG1抑制了体外心肌细胞中阿霉素诱导的cTnI和cTnT的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶和蛋白酶体降解。
细胞中蛋白水平的维持是一个动态过程。其取决于蛋白的合成和降解速率。本发明人研究了阿霉素降低cTnI和cTnT的蛋白水平的机理，以确定是否通过提高降解和/或通过降低合成引起了这种作用以及NRG1是否阻断了阿霉素这种作用中的任一种。
为了研究NRG1是否抑制了阿霉素诱导的cTnI和cTnT的caspase降解，本发明人首先鉴定了引起阿霉素诱导的cTnI和cTnT降解的特异性天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶。如图3A中所示，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-6或天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-9(内在途径)的抑制剂阻断了阿霉素诱导的cTnI和cTnT的下调。此外，通过天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-10(内在途径)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-2、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-13或天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-5的抑制剂阻断了cTnI的下调。另一方面，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-2和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-13还阻断了cTnT的下调。本发明人随后测试了是否阿霉素激活了和是否NRG1抑制了这些天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的激活。体外天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶激活测试揭示了阿霉素明显提高了天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3、6和9以及天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-10、2和5的激活。心肌细胞的NRG1处理显著抑制了阿霉素诱导的这些天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的激活(图3B)。PI3K抑制剂LY294002消除了NRG1的这些作用。本发明人进一步证明了阿霉素诱导了提高的细胞色素c释放至NRCM的细胞溶质中。然而，NRG1处理抑制了阿霉素的这一作用(图3C)。该结果，结合天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3、6和9激活的发现，表明阿霉素提高了线粒体外膜渗透性，其负责天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3、6和9的激活，而NRG1阻断了阿霉素的这些作用。这些结果证明了NRG-1抑制了阿霉素诱导的内在和外来天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶激活的激活，这至少部分引起了cTnI和cTnT的降解。
本发明人进一步证明了阿霉素诱导的cTnI的下调受到MG132的阻断(图2D)。简而言之，本发明人研究了是否阿霉素提高了cTnI的蛋白酶体降解和是否NRG1阻断了这种作用。如图3D中所示，阿霉素提高了cTnI的遍在化；NRG1处理消除了阿霉素的这种作用。该结果证明了NRG1提高了阿霉素诱导的cTnI的蛋白酶体降解。
NRG1缓解了体外心肌细胞中阿霉素诱导的cTnI和cTnT合成的降低。
为了进一步测试阿霉素是否降低了cTnI和cTnT的转录和NRG1是否逆转了阿霉素的这种作用，测量了Dox-安慰剂和Dox-NRG1处理的心肌细胞中这些蛋白的mRNA水平。如图4A中所示的，阿霉素降低了cTnI和cTnT两者的mRNA。另一方面，NRG1维持了阿霉素处理的心肌细胞中cTnI和cTnT的mRNA水平。此外，NRG1维持了GATA4的mRNA水平，并略微提高了MEF2c和Nkx2.5的mRNA水平(图4A)，其对于心脏特异性基因转录是重要的转录因子。
