CN104586870A - 用莲心碱协同多柔比星化疗的药物组合及其应用方法 - Google Patents

Abstract

用莲心碱协同多柔比星化疗的药物组合及其应用方法。该药物组合由莲心碱注射液和化疗药物多柔比星注射液组成。应用方法的步骤是①按照莲心碱注射液中的实际药量∶患者体重＝4.88mg/kg的剂量，通过静脉每日注射一次莲心碱；②在按照步骤①注射莲心碱的当日，按照多柔比星注射液中的实际药量∶患者体重＝0.16mg/kg的剂量，通过静脉注射一次多柔比星；③到第六日时，按照步骤②剂量，通过静脉再注射一次多柔比星注射液；④从第十一日起，根据患者身体的承受能力和治疗效果，确定是否再按照步骤①～③的方法循环，以及循环次数和中间停药时间。在抑制和杀灭各种恶性肿瘤细胞方面与现有技术相比较，本发明具有可以减少用药量、缩短治疗周期，减少毒副反应发生之优点。

Description

用莲心碱协同多柔比星化疗的药物组合及其应用方法

技术领域

本发明涉及在以化疗方式治疗恶性肿瘤时，用别的药物协同多柔比星的药物组合及具体应用方法。

背景技术

化疗是治疗恶性肿瘤（癌症）方法之一，它是利用化学药物来阻止癌细胞的增殖、浸润、转移，直至最终杀灭癌细胞的一种治疗方式。多柔比星（Doxorubicin）也称阿霉素，是临床应用的化疗药物之一，其结构式为：

临床上采用多柔比星注射液（也称注射针剂）。在治疗急性白血病、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、乳腺癌、骨肉瘤、软组织肉瘤及肺癌方面，有比较显著的疗效。但是，多柔比星与其他化疗药物一样，由于对肿瘤细胞的选择性较差，在杀灭癌细胞的同时也会不可避免地损伤人体的正常细胞，从而出现药物的不良反应，多柔比星最显著的毒副作用是心脏毒性，并且，这些毒副反应与多柔比星用量成正相关。因此，在用多柔比星进行化疗时，除与其他治疗方式交替或混合使用之外，还常采用药物组合的方式，即用其他不同作用机制的药物来协同化疗药物发挥作用，以起到降低药物用量，减少不良反应发生，提高化疗效果的作用。另外，治疗恶性肿瘤的化疗药物容易产生耐药性，而采用药物组合后，还可在一定程度上避免和逆转耐药性。但是，药物组合本身却不能完全杜绝产生耐药性的问题，于是，人们就一直在努力寻找更多可相互替换的不同药物组合。令人遗憾的是，目前以多柔比星为主要化疗药物的药物组合还比较少。

发明内容

本发明的第一目的是，提供一种既能够提高疗效和降低不良反应，又能够替代现有药物组合的用莲心碱协同多柔比星化疗的药物组合。

本发明的第二目的是，提供一种针对实现第一发明目的之药物组合的操作相对简单的应用方法。

实现所述第一发明目的之技术方案是这样一种用莲心碱协同多柔比星化疗的药物组合，该药物组合由莲心碱注射液和化疗药物多柔比星注射液组成。

实现所述第二发明目的之技术方案是这样一种化疗用的药物组合的应用方法，该方法所用组合药物实现第一发明目的之莲心碱协同多柔比星化疗的药物组合，其应用步骤是：

① 按照所述莲心碱注射液中的实际药量∶患者体重＝4.88mg/kg的剂量，通过静脉每日注射一次莲心碱注射液；

② 在按照步骤①注射莲心碱注射液的当日，按照所述多柔比星注射液中的实际药量∶患者体重＝0.16mg/kg的剂量，通过静脉注射一次多柔比星注射液；

③ 到第六日时，按照步骤②所述剂量，通过静脉再注射一次所述多柔比星注射液；

④ 从第十一日起，根据患者身体的承受能力和治疗效果，确定是否再按照步骤①～③的方法循环，以及循环次数和中间停药时间。

从实现第一发明目的之技术方案中可以看出，与现有化疗药物多柔比星协同而组成为药物组合的是莲心碱。莲心碱（Liensinine）是一种来源于睡莲属植物（Nelumbo Nucifera Gaertn）成熟种子胚芽的双苄基四氢异喹啉生物碱，其结构式为：

