CN104592323A - 一种双水相萃取苹果渣中根皮苷的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种双水相萃取苹果渣中根皮苷的方法。该方法包括以下步骤：(1)将苹果渣匀浆后，加入乙醇的水溶液，搅拌提取，得提取液；(2)通过离心或减压过滤对所述提取液进行固液分离，收集上清液；(3)在所述上清液中加入无机盐的水溶液，形成双水相体系，搅拌萃取，静置分层后收集上层的乙醇相，减压蒸馏，收集馏出液，即得所述根皮苷。本发明在溶剂提取根皮苷并分离得到的上清液中，直接加入硫酸铵水溶液，形成双水相体系，简化操作，可省略浓缩步骤；与有机溶剂萃取相比，无有毒有机溶剂残留，无乳化现象，分相时间快，蛋白质及多糖含量减少一半以上，萃取液中根皮苷浓度较高，根皮苷粗提物纯度达到40％以上，有利于后期继续纯化。

Description

一种双水相萃取苹果渣中根皮苷的方法

技术领域

本发明涉及一种萃取根皮苷的方法，特别涉及一种从苹果渣中萃取根皮苷的方法。

背景技术

根皮苷(phlorizin)是根皮素(phloretin)的葡萄糖苷，属于二氢查尔酮类物质，具有抗氧化、降血糖、美白、预防骨质酥松等生理活性。因为根皮苷是钠依赖葡萄糖转运蛋白(SGLT)的靶向抑制剂，能够专一的、竞争性的抑制肾小管中SGLT1和SGTL2对葡萄糖的重吸收，从而降低体内血糖水平，因此，根皮苷的降血糖活性不依赖于胰岛素，且对Ⅱ型糖尿病及其并发症具有良好的防治效果。此外，根皮苷还是一种甜度较高的天然甜味剂，对糖尿病人是一种极好的糖类替代品。正因为根皮苷具备以上独特的功能与性质，使其在功能性食品、新型药物和化妆品开发中的用量逐年上升，欧美国家已经有用根皮苷作为先导化合物生产的药品上市，相比之下，我国对于根皮苷的开发比较缓慢。

根皮苷在1835年由法国化学家从苹果树皮中分离得到，此后在苹果树根、茎、叶以及苹果果实、皮渣中相继发现根皮苷的存在。近年来，在多穗石柯、荔枝皮与湖北海棠中也分离得到了根皮苷。根皮苷在苹果皮中含量较高。我国是世界第一大苹果生产国与消费国，苹果渣尤其苹果皮渣是主要加工副产物，其中蕴含丰富的根皮苷资源。目前除少量皮渣被用于生产果胶和饲料外，大量皮渣被遗弃，不仅造成资源浪费，而且严重污染环境。若能高效的从苹果皮渣中分离纯化根皮苷，不仅能够保护环境，更能变废为宝，推动产业中根皮苷的开发与利用。

目前，根皮苷的提取方法有水提法、醇提法及超声或微波辅助提取法，提取得到的根皮苷粗提物杂质含量高，根皮苷纯度低，还需进行进一步的纯化过程。萃取是根皮苷纯化过程中的常用步骤。例如专利名称为“从蔷薇科植物的皮根枝叶及榨汁废料中提取根皮苷的工艺(CN100463913C)”，“一种从锁阳中提取分离高纯度根皮苷的方法(CN103626811A)”，“一种从植物中高效提取根皮苷的方法(CN103864864A)均涉及到根皮苷的萃取。但这些萃取方法均采用有机溶剂萃取，例如乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷等，造成产品中有机溶剂残留，不利于根皮苷的开发利用；且有机溶剂萃取过程中乳化现象严重，分相时间较慢，不利于工业化连续生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种双水相萃取苹果渣中根皮苷的方法。该方法克服了现有萃取工艺的诸多不足，不仅能够使根皮苷与水溶性多糖分离，达到纯化根皮苷的目的，而且无有毒有机溶剂残留，萃取过程中无乳化现象，分相时间短，易于工业化连续生产。

本发明提供的一种双水相萃取苹果渣中根皮苷的方法，包括以下步骤：

(1)将苹果渣匀浆后，加入乙醇或乙醇的水溶液，搅拌提取，得提取液；

(2)通过离心或减压过滤对所述提取液进行固液分离，收集上清液；

(3)在所述上清液中加入无机盐的水溶液，形成双水相体系，搅拌萃取，静置分层后收集上层的乙醇相，减压蒸馏，收集馏出液，即得所述根皮苷。

上述双水相萃取根皮苷的方法，步骤(1)中，所述苹果渣为苹果经榨汁、过滤后剩余的苹果渣，包括但不仅限于苹果渣、苹果皮或苹果皮渣；

每1g所述苹果渣中可加入10～20mL所述乙醇或乙醇的水溶液，具体可加入10～15mL、15～20mL、10mL、15mL或20mL；

所述乙醇的水溶液中乙醇的体积浓度可为40～100％，，但不为100％，具体可为60％～80％、60％～70％、70％～80％、60％、70％或80％。

上述双水相萃取根皮苷的方法，步骤(1)中，所述提取的时间可为2h～4h，具体可为2h～3h、3h～4h、2h、3h或4h。

上述双水相萃取根皮苷的方法，步骤(2)中，所述离心的转速可为3000～10000rpm，具体可为5000rpm；所述离心的时间可为10～20min，具体可为15min。

