CN104587492A - 长链非编码rna分子snhg18在制备治疗脑胶质瘤的药物的应用 - Google Patents

长链非编码rna分子snhg18在制备治疗脑胶质瘤的药物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了长链非编码RNA分子SNHG18在制备治疗脑胶质瘤的药物的应用，尤其是在制备增强脑胶质瘤细胞辐射敏感性的药物的应用。本发明从lncRNA这个新视野为阐明恶性胶质瘤恶性增殖及放射抵抗的分子机制提供新依据与新思路，以及提供药物靶点方面提供了一定的应用价值。因此，可以将SNHG18用于制备治疗脑胶质瘤的药物，尤其是用于制备增强脑胶质瘤细胞辐射敏感性的药物。

Description

长链非编码RNA分子SNHG18在制备治疗脑胶质瘤的药物的应用
技术领域
本发明涉及长链非编码RNA分子SNHG18的新用途，尤其是涉及SNHG18在制备治疗脑胶质瘤的药物的应用。
背景技术
脑胶质瘤是人类最常见的颅内肿瘤。恶性脑胶质瘤治疗上采用综合疗法，包括手术切除、放射治疗及化学治疗等。大量临床研究表明，恶性脑胶质瘤术后辅以放射治疗可明显提高患者生存率，放疗在恶性胶质瘤的治疗中有重要地位。但是综合治疗后的恶性胶质瘤仍然极易复发，疗效难以令人满意。进一步探索提高恶性胶质瘤治疗的新机制和新途径是当前恶性胶质瘤研究的重要内容。
肿瘤放射治疗是一个多步骤、多阶段的复杂生物过程，每一阶段都涉及多个相关基因的表达和功能变化。最近，一类长片段非编码RNA分子(长链非编码RNA)在肿瘤发生发展和治疗反应各环节中承担的关键调控作用已引起人们的广泛关注。长链非编码RNA(LncRNA)是一类重要的细胞功能调控分子，研究显示LncRNA参与肿瘤的发生、发展及治疗反应。
长链非编码RNA分子SNHG18位于人染色体chr5:9546311-9550409，最初是1996年美国学者在分离人全长cDNA中被首次发现。但到目前为止，对于它的功能及结构特征尚未见进一步的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供长链非编码RNA分子SNHG18的新的应用。
本发明所述的应用是长链非编码RNA分子SNHG18在制备治疗脑胶质瘤的药物的应用。
根据本发明所述的应用的进一步特征，所述治疗脑胶质瘤的药物是增强脑胶质瘤细胞辐射敏感性的药物。
根据本发明所述的应用的进一步特征，提供了所述增强脑胶质瘤细胞辐射敏感性的药物是抑制脑胶质瘤细胞增殖的药物。
根据本发明所述的应用的进一步特征，提供了所述增强脑胶质瘤细胞辐射敏感性的药物是促进脑胶质瘤细胞凋亡的药物。
本发明的实验证实，长链非编码RNA分子SNHG18胶质瘤细胞增殖及放射敏感性相关。本发明应用lncRNA芯片从不同放射敏感性人恶性胶质瘤细胞系中筛选获得的与胶质瘤放射敏感相关的一种lncRNA，即SNHG18。本发明利用转染、干扰及构建动物模型等方法从体内体外两个方面明确SNHG18在胶质瘤增殖及放射抵抗中的作用。本发明的研究发现，SNHG18在具有辐射抗性的脑胶质细胞中高表达，抑制SNHG18后可抑制脑胶质瘤细胞的增殖，并提高脑胶质瘤细胞对辐射的敏感性。本发明从lncRNA这个新视野为阐明恶性胶质瘤恶性增殖及放射抵抗的分子机制提供新依据与新思路，以及提供药物靶点方面提供了一定的应用价值。因此，可以将SNHG18用于制备治疗脑胶质瘤的药物，尤其是用于制备增强脑胶质瘤细胞辐射敏感性的药物。
附图说明
图1是qRT-PCR实验检测SNHG18的相对表达量，该图显示，SNHG18在辐射抵抗的脑胶质瘤细胞系MO59K和U87中表达量比放射敏感株MO59J和U118显著升高。
图2A是通过qRT-PCR检测转染SNHG18siRNA后M059K细胞中SNHG18的相对表达量，以验证转染效率，该图显示，干扰SNHG18表达后M059K细胞的SNHG18表达水平明显降低。
