CN117603313A - 一种小肽及其在制备治疗阿尔兹海默症药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种编码30个氨基酸的小肽，其序列如SEQ ID NO:1所示。该小肽特异性作用于P25蛋白，抑制P25蛋白与CDK5激酶的结合，降低CDK5激酶催化的Tau磷酸化，减少Tau蛋白过度磷酸化导致的神经纤维缠结并改善AD患者临床症状，在AD治疗方面具有很好的临床应用前景。

Description

一种小肽及其在制备治疗阿尔兹海默症药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种用于治疗阿尔兹海默症的小肽，属于生物医药领域。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种常见的与年龄相关的、缓慢进展的神经退行性疾病。AD的两个特征性病理分别为淀粉样蛋白Aβ的细胞外沉积和Tau蛋白过度磷酸化导致的细胞内神经纤维缠结。据相关报道，AD发病率逐年上升且随着社会的老龄化不断加重，从而带来巨大的社会负担。

神经纤维缠结是AD的一个特征性病理。1906年就已经发现AD患者脑中有大量的神经元死亡现象，但直到1974年，人们才首次从AD患者的大脑中分离出神经纤维缠结，1985年首次发现这种错误缠结的原因是神经元上的Tau蛋白过度磷酸化导致。在正常人的大脑中，微管系统是神经元的骨架结构，Tau蛋白可以和微管蛋白结合，促进微管系统的形成。因此，Tau蛋白在维持神经元的正常形态和正常功能上发挥了重要的作用。Tau蛋白上有多个磷酸化位点，正常情况下，Tau蛋白通过磷酸化维持正常的生理功能。而在AD患者大脑中，Tau蛋白表现出过度磷酸化的现象，过度磷酸化的Tau蛋白难以与微管蛋白结合发挥正常功能，最终导致神经元的大量死亡并形成神经纤维缠结。

Tau蛋白有多个磷酸化激酶。其中，细胞周期蛋白依赖性激酶5(cyclin-dependentkinase 5，CDK5)被认为在AD病程中起到了关键作用。正常情况下，CDK5需要与其伴侣蛋白P35结合发挥激酶作用，该结合体半衰期较短；然而，在AD病理情况下，钙蛋白酶calpain被激活并将P35水解为一个分子量更小的蛋白P25，此时CDK5会与P25发生病理性的结合，该结合体半衰期被延长十倍以上。此时，CDK5过度磷酸化Tau蛋白，最终导致神经纤维缠结的发生。因此，如果能抑制CDK5和P25的结合，或者提高CDK5和P25复合体的降解速度，将有利于缓解Tau蛋白的过度磷酸化，从而起到治疗AD的作用。

近年来，基于蛋白降解靶向嵌合体(PROteolysis TArgeting Chimeras，PROTAC)技术而构建特异性的功能肽段并用于治疗各种神经疾病已经成为了研究的热点。PROTAC通常由三部分组成：E3连接酶结合域、靶蛋白结合域以及两者中间的连接片段。PROTAC肽段的作用原理为与靶蛋白结合后将其运送到细胞蛋白酶体部分进行降解，从而定向降低靶标蛋白含量。相对于传统的小分子药物，PROTAC具有易于穿透血脑屏障、易于和靶蛋白结合等优势。

CN 114736264 A公开了一种Tau蛋白可视化PROTAC降解化合物；CN 111518215 A公开了一种特异性降解Tau蛋白的嵌合体及其编码基因。在现有的相关文献中，PROTAC肽段均被设计为与Tau蛋白直接结合并使其通过蛋白酶体途径降解，由于没有特异性的靶向磷酸化的Tau蛋白，因此可能会造成正常Tau蛋白被降解，从而引起副作用。

发明内容

本发明的目的是提供了一种基于PROTAC技术而设计的新的小肽，该小肽能特异性与P25蛋白结合并诱导其降解，从而降低CDK5催化Tau磷酸化的水平，降低脑内磷酸化Tau蛋白并改善AD患者症状。

为实现上述目的，申请人通过计算机模拟设计出该小肽的序列为YGRKKRRQRRRLARAFGIPVRCYSAERRRG，它由三段序列组成，第一段是CDK5与P25的结合域肽段序列，第二段是穿膜肽序列，第三段是诱导泛素化降解肽段序列，三段序列通过有机合成的方式连接在一起。

分子对接结果显示，该小肽可以与P25蛋白特异性结合，并用稳转Tau的HEK-293细胞系进一步在体外验证了小肽与P25蛋白的结合能力。

接着，进行Morris水迷宫试验考察了小肽对AD模型动物P301S小鼠的作用，结果显示该小肽能显著改善P301S小鼠模型的认知和学习能力，对给药小鼠脑内的Tau蛋白磷酸化进行免疫检测，发现小肽可以显著降低P301S小鼠脑内多个位点的Tau蛋白磷酸化水平。