据现有的公开资料记载，莲心碱主要具有抗心律失常及高血压的药理作用，但在抗肿瘤方面的药用作用未见报道。本申请发明人在研究中发现，莲心碱还具有能有效地阻断多种肿瘤细胞的自噬降解作用，尤其具有能够协同临床化疗药物（例如本申请中的多柔比星），以提高其抑制和杀灭多种肿瘤细胞之效果的作用。实验验证表明，对乳腺癌MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞、白血病U937细胞、神经胶质瘤LN229细胞和肺癌A549细胞，在用莲心碱协同情况下，多柔比星抑制和杀灭这些肿瘤细胞的效果均得到了很大提高，即整个药物组合具有高效的抑制和杀灭这些肿瘤细胞的作用。本领域的技术人员清楚，在正常剂量情况下，使用莲心碱未见显著的毒副反应。因此，在抑制和杀灭各种恶性肿瘤细胞方面与现有技术相比较，本发明的药物组合具有可以减少用药量、缩短治疗周期，减少毒副反应发生的优越性。十分显然的是，在有了本发明的这种药物组合之后，在避免耐药性方面就又多了一种全新的药物组合选择。

从实现第二发明目的之技术方案的步骤②③中可以看出，在注射本发明组合药物中的多柔比星注射液时，实际上还是与单用多柔比星注射液一样的非连续用药方式。其原因本领域的技术人员自然清楚，那就是药物多柔比星在人体内的代谢时间较长，非连续用药方式能够减小毒副反应。即便用了莲心碱协同而组成了药物组合之后本来就已经能够减少一些多柔比星的使用剂量了，但仍沿用这样的用药方式，又有节省注射次数的好处。这就是说，在应用本发明的药物组合时，只是多了注射莲心碱注射液这一步骤，没有其他的特别操作方法，因此，该应用方法仍属相对简单的。另外，从应用方法的剂量配比中可以看出，本发明药物组合中莲心碱的实际药量远比多柔比星的多得多。结合实验验证，不仅能够说明使用莲心碱协同多柔比星抑制和杀灭各种恶性肿瘤细胞，可以减少用药量、缩短治疗周期，减少毒副反应发生。甚至可以反过来讲，在现有临床化疗药物多柔比星媒介作用下，本申请发明人发现的具有能有效地阻断多种肿瘤细胞的自噬降解作用的莲心碱，也具有了效果可靠且具有实用价值的杀灭各种恶性肿瘤细胞的作用。当然，由于包括药物学在内的化学领域属于实验性极强的科学，所以，在莲心碱协同多柔比星的药物组合中，多柔比星对莲心碱是否就真有媒介作用呢，还有待进一步探索。但是，由于已经通过实验验证证明了本发明的药物组合之优点，所以，这种由发现所来带来的本发明，的确是一种全新的药物组合，在避免耐药性方面又多了一种选择。

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

附图说明

图1——用本发明药物组合与仅用多柔比星分别作用于人乳腺癌MDA-MB-231细胞、人乳腺癌MCF-7细胞、白血病U937细胞，人神经胶质瘤LN229细胞，人肺癌A549的细胞存活率比较图；

图2——用本发明药物组合与仅用多柔比星或莲心碱分别作用于乳腺癌细胞MDA-MB-231裸鼠移植模型的肿瘤体积比较图；

图3——用本发明药物组合与仅用多柔比星或莲心碱分别作用于乳腺癌细胞MDA-MB-231裸鼠移植模型的体重比较图。

具体实施方式

一、用莲心碱协同多柔比星化疗的药物组合，该药物组合由莲心碱注射液和化疗药物多柔比星注射液组成。

在了解到本发明提供的药物组合能够提高疗效和降低不良反应之后，为避免抗药性或耐药性而采用本发明的药物组合时，对本领域的技术人员来讲，完全有能力针对具体的恶性肿瘤，仅仅只通过有限的常规试验，就确定下莲心碱注射液和多柔比星注射液这两种组分之间的配比。针对本发明做实验验证时所选择的几种恶性肿瘤细胞而言，该药物组合采用这样的配比为宜，莲心碱注射液中的实际药量∶多柔比星注射液中的实际药量＝4.88mg∶0.030～0.035mg。

