CN104560971A - 突变的核酸和表达载体以及酵母菌株及其制备方法与用途 - Google Patents
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Abstract
突变的核酸和表达载体以及酵母菌株及其制备方法与用途。本发明公开了一种序列如SEQ？ID？NO:1所示的突变的核酸，或者，序列由5’端连接有Kozak序列的SEQ？ID？NO:1组成的突变的核酸；插入有该核酸的表达载体和利用该表达载体制备高抗逆性酵母菌株的方法；高抗逆性酵母菌株；制备高抗逆性酵母菌株的方法以及高抗逆性酵母菌株在生产乙醇中的用途。通过上述技术方案，利用本发明突变的核酸构建的表达载体转化酵母后，能够获得具有高抗逆性和多重胁迫耐受性的酵母菌株，该酵母菌株的遗传性能稳定，在乙醇生产中的糖利用率和乙醇产量均较高，可应用于目前的燃料乙醇生产工艺和木质纤维素乙醇新工艺中，实用性较强。
Description
技术领域
本发明涉及一种突变的核酸与表达载体和制备高抗逆性酵母菌株的方法以及酵母菌株及其制备方法与用途，具体地，涉及一种突变的核酸、插入有该核酸的表达载体、利用该表达载体制备高抗逆性酵母菌株的方法、高抗逆性酵母菌株、制备高抗逆性酵母菌株的方法以及高抗逆性酵母菌株在生产乙醇中的用途。
背景技术
由于传统化石能源用量急增，能源紧缺已成为世界性问题，能源多元化发展和加快可再生能源开发已成为世界各国的研发重点，其中，燃料乙醇的生产和应用在经济发展和战略安全上显示出重大意义。以燃料乙醇等替代能源为代表的能源供应多元化战略已成为我国能源政策的重要方向。木质纤维素是十分丰富而廉价的生物质原料，可以被降解为可发酵性糖，用于燃料乙醇的生产。大力发展生物质燃料乙醇作为可再生能源，有助于缓解石油资源短缺，改善大气环境等问题，在稳定粮食生产、促进农业生产与消费的良性循环和可持续发展等方面具有积极作用。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为单细胞真核生物，具有易培养、生长周期短的特点，已广泛应用于异源基因的表达。虽然普通酿酒酵母能够高效利用葡萄糖产乙醇，但对发酵液中的抑制物和高浓乙醇耐受性(Almeida J R M et al.,2007)较差，特别是对纤维素水解液中的抑制成分敏感，使酿酒酵母无法成为木质纤维素乙醇生产的优势菌株；其次，纤维素乙醇生产中，纤维素原料预处理过程产生和残留的降解物会对后续菌株发酵造成不同程度的抑制，其中，乙酸、糠醛、酚类和SO4 2-等抑制因子对酵母有较强毒害作用，会显著抑制细胞的生长及其发酵性能。
目前，在纤维素乙醇生产菌种——酿酒酵母的研究领域，大多集中于将各种实验室缺陷型菌种为研究对象进行改造，而缺乏能够应用于生产的野生型酵母模型，能够耐受多重抑制物、具有高抗逆性的酿酒酵母具有更强的实用性，显然，研究获得具有上述特性的酵母模型极为重要。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种能够使酵母菌株稳定发酵产乙醇、耐受多重抑制物而具有高抗逆性的突变的核酸、插入有该核酸的表达载体和利用该表达载体制备高抗逆性酵母菌株的方法、高抗逆性酵母菌株、制备高抗逆性酵母菌株的方法以及高抗逆性酵母菌株在生产乙醇中的用途。
为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种突变的核酸，其中，该突变的核酸的序列如SEQ ID NO:1所示，或者，该突变的核酸的序列由5’端连接有Kozak序列的SEQ ID NO:1组成。
第二方面，本发明提供了一种表达载体，其中，该表达载体插入有上述本发明的突变的核酸。
第三方面，本发明提供了一种制备高抗逆性酵母菌株的方法，其中，该方法包括：使用上述本发明的表达载体转化酵母细胞，得到转化后的酵母细胞。
第四方面，本发明提供了一种酵母菌株，该酵母菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的菌株，所述酵母菌株的保藏号为CGMCC No.8203。
第五方面，本发明提供了第四方面的酵母菌株在生产乙醇中的用途。
第六方面，本发明提供了一种生产乙醇的方法，该方法包括：用第四方面的酵母菌株对乙醇发酵原液进行乙醇发酵。