最后，为了确认小肽可以从外周血管穿过血脑屏障到达中枢神经系统，我们将肽段接上荧光标记物并对受试小鼠进行尾静脉注射，分别在不同时间点对动物进行活体成像观察。结果在小鼠脑部出现了明显的荧光信号，证明了该小肽具有穿透血脑屏障的能力。同时，从注射药物的小鼠体内取出肝脏、胃、肺脏和大脑进行成像观察，发现随着注射后时间的延长，小鼠各组织中的荧光信号逐渐消失，说明该小肽可通过体内代谢途径排出体外。

综上，本发明提供的小肽特异性作用于P25蛋白，抑制P25蛋白与CDK5激酶的结合，降低CDK5激酶催化的Tau磷酸化，减少Tau蛋白过度磷酸化导致的神经纤维缠结并改善AD患者临床症状，且能够穿透血脑屏障并通过体内代谢途径排出体外，具有很好的临床应用前景。

更详尽的技术方案参见具体实施例。

附图说明

图1是TPP肽的结构及其与P25蛋白的分子对接结果。

图2是TPP肽的HPLC色谱图。

图3是TPP肽的质谱图。

图4是TPP肽与稳转Tau的HEK-293细胞系作用后的免疫印迹实验及其分析结果，_★★P<0.01。

图5是四组小鼠的Morris水迷宫试验结果，图中，A是达到平台区域的时间；B是穿越平台的次数；C是在平台象限持续的时间，_★★P<0.01，_★★★P<0.005。

图6是各组小鼠在MWM平台中运动的典型轨迹图。

图7是P301S+Veh和P301S+TPP两组小鼠的脑部Tau蛋白位点磷酸化水平免疫印迹检测及分析结果，_★P<0.05，_★★P<0.01。

图8是P301S+Veh和P301S+TPP两组小鼠脑部CA3，DG和皮层区域的Tau蛋白Ser404位点磷酸化水平的免疫荧光检测结果，图中，A是免疫荧光染色照片；B是免疫荧光分析结果，_★P<0.05。

图9是小鼠尾静脉注射TPP肽荧光标记物后的活体成像图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不是用于对保护范围进行限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。实施例中未详细描述的实验方法，可为本领域常规操作或按工具书如《药理实验方法学》等予以实施。

关键材料来源及其说明：

TPP肽：由江汉大学武汉生物医学研究院进行合成。

HEK-293细胞：人胚肾细胞，本试验所使用的细胞表达稳转的Tau基因，由江汉大学武汉生物医学研究院提供。

P301S小鼠：突变Tau蛋白转基因小鼠，在Tau相关疾病(包括阿尔茨海默病)研究中已得到广泛应用，由江汉大学武汉生物医学研究院提供。

C57小鼠：是P301S小鼠的背景鼠，可为突变基因提供遗传背景，由江汉大学武汉生物医学研究院提供。

其它未予说明的材料均为本领域常规材料。

实施例1肽段的合成与表征

通过查询UniProt数据库，得知CDK5与P25结合域肽段为LARAFGIPVRCYSAE，申请人将该肽段和穿细胞膜肽段YGRKKRRQRRR与诱导泛素化降解肽段RRRG通过有机合成的方式连接在一起，得到TPP肽(序列为YGRKKRRQRRRLARAFGIPVRCYSAERRRG，如图1A所示)。通过计算机模拟蛋白质-蛋白质对接结果，该肽段可以与P25蛋白特异性结合(如图1B所示)。

其中，穿细胞膜肽段的作用是诱导肽段穿过细胞膜磷脂双分子层，从而进入到细胞内部；PTM肽段的作用是诱导肽段发生泛素化修饰，然后通过蛋白酶体途径诱导P25降解。

将所设计的肽段进行人工合成，HPLC-MS联用对肽段进行结构表征，TPP肽的HPLC结果如图2所示，质谱数据如图3所示。

实施例2肽段的功效评价

1.TPP肽的体外功效评价

用稳转Tau的HEK-293细胞系在体外评价了TPP肽段与P25的结合能力。向培养了稳转Tau的HEK-293细胞孔板中分别加入0、50、150μM的TPP肽段。24小时后，收集细胞并提取蛋白。免疫印迹实验结果(图4A)表明，相对于对照组，50μM和150μM两个给药组的P25蛋白浓度均显著降低(图4B)，而P35蛋白浓度不受影响(图4C)。说明TPP肽段可以定向的降低细胞中P25蛋白含量，但不影响P35蛋白的含量。

2.Morris水迷宫试验

本实验中，将雄性6月龄AD模型动物P301S小鼠随机分成两组，每组15只，一组对小鼠每隔6天通过尾静脉注射20mg/Kg小鼠体重的TPP药物，设为P301S+TPP组；另一组每隔6天通过尾静脉注射相同量的生理盐水，设为P301S+Veh组。同时，将30只雄性6月龄C57小鼠也随机分成两组，每组15只，一组对小鼠每隔6天通过尾静脉注射20mg/Kg小鼠体重的TPP药物，设为C57+TPP组；另一组每隔6天通过尾静脉注射相同量的生理盐水，设为C57+Veh组。给药共持续一个月，之后，对四组小鼠进行测试。