图2B是通过qRT-PCR检测转染SNHG18siRNA后U87细胞中SNHG18的相对表达量，以验证转染效率，该图显示，干扰SNHG18表达后U87细胞的SNHG18表达水平明显降低。
图2C是通过qRT-PCR检测转染SNHG18质粒后MO59J细胞中SNHG18的相对表达量，以验证转染效率，该图显示，过表达SNHG18后MO59J细胞的SNHG18表达水平明显升高。
图2D是通过qRT-PCR检测转染SNHG18质粒后U118细胞中SNHG18的相对表达量，以验证转染效率，该图显示，过表达SNHG18后U118细胞的SNHG18表达水平明显升高。
图3A是通过MTT检测转染SNHG18siRNA后不同时间点M059K细胞的存活分数，该图显示，干扰SNHG18表达后M059K细胞增殖明显受到抑制。
图3B是通过MTT检测转染SNHG18siRNA后不同时间点U87细胞的存活分数，该图显示，干扰SNHG18表达后U87细胞增殖明显受到抑制。
图3C是通过MTT检测转染SNHG18质粒后不同时间点MO59J细胞的存活分数，该图显示，过表达SNHG18后促进了MO59J细胞的增殖。
图3D是通过MTT检测转染SNHG18质粒后不同时间点U118细胞的存活分数，该图显示，过表达SNHG18后促进了U118细胞的增殖。
图4A是用流式细胞仪检测转染SNHG18siRNA后48h的M059K细胞进行AnnexinV/PI染色后的荧光强度，以检测凋亡率。该图显示，干扰SNHG18表达后M059K细胞凋亡明显减少。(*P＜0.05)
图4B是用流式细胞仪检测转染SNHG18siRNA后48h的U87细胞进行AnnexinV/PI染色后的荧光强度，以检测凋亡率。该图显示，干扰SNHG18表达后U87细胞凋亡明显减少。(*P＜0.05)
图5A是用克隆形成实验检(colon assay)测转染SNHG18siRNA后M059K细胞在不同照射剂量下的存活分数，并用单击多靶模型捏合存活曲线。该图显示，干扰SNHG18表达后M059K细胞接受X-ray照射后的存活率明显减少。
图5B是用克隆形成实验检(colon assay)检测转染SNHG18siRNA后U87细胞在不同照射剂量下的存活分数，并用单击多靶模型捏合存活曲线。该图显示，干扰SNHG18表达后U87细胞接受X-ray照射后的存活率明显减少。
图5C是用克隆形成实验检(colon assay)检测转染SNHG18质粒后MO59J细胞在不同照射剂量下的存活分数，并用单击多靶模型捏合存活曲线。该图显示，过表达SNHG18后诱导了MO59J细胞对X-ray的抵抗。
图5D是用克隆形成实验检(colon assay)检测转染SNHG18质粒后U118细胞在不同照射剂量下的存活分数，并用单击多靶模型捏合存活曲线。该图显示，过表达SNHG18后诱导了U118细胞对X-ray的抵抗。
具体实施方式
下面将结合具体实例进一步阐述本发明。这些实例仅用于阐述本发明，而不用于限制本发明的范围。下列实例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本发明采用Arraystar Human LncRNA Microarray V3.0芯片，对来源于同一亲本、具有不同放射敏感性的脑胶质瘤细胞株M059J(敏感株)及M059K(抵抗株)33进行LncRNA表达谱分析，获得一系列差异表达LncRNA，通过生物信息学分析以及对芯片结果实验验证，从差异表达LncRNA中筛选出在放射抵抗的胶质瘤M059K细胞中表达明显升高的SNHG18作为一个调控脑胶质瘤放射敏感性的新靶点开展进一步研究。
首先，采用Trizol试剂提前细胞总RNA，进行反转录，利用qRT-PCR检测SNHG18在脑胶质瘤细胞株中的表达。研究发现，SNHG18在辐射抵抗的脑胶质瘤细胞系MO59K和U87中表达量比放射敏感株MO59J和U118显著升高。