本发明的结果显示了NRG-1对cTnI和cTnT的作用受到了放线菌酮的阻断(图2D)，表明NRG1提高了这些蛋白的翻译。我们确定了Dox-安慰剂和Dox-NRG1处理的心肌细胞中几个转录机制和相关信号传导途径的激活。如图4B中所示的，处理后48小时，Dox-安慰剂处理的心肌细胞中的mTOR(Ser 2448)、P70S6K(Thr421/Ser424)、S6(Ser240/244)和eIF4G(Ser1108)的磷酸化水平降低，而在Dox-NRG1处理的心肌细胞中得到了维持。LY294002阻断了NRG-1的这些作用。这些结果表明NRG通过PI3K维持了阿霉素处理的心肌细胞中蛋白翻译机制的激活，这可能负责维持cTnI和cTnT的蛋白水平。
这些结果证明了NRG1通过多个机制缓解了阿霉素诱导的cTnI和cTnT的下调，这些机制包括内在和外来天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶激活以及炎症激活的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的抑制，cTnI遍在化的抑制以及转录的提高和翻译信号传导和机制的激活。这些结果还表明PI3K对于NRG1在维持心肌细胞中的cTnI和cTnT起了主要作用。
为了进一步研究PI3K在介导体内NRG1的心脏保护性效应中的作用，本发明人使用了转基因小鼠，该小鼠带有显性阴性PI3K的心肌细胞特异性超表达，并如上所述用阿霉素处理它们。如图5A中所示的，与WT-Dox-安慰剂小鼠相比，dnPI3K-Dox-安慰剂小鼠中的存活率下降。NRG1(WT-Dox-NRG)处理改善了阿霉素损伤的WT(WT-Dox-安慰剂)小鼠中的存活(67％与33％)。令人感兴趣的，这种提高的规模高于C57BL/6小鼠中所观察到的(图1A)。本发明的结果进一步表明了存活率的这种改善在阿霉素处理的dnPI3K小鼠中受到了抑制(dnPI3K-Dox-NRG:56％与WT-Dox-NRG:67％)。
还在这些小鼠中评价了心脏功能。如图5B中所示的，dnPI3K-Dox-安慰剂小鼠与dnPI3K对照相比比WT-Dox-安慰剂小鼠与WT小鼠相比，LVSP、dP/dt max和dP/dt分钟以及心输出量受到了更严重的抑制，表明dnPI3K-Dox-安慰剂小鼠中的心脏功能障碍更严重。
本发明人测量了阿霉素处理的WT和dnPI3K小鼠中的cTnI和cTnT蛋白水平。没有用阿霉素处理，WT和dnPI3K心脏中的cTnI和cTnT蛋白水平相似。阿霉素注射后两周，与未处理的dnPI3K心脏相比，在dnPI3K-Dox-安慰剂处理的心脏中观察到cTnI蛋白水平的下降。令人惊讶地，NRG1处理仍然消除了dnPI3K心脏中阿霉素诱导的cTnI下调(dnPI3K-Dox-NRG，图5C)。在这点上，与对照小鼠相比较，在阿霉素处理小鼠的心脏中没有观察到cTnT蛋白水平的变化。
这些结果证明GGF2特异性地维持了阿霉素损伤心脏中的TnT和TnI蛋白水平。此外，这些发现表明GGF2提高了阿霉素处理小鼠的存活，并且这与心脏功能的改善相关，如在用阿霉素和GGF2两者处理的小鼠中明显可见的。
尽管以上已经描述和具体地举例说明了本发明的某些优选实施方案，但不打算将本发明限制于这样的实施方案。可以对其进行各种改变，而不脱离如以下权利要求书中所示的本发明的范围和精神。

Claims (8)

1.包含治疗有效剂量的神经胶质生长因子2(GGF2)的组合物在制造用于恢复有此需要的受试者中损伤后心肌的肌钙蛋白含量的药物中的用途，其中受试者显示出心肌中的心脏肌钙蛋白T(cTnT)或心脏肌钙蛋白I(cTnI)的胞内水平降低的迹象并且其中受试者的心肌中的cTnT或cTnI蛋白的胞内水平相对于心肌对照样品的胞内水平的至少50％的降低表示受试者的心脏损伤。
2.权利要求1的用途，其中通过确定心脏功能正常的受试者的心肌中的cTnT或cTnI蛋白的胞内水平来建立心肌中的cTnT或cTnI蛋白的对照胞内水平。
3.权利要求1的用途，其中心脏损伤是心脏毒性、高血压、瓣膜障碍、心肌梗塞、病毒性心肌炎或硬皮病的结果。
4.权利要求3的用途，其中心脏毒性是由化疗剂、辐射或非治疗性的休闲类药剂引起的。
5.权利要求1的用途，其中通过在能够引起心脏损伤的治疗开始之前确定受试者心肌中的cTnT或cTnI蛋白的胞内水平来建立心肌中的cTnT或cTnI蛋白的对照胞内水平。
6.权利要求1的用途，其中受试者是哺乳动物。
7.权利要求6的用途，其中哺乳动物是人。
8.权利要求1的用途，其中组合物进一步包含蛋白酶体抑制剂。
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