(1)Morris水迷宫试验

Morris水迷宫是测试小鼠空间认知与学习能力的经典动物学实验平台。本实验中，将P301S+TPP，P301S+Veh，C57+TPP和C57+Veh四组小鼠给药后，通过Morris水迷宫(MWM)测试所有小鼠的认知能力。MWM由圆形水箱和平台组成，在五天的训练中，每只小鼠被从四个不同的象限放入迷宫中进行60s的自由探索，记录到达平台的逃避潜伏期。在探测测试当天，平台被拿走，将每只小鼠从平台的对角线区域放入迷宫中，进行60s的自由探索。记录小鼠在平台区域停留的时间和穿过平台区域的次数，所有行为测试数据均使用SuperMaze软件记录。

在前5天的训练中，4组小鼠的逃避潜伏期和游泳速度均没有显著差异。在第6天的探测测试中，P301S+TPP组小鼠找到平台区域的时间显著短于P301S+Veh组(图5A)。同时，P301S+TPP组小鼠穿越平台次数和在平台象限持续的时间均高于P301S+Veh组(图5B和图5C)。各组小鼠在MWM平台中运动的典型轨迹如图6所示。Morris水迷宫的结果显示所发明的TPP肽段显著改善了P301S模型小鼠的空间认知和学习能力。

(2)TPP肽降低了动物水平的Tau磷酸化

为了进一步验证TPP肽段可以减轻P301S小鼠脑内Tau蛋白磷酸化水平，通过免疫印迹和免疫荧光的方法检测了P301S+TPP和P301S+Veh两组小鼠脑内的Tau蛋白磷酸化水平。

免疫印迹的方法为：小鼠用异氟烷气体麻醉并安乐死，在冰上取出小鼠脑组织并分离出海马组织，用RIPA(强)裂解缓冲液提取海马的总蛋白。免疫印迹的方法为：通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离样本蛋白质，然后将蛋白立即转移至硝化纤维素(NC)膜上，使用5％脱脂牛奶在室温下封闭1小时，再将NC膜与相应的一抗孵育过夜，第二天，用TBST清洗NC膜3次后，用相应的带HRP标记的二抗室温孵育1小时，再用TBST清洗3次，最后，使用化学发光检测液对NC膜进行拍照以检测待测蛋白质的表达情况。

免疫荧光的方法为：小鼠用异氟烷气体麻醉并安乐死，在冰上取出小鼠脑部后，放入4％多聚甲醛中固定，用振动切片机(Leica VT1000S，Wetzlar，德国)将固定后的脑子切成切片(30μm)后，用磷酸盐缓冲溶液清洗3次，然后用含5％牛血清白蛋白的0.1％TritonX-100封闭切片，之后将脑切片与相应的一抗孵育过夜，第二天，用TBST清洗脑片3次后，在37℃下用有荧光标记的相应二抗孵育1小时，用TBST洗涤切片3次后，用Hoechst染色10分钟，并用PBS洗涤3次，最后用抗荧光猝灭剂密封切片，使用激光扫描共焦显微镜(LeicaSP8，德国)对脑片进行拍照分析。

实验结果如图7A所示，通过免疫印迹的手段检测，和P301S+Veh组小鼠相比，P301S+TPP组小鼠的脑部Tau蛋白Ser199位点和Ser214位点磷酸化均显著下降(图7B)。通过免疫荧光的方法对两组小鼠脑部CA3，DG和皮层区域的Tau蛋白Ser404位点磷酸化进行了染色，结果表明，和P301S+Veh组小鼠相比，P301S+TPP组小鼠的脑部Tau蛋白Ser404位点磷酸化在CA3和皮层区域显著下降(图8A和图8B)。综合上述结果，所发明的TPP肽段可以显著降低P301S小鼠脑内多个位点的Tau蛋白磷酸化水平。

3.动物活体成像

为了确认TPP肽段可以从外周血管穿过血脑屏障到达中枢神经系统，TPP肽段被接上了红色荧光标记物cy3。受试小鼠通过尾静脉注射TPP-cy3(注射剂量10mg/Kg小鼠体重)后，分别在2,4,6,8,12,24,48,96,120,144小时通过动物活体成像装置进行了拍照。结果如图9A所示，TPP经过尾静脉注射后，在小鼠脑部出现了明显的红色信号，证明了所发明的TPP肽段具有穿过血脑屏障的能力。同时，将注射TPP-cy3后经过6，36，144小时的小鼠安乐死，并取出肝脏、胃、肺脏和大脑分别进行拍照，结果如图9B所示，在注射后6小时和注射后36小时的小鼠肝脏、胃、肺脏和大脑样本中均检测到了红色信号，并能够在皮层和海马中检测到信号；而在注射后144小时的小鼠肝脏、胃、肺脏和大脑组织中均不能明显检测到红色信号，这说明TPP可经过代谢正常排出体外。

Claims (4)

1.一种小肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述的小肽在制备治疗阿尔兹海默症药物中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述小肽特异性作用于P25蛋白，抑制P25蛋白与CDK5激酶的结合，降低CDK5激酶催化的Tau磷酸化，减少Tau蛋白过度磷酸化导致的神经纤维缠结并改善AD患者临床症状。

4.一种治疗阿尔兹海默症的药物，该药物中含有权利要求1所述的小肽。