第二步，利用MTT技术检测干扰SNHG18表达后M059K和U87细胞，以及过表达SNHG18后MO59J和U118的增殖情况的变化。分别在细胞转染后24h,48h,72h进行MTT染色及OD值检测，绘制生长曲线，结果表明干扰SNHG18表达后M059K和U87细胞增殖明显受到抑制。而过表达SNHG18后促进了MO59J和U118细胞的增殖。
第三步，利用流式细胞仪技术检测干扰SNHG18表达后M059K和U87细胞，以及过表达SNHG18后MO59J和U118的凋亡情况的变化。用AnnexinV/PI试剂盒对转染后48h的细胞进行凋亡检测。研究发现，干扰SNHG18表达后M059K和U87细胞凋亡明显减少。
第四步，利用colo assay技术检测干扰SNHG18表达后M059K和U87细胞，以及过表达SNHG18后MO59J和U118的辐射敏感性情况的变化。细胞转染后48h接受X-ray照射,剂量分别为0Gy,2Gy,4Gy,6Gy,8Gy,2周后计算克隆形成率，根据单击多靶模型绘制存活曲线。研究发现，干扰SNHG18表达后M059K和U87细胞接受X-ray照射后的存活率明显减少。而过表达SNHG18后诱导了MO59J和U118细胞对X-ray的抵抗。
实施例一：SNHG18在对辐射抵抗的脑胶质瘤细胞株中高表达。
实验材料：脑胶质瘤细胞株M059K及MO59J，购自ATCC细胞库。U87、U118细胞株，购自中国科学院上海细胞研究所细胞库。
实验方法与结果分析：
1.细胞培养：首先37℃水浴复苏细胞，然后接种于细胞培养瓶中。M059K及MO59J细胞培养使用含10％胎牛血清的DMEM-F12培养基(FBS，Gibco，澳大利亚)，U87、U118细胞培养使用含10％胎牛血清的DMEM培养基(FBS，Gibco，澳大利亚)。培养箱条件为37℃，5％CO2。
2.基因芯片：采用Arraystar Human LncRNA Microarray V3.0芯片，对来源于同一亲本、具有不同放射敏感性的脑胶质瘤细胞株M059J(敏感株)及M059K(抵抗株)进行LncRNA表达谱分析，挑选出有明显表达差异的lncRNANR_045196，结合生物信息学及实时PCR方法验证，确定该LncRNA分子为SNHG18。SNHG18是本发明人应用lncRNA芯片从不同放射敏感性人恶性胶质瘤细胞系中筛选获得的与胶质瘤放射敏感性调控相关的一种lncRNA。
3.qRT-PCR：总RNA通过Trizol(Invitrogen，Carlsbad，美国加州)试剂提取。SNHG18和GAPDH的逆转录引物购自英潍捷基公司。
SNHG18引物：
正向：5′-TGTGGCAGCCCACTCTATTG-3′；
反向：5′-TGGTGGACTTGAGTGGAAGC-3′。
内参GAPDH的PCR引物序列为：
上游：5'-AGAAGGTGGGGCTCATTTG-3'；
下游：5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'。
根据Premix Ex Taq II(Takara)说明书要求配制PCR反应液(20μl体系)，将样品加入到实时PCR的专用PCR管中后，设置ABI 7500(PerkinElmer/Applied Biosystems)的PCR反应条件为：95℃30s；95℃5s，60℃34s，40cycles。完成实时PCR后对其熔解曲线进行分析，并分析PCR产物是否特异。数据按2-ΔΔCt公式计算出基因的相对表达量。
结果发现，与辐射敏感性细胞株MO59J和U118相比，SNHG18在辐射抵抗的脑胶质瘤细胞株M059K和U87中高表达(参见图1)。
实施例二：SNHG18促进鼻咽癌细胞增殖。