上述双水相萃取根皮苷的方法，步骤(3)中，所述无机盐为氯化钠、硫酸铵、硫酸钠、碳酸钠、碳酸钾、磷酸钾、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾中的至少一种。优选硫酸铵

所述无机盐为硫酸铵，所述硫酸铵的水溶液中硫酸铵的质量体积浓度可为0.4g/mL～0.43g/mL，具体可为0.4g/mL或0.43g/mL。

上述双水相萃取根皮苷的方法，步骤(3)中，所述双水相体系中，所述乙醇的体积浓度可为31％～51％，具体可为36％～45％、36％～43％、43％～45％、36％、43％或45％；

所述无机盐的质量体积浓度可为0.12～0.24g/mL，具体可为0.12～0.16g/mL、0.16～0.24g/mL、0.12g/mL、0.16g/mL或0.24g/mL。

上述双水相萃取根皮苷的方法，步骤(3)中，所述搅拌萃取的时间可为10min～30min，具体可为10min～15min、15min～30min、10min、15min或30min。

上述双水相萃取根皮苷的方法，步骤(3)中，所述减压蒸馏在真空度低于0.09Mpa的条件下进行，具体可为0.085Mpa；

所述减压蒸馏的温度可为40～45℃，具体可为40℃～42℃、42～45℃、40℃、42℃或45℃。

本发明具有如下优点：

常规双水相萃取需要先对提取液进行浓缩，再加入配制好的双水相体系进行萃取，本发明研究了根皮苷参与下的乙醇/硫酸铵双水相体系相图，在此基础上，能够略去浓缩步骤，在溶剂提取根皮苷并分离得到的上清液中，直接加入硫酸铵水溶液，形成双水相体系，简化操作。同时，与有机溶剂萃取相比，本发明无有毒有机溶剂残留，无乳化现象，分相时间快，蛋白质及多糖含量减少一半以上，萃取液中根皮苷浓度较高，根皮苷粗提物纯度达到40％以上，有利于后期继续纯化。

附图说明

图1为根皮苷参与下的乙醇/硫酸铵双水相体系相图。

图2为实施例2中乙醇提取苹果渣中根皮苷的色谱图。

图3为实施例2中乙醇/硫酸铵双水相提取苹果渣中根皮苷的色谱图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中采用HPLC分析和检测根皮苷含量，分析条件为：C18柱；流动相A：乙腈；流动相B：水(含2％甲酸)；流速1.0mL/min；梯度洗脱程序为：0-15min(但不为0min)：20％A，80％B；15-17min(但不为17min)：30％A，70％B；17-18min(但不为18min)：80％A，20％B；18-20min(但不为20min)：20％A，80％B；20min：20％A，80％B。

实施例1、根皮苷参与下的乙醇/硫酸铵双水相体系研究

(1)乙醇/硫酸铵双水相相图的绘制：精确配制2mL的0.4g/mL的硫酸铵水溶液，缓慢滴加乙醇液体，并在漩涡混合器上混合，观察溶液的澄清程度，直至试管内溶液开始出现浑浊为止，记录乙醇的加入量，测量溶液体积并称重。加入0.1mL水，使溶液变澄清，再缓慢滴加乙醇直至溶液浑浊，如此反复操作，计算每次达到浑浊时，乙醇的体积浓度与硫酸铵的质量体积浓度。

(2)有根皮苷参与的乙醇/硫酸铵双水相相图的绘制：取10mL体积浓度为70％的乙醇溶剂的苹果皮渣提取液，缓慢滴加配制好的质量体积浓度为0.4g/mL的硫酸铵水溶液，并在漩涡混合器上混合，观察溶液的澄清程度，直至试管内溶液开始出现浑浊为止，记录滴加的硫酸铵水溶液的体积，再滴加0.5mL水，使溶液变澄清，再缓慢滴加硫酸铵水溶液，如此反复操作，计算每次达到浑浊时，乙醇的体积浓度与硫酸铵的质量体积浓度。

以硫酸铵的质量体积浓度为横坐标，乙醇的体积浓度为纵坐标，绘制双水相相图，见图1。当成相组分的配比在曲线的下方时，系统为均匀的单相，混合后溶液澄清透明，称为均相区；当配比在曲线的上方时，能自动分成两相，称为两相区；若配比在曲线上，混合后，溶液恰好由澄清变为浑浊。由图1看以看出，在根皮苷的参与下，乙醇/硫酸铵的双水相体系被改变，一些能够形成双水相的配比在根皮苷的参与下，并不能形成双水相。