二、一种化疗用的药物组合的应用方法，该组合药物是具体实施方式一所述的莲心碱协同多柔比星化疗的药物组合，其应用步骤是：

① 按照所述莲心碱注射液中的实际药量∶患者体重＝4.88mg/kg的剂量，通过静脉每日注射一次莲心碱注射液；

② 在按照步骤①注射莲心碱注射液的当日，按照所述多柔比星注射液中的实际药量∶患者体重＝0.16mg/kg的剂量，通过静脉注射一次多柔比星注射液；

③ 到第六日时，按照步骤②所述剂量，通过静脉再注射一次所述多柔比星注射液；

④ 从第十一日起，根据患者身体的承受能力和治疗效果，确定是否再按照步骤①～③的方法循环，以及循环次数和中间停药时间。

本领域的技术人员十分清楚，注射液的浓度应当根据患者身体的承受能力等因素确定，因此，在步骤①、②的记载中，均为“注射液中的实际药量”。本领域的技术人员同样清楚，在步骤④中所说的“循环次数”通常可以为1～4遍，“中间停药时间”通常可以为1～2周；对于身体特别差的患者，甚至可以只以步骤①和②为一用药周期（即从第六日起就暂停用药）。

本发明通过了在实验室所做实验验证的证明。实验分为“细胞实验”和“裸鼠移植瘤模型实验”两部分，后一实验过程及步骤与具体实施方式二中所记载的相同。

实验过程及验证结果如下：

（一）细胞实验

1．细胞选择与活性培养

实验选择有，人乳腺癌MDA-MB-231细胞、人乳腺癌MCF-7细胞、人白血病U937细胞、人神经胶质瘤LN229细胞、人肺癌A549细胞。其中，人乳腺癌MDA-MB-231细胞、人乳腺癌MCF-7细胞及人肺癌A549细胞的活性培养在DMEM＋10％胎牛血清（FBS）完全培养基中进行；人白血病U937细胞的活性培养在RPMI1640＋10％胎牛血清（FBS）完全培养基中进行；人神经胶质瘤LN229细胞的活性培养在DMEM/F-12＋10％胎牛血清（FBS）完全培养基中进行。以上细胞又均在37℃，5％浓度的CO₂，饱和湿度的细胞培养箱中培养。

2．实验方法

各肿瘤细胞系状态稳定后，将细胞铺于96孔板中，每孔5000个细胞，每孔含完全培养基90μL。

人乳腺癌MDA-MB-231细胞、人乳腺癌MCF-7细胞、人白血病U937细胞、人神经胶质瘤LN229细胞、人肺癌A549细胞按以下方式分组并处理：

（1）对照组：完全培养基溶液10μL处理；

（2）多柔比星组：用完全培养基配制浓度为2μM（μmol/L）的多柔比星溶液，每孔中加10μL处理；

（3）多柔比星和莲心碱组合药物组：用完全培养基配制浓度为2μM的多柔比星溶液及200μM的莲心碱混合药液，每孔中加混合药液10μL处理。

以上分组及加药处理48小时后，每孔中加入20μL磷酸盐缓冲溶液（PBS溶液）配制的5mg/mL的噻唑蓝（MTT）溶液继续培养4小时。

吸走上层培养基（人白血病U937细胞用平板离心机先将悬浮的细胞离心至孔底），每孔中加入150μL 二甲亚砜（DMSO）进行溶解，振荡器上溶解10分钟后，用酶标仪在A495处检测吸光度值，细胞存活率根据以下公式计算：