1.细胞转染：转染实验前一天将脑胶质瘤细胞按3×105的密度接种于6孔板中，每孔加入约2ml无抗生素培养基，使转染时细胞密度能达到70-80％左右。取5μl/孔Lipofectamin 2000(Invitrogen，Carlsbad，美国加州)，用250μl Opti-MEM(Opti-MEMI Reduced Serum Medium)稀释，轻轻混合后在室温孵育5min。取8μl SNHG18/siRNA或Vector/NC(吉凯，上海)，用250μl Opti-MEM(Opti-MEMIReduced Serum Medium)稀释，轻轻混匀后室温孵育5min。稀释的Lipofectamin2000与稀释的SNHG18/siRNA或Vector/NC轻轻混合，室温静置20min，以形成转染试剂混合物。将混合物加入含有细胞及opti-MEMI(约1500μl)的孔中，轻轻混匀。在37℃，5％CO2的孵箱中培养6-8h后将培养液换为含血清的完全培养基，转染完成。48h后提取细胞的RNA，PCR鉴定转染效率。(图2A-2D)
2.MTT实验：消化对数期脑胶质瘤细胞，将细胞以5000个细胞/100μl的密度接种于96孔板，各设置6个复孔，常规培养，周围孔加PBS 200μl防止干燥。接种后24h、48h、72h后分别取一块96孔板，每孔加入50μl MTT，继续孵箱孵育2h。除去培养基，加入100μl DMSO，震荡10min。在波长570nm测定样品OD值。
结果发现,与对照组相比，过表达SNHG18后，细胞活力明显下降(图3A-3D)。
实施例三：SNHG18对脑胶质瘤细胞凋亡的影响
流式检测凋亡：将细胞均匀地铺在6孔板中，24h后将SNHG18的NC/siRNA通过lipo2000与opti-MEMI(约1500μl)共孵育后转入细胞中，转染6h后将细胞培养液换为新鲜培养液。转染48h后，将收集到的细胞用annexinV-fluorescein isothiocyanate(FITC)凋亡检测试剂盒(Sigma-Aldrich，美国)染色细胞。用流式细胞技术检测H1299细胞的凋亡情况。
结果表明，干扰了SNHG18表达的脑胶质瘤细胞凋亡率明显大于对照组。采用SPSS13.0软件进行统计分析，两样本均数的比较采用两独立样本的t检验(Independent-Sample T Test)和单样本t检验，P值＜0.05认为有统计学意义(参见图4A-4B)。
实施例四：SNHG18增强鼻咽癌细胞的辐射抵抗性
克隆形成实验：细胞经消化制成单细胞悬液后，按照预定数量接种于6孔板中，设0、2、4、6、8Gy五个剂量组，每个剂量组三个复孔。照射后将细胞置于37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱内继续培养10-14天，期间根据培养液pH值变化适时更换新鲜培养液。当培养板孔中出现肉眼可见克隆时，终止培养，弃去培养液，PBS清洗细胞2遍，甲醇固定，1％结晶紫乙醇溶液染色，显微镜下计数含50个细胞以上的克隆数，计算克隆形成率和存活分数，并运用GraphPadPrism 5.0软件进行多靶单击模型曲线拟合。
结果表明，干扰SNHG18表达的脑胶质瘤细胞存活分数明显下降，而过表达SNHG18的脑胶质瘤细胞对辐射抗性增加。(图5A-5D)。

Claims (4)

1.长链非编码RNA分子SNHG18在制备治疗脑胶质瘤的药物的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述治疗脑胶质瘤的药物是增强脑胶质瘤细胞辐射敏感性的药物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述增强脑胶质瘤细胞辐射敏感性的药物是抑制脑胶质瘤细胞增殖的药物。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述增强脑胶质瘤细胞辐射敏感性的药物是促进脑胶质瘤细胞凋亡的药物。
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