实施例2、双水相萃取苹果渣中的根皮苷

(1)取10个苹果，洗净，除去果柄和萼片，切成小块，榨汁机榨汁，8层纱布过滤，滤渣为苹果渣。

(2)称取20g苹果渣，粉碎机粉碎匀浆，加入体积浓度为70％的乙醇的水溶液300mL，搅拌提取4h。

(3)收集上一步的提取液，5000rpm，离心15min后，收集澄清的上清液。取10μL上清液，过0.22μM微孔滤膜，采用HPLC分析根皮苷含量，实验结果见图2。

(4)在上一步离心获得的上清液中，加入180mL硫酸铵质量体积浓度为0.4g/mL的硫酸铵水溶液，形成双水相体系，其中，乙醇体积浓度为43％，硫酸铵的质量体积浓度为0.16g/mL，充分搅拌萃取10min，静置分层后，收集上相乙醇相，在温度40℃，真空度0.085MPa条件下，减压蒸馏回收乙醇，得到干燥根皮苷提取物产品，通过HPLC检测，采用面积归一法分析，根皮苷纯度为42.8％。结果见图3。

实施例3、双水相萃取苹果渣中的根皮苷

(1)取10个苹果，洗净，除去果柄和萼片，切成小块，榨汁机榨汁，8层纱布过滤，滤渣为苹果渣。

(2)称取20g苹果渣，粉碎机粉碎匀浆，加入体积浓度为80％的乙醇的水溶液200mL，搅拌提取2h。

(3)收集上一步的提取液，5000rpm，离心15min后，收集澄清的上清液。

(4)在上一步离心获得的上清液中，加入240mL硫酸铵质量体积浓度为0.4g/mL的硫酸铵水溶液，形成双水相体系，其中，乙醇体积浓度为36％，硫酸铵的质量体积浓度为0.24g/mL，充分搅拌萃取30min，静置分层后，收集上相乙醇相，在温度42℃，真空度0.085MPa条件下，减压蒸馏回收乙醇，得到干燥根皮苷提取物产品。通过HPLC检测，采用面积归一法分析，根皮苷的纯度为40.4％。

实施例4、双水相萃取苹果渣中的根皮苷

(1)取10个苹果，洗净，除去果柄和萼片，切成小块，榨汁机榨汁，8层纱布过滤，滤渣为苹果皮渣。

(2)称取20g苹果渣，粉碎机粉碎匀浆，加入体积浓度为60％的乙醇的水溶液400mL，搅拌提取3h。

(3)收集上一步的提取液，减压过滤后，收集澄清的上清液。

(4)在上一步过滤获得的上清液中，加入130mL质量体积浓度为0.43g/mL的硫酸铵水溶液，形成双水相体系，其中，乙醇体积浓度为45％，硫酸铵的质量体积浓度为0.12g/mL，充分搅拌萃取15min，静置分层后，收集上相乙醇相，在温度45℃，真空度0.085MPa条件下，减压蒸馏回收乙醇，得到干燥根皮苷提取物产品。通过HPLC检测，采用面积归一法分析，根皮苷的纯度为41.3％。

Claims (8)

1.一种双水相萃取苹果渣中根皮苷的方法，包括以下步骤：

(1)将苹果渣匀浆后，加入乙醇或乙醇的水溶液，搅拌提取，得提取液；

(2)通过离心或减压过滤对所述提取液进行固液分离，收集上清液；

(3)在所述上清液中加入无机盐的水溶液，形成双水相体系，搅拌萃取，静置分层后收集上层的乙醇相，减压蒸馏，收集馏出液，即得所述根皮苷。

2.根据权利要求1所述的双水相萃取苹果渣中根皮苷的方法，其特征在于：步骤(1)中，每1g所述苹果渣中加入10～20mL所述乙醇或乙醇的水溶液；

所述乙醇的水溶液中乙醇的体积浓度为40～100％，但不为100％。

3.根据权利要求1或2所述的双水相萃取根皮苷的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述提取的时间为2h～4h。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的双水相萃取根皮苷的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述离心的转速为3000～10000rpm，离心的时间为10～20min。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的双水相萃取根皮苷的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述无机盐为氯化钠、硫酸铵、硫酸钠、碳酸钠、碳酸钾、磷酸钾、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾中的至少一种；

所述无机盐为硫酸铵，所述硫酸铵的水溶液中硫酸铵的质量体积浓度为0.4g/mL～0.43g/mL。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的双水相萃取根皮苷的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述双水相体系中，所述乙醇的体积浓度为31％～51％，所述无机盐的质量体积浓度为0.12～0.24g/mL。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的双水相萃取根皮苷的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述搅拌萃取的时间为10min～30min。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的双水相萃取根皮苷的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述减压蒸馏在真空度低于0.09Mpa的条件下进行；

所述减压蒸馏的温度为40～45℃。