细胞存活百分率＝（处理组吸光度－空白孔吸光度）÷（对照组吸光度－空白孔吸光度）×100%。

实验结果见图1。

图1中，纵坐标表示细胞存活率，即处理组相对于对照组的细胞存活率（对照组为100%，图中未标出）。横坐标为各种人肿瘤细胞株（注：仅由对应肿瘤细胞的区别符号表示）；白色图柱代表单独使用多柔比星处理后各种人肿瘤细胞的存活率；黑色图柱代表使用莲心碱协同多柔比星处理后各种人肿瘤细胞的存活率。图柱对应的值为各组的平均值，图中“Ⅰ”形符号指出了上下偏差。

从图1中可以看出，莲心碱协同多柔比星组与单独使用多柔比星组相比较，莲心碱协同多柔比星组的肿瘤细胞存活率均不同程度地低于单独使用多柔比星组。

为证明这一验证结论是准确而可靠的，验证时同时还对样本进行了统计学的计算与分析。图中“**”表示p＜0.01，其中“p”为统计学上可接受错误的边界符号，其值为p≤0.05。在计算出p＜0.01的情况下，即可认定使用莲心碱协同多柔比星组的肿瘤细胞存活率小于单独使用多柔比星的肿瘤细胞存活率之结论，出现错误的可能性小，自然说明了这一验证结果是准确而可靠的。

本领域的技术人员十分清楚，在细胞实验中，药物作用效果只与药物浓度存在对应关系，而不是与药物的总量，同时，细胞层面的药物浓度不能够与动物实验的浓度进行换算，因此，细胞层面实验只能够验证莲心碱协同多柔比星的药物组合与单独使用多柔比星相比较有没有显著差异。当然，通过这一验证也充分证明了本发明药物组合的有效性和可靠性。

因此，再通过裸鼠实验进一步验证本发明药物组合的效果时，就可仅仅只针对一种肿瘤细胞了。

（二）裸鼠移植瘤模型实验（仅以移植人乳腺癌MDA-MB-231细胞为例）

在本实验过程中，是通过腹腔向裸鼠体内注射各种药物以进行比较的（即并不是通过静脉注射）。因此，其剂量通过了换算，换算根据是美国食品药品监督管理局（FDA）在《药物临床实验中健康成人受试对象安全给药剂量的估算》（《Estimating the Safe Starting Dose in Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers》）中给出的，达到相同生物学效应所需的人体与小鼠（即实验验证中的裸鼠）的注射剂量换算比（1∶12.3）。再依此换算比，对照具体实施方式二中所记载的剂量来换算出实验用裸鼠的用药剂量。

1．裸鼠的选择

取6～8 周龄无特异病原微生物（SPF）级裸鼠32只，体重范围为20±2g，在昼夜交替、室温（20～23）℃环境饲养，自由饮水、进食。

2．实验分组及给药剂量（共4组）

所有裸鼠随机分为四组后，每只右大腿外侧接种1×10⁷个用人乳腺癌MDA-MB-231细胞所制悬液0.2mL（人乳腺癌MDA-MB-231细胞的培养与前述“细胞实验”相同），待瘤体形成后开始按以下方式给药。

（1）对照组：与处理组体积相同的生理盐水腹腔注射，1次/日；

（2）莲心碱组：按裸鼠体重60mg/kg的剂量，腹腔注射莲心碱，1次/日；

（3）多柔比星组：按裸鼠体重2mg/kg的剂量，腹腔注射多柔比星，1次/5日（即间隔4日注射1次）；

（4）莲心碱和多柔比星的药物组合组：按裸鼠体重60mg/kg（＝4.88mg/kg×12.3）的剂量，腹腔注射莲心碱，1次/日；在第一次注射莲心碱的同日，按裸鼠体重2mg/kg（＝0.162mg/kg×12.3）的剂量，腹腔注射多柔比星，间隔4日注射1次。

注：上述多柔比星剂量中的0.162mg，是根据前述的本发明药物组合中多柔比星的配比（0.030～0.035）的中间值，以及1次/5日注射多柔比星来换算出的。

上述各组中莲心碱和多柔比星的剂量中，均只是指药物本身的剂量。配制成注射针剂时应当达到的浓度，对本领域的技术人员而言，应当是十分清楚的，至多经过有限的常规实验也能够确定下来，故不详述。

3．测量与记录

（1）每五天后测量、记录一次各组裸鼠的体重；

（2）每五天后用游标卡尺测量肿瘤的长度和宽度、记录一次各组裸鼠肿瘤体部分的体积；肿瘤体积按照以下公式计算：

肿瘤体积（mm³）＝肿瘤长度（mm）×肿瘤宽度的平方（mm²）

图2和图3记载了上述测量的结果记录。在图2中纵坐标表示各组裸鼠的肿瘤体积；横坐标表示测量时间点；各种线条节点表示各处理组；各点的数值为各组肿瘤体积的平均值（图中“Ⅰ”形符号指出了上下偏差）。在图3中纵坐标表示各组裸鼠的平均体重；横坐标表示测量时间点；各种线条节点表示各处理组；各点的数值为各组平均体重。

由图2可见，莲心碱协同多柔比星组与单独使用多柔比星和单独使用莲心碱组相比较，莲心碱协同多柔比星组的肿瘤体积在治疗15天至20天后显著低于各单独使用药物组。图2中的“**”同样表示p＜0.01，同样可以认定使用莲心碱协同多柔比星组的肿瘤体积小于单独药物组和对照组出现错误的可能性小，这一验证结果也是准确而可靠。

由图3可见，莲心碱协同多柔比星组与单独使用多柔比星，单独使用莲心碱组和对照组相比较，莲心碱协同多柔比星组的小鼠体重与其他各单独使用药物组及对照组比较未见显著差异。（ns代表p＞ 0.05，即认定莲心碱协同多柔比星组的体重与单独药物组或对照组有差异而出现错误的可能性大于0.05，因p=0.05是统计学中可接受最大出错概率，所以本处大于0.05的出错概率是不能认定莲心碱协同多柔比星组的体重与单独药物组或对照组有差异的，即未见显著差异）

图2记载的验证结果证明了，莲心碱协同多柔比星化疗的药物组合，抑制和杀灭人乳腺癌MDA-MB-231细胞的确优于单独使用多柔比星，自然可以减少用药量、缩短治疗周期，减少毒副反应发生。由于在图3的记载未见明显毒副反应，其验证结果证明了，莲心碱协同多柔比星化疗的药物组合，至少不会有单独使用多柔比星那样明显的毒副反应。

本领域的技术人员清楚，在通过了前述细胞实验的验证之后，现经过针对人乳腺癌MDA-MB-231细胞的裸鼠移植瘤模型实验，就完全能够说明，莲心碱协同多柔比星化疗的药物组合对人乳腺癌MCF-7细胞、人白血病U937细胞、人神经胶质瘤LN229细胞和人肺癌A549细胞也有同样的效果（有差别，也极其微小）。

Claims (2)

1.用莲心碱协同多柔比星化疗的药物组合，其特征在于，所述药物组合由莲心碱注射液和化疗药物多柔比星注射液组成。

2.一种化疗用的药物组合的应用方法，其特征在于，所述组合药物为权利要求1所述的用莲心碱协同多柔比星化疗的药物组合，其应用步骤是：

① 按照所述莲心碱注射液中的实际药量∶患者体重＝4.88mg/kg的剂量，通过静脉每日注射一次莲心碱注射液；

② 在按照步骤①注射莲心碱注射液的当日，按照所述多柔比星注射液中的实际药量∶患者体重＝0.16mg/kg的剂量，通过静脉注射一次多柔比星注射液；

③ 到第六日时，按照步骤②所述剂量，通过静脉再注射一次所述多柔比星注射液；

④ 从第十一日起，再根据患者身体的承受能力和治疗效果，确定是否再按照步骤①～③的方法循环，以及循环次数和中间停药时间。