通过上述技术方案，利用本发明突变的核酸构建的表达载体转化酵母后，能够获得具有高抗逆性和多重胁迫耐受性的酵母菌株，该酵母菌株的遗传性能稳定，在乙醇生产中的糖利用率和乙醇产量均较高，可应用于目前的燃料乙醇生产工艺和木质纤维素乙醇新工艺中，实用性较强。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
生物保藏
本发明的酵母菌株——酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)于2013年9月24日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(缩写为CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCC No.8203。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在本发明中，在未作相反说明的情况下，使用的术语“抗逆性”是指微生物在偏离其最佳生长条件下的环境中的生长和发酵能力，比如较高或较低的温度，较高或较低的pH，较高或较低的渗透压，较高的反馈抑制，有毒物质的存在等环境。
本发明提供了一种突变的核酸，该突变的核酸的序列如SEQ ID NO:1所示，或者，该突变的核酸的序列由5’端连接有Kozak序列的SEQ ID NO:1组成。
atgtccggaaaagcctctacagagggtagcgttactacggagtttctctctgatatcattggtaagacagtgaacgtcaaacttgcctcgggtttactctacagcggaagattggaatccattgatggttttatgaatgttgcactatcgagtgccactgaacactacgagagtaataacaataagcttctaaataagttcaatagtgatgtctttttgaggggcacgcaggtcatgtatatcagtgaacaaaaaatatag(SEQ ID NO:1)
在本发明的优选实施方式中，所述突变的核酸的序列由5’端连接有Kozak序列的SEQ ID NO:1组成。
其中，Kozak序列是指用来增强真核基因翻译效率，避免核糖体出现漏洞扫描(leaky scan)的序列。各种常规的Kozak序列都可以用于本发明。
进一步优选地，所述突变的核酸的序列如SEQ ID NO:2所示。
gccaccatgtccggaaaagcctctacagagggtagcgttactacggagtttctctctgatatcattggtaagacagtgaacgtcaaacttgcctcgggtttactctacagcggaagattggaatccattgatggttttatgaatgttgcactatcgagtgccactgaacactacgagagtaataacaataagcttctaaataagttcaatagtgatgtctttttgaggggcacgcaggtcatgtatatcagtgaacaaaaaatatag(SEQ ID NO:2)
本发明还提供了一种表达载体，该表达载体插入有序列如上所述的突变的核酸。其中，所述表达载体可以为插入有本发明的突变的核酸并能够使突变的核酸表达的任何表达载体，例如，质粒或噬菌体。
根据本发明，所述表达载体中的启动子可以为组成型启动子或诱导型启动子。为了进一步增强表达效率，优选地，所述表达载体中的启动子为Padh1启动子、Ppgk启动子或Pfbp启动子。更优选地，所述表达载体中的启动子为Padh1启动子。
根据本发明，对所述表达载体中的终止子没有特别的限定，且本领域技术人员能够很容易地选择适当的终止子来构建能够表达本发明突变的核酸的表达载体。
根据本发明的一种优选实施方式，所述表达载体为在质粒pAUR123的BamHI酶切位点和XhoI酶切位点之间插入序列如上所述的突变的核酸而得到的表达载体。将本发明优选实施方式中的表达载体转化到酿酒酵母细胞中时能够获得更高的表达效率，从而能够更好地实现本发明的目的。
此外，本发明还提供了一种制备高抗逆性酵母菌株的方法，该方法包括：使用本发明的上述表达载体转化酵母细胞，得到转化后的酵母细胞。
本发明中，可以采用本领域常用的各种转化手段来使用表达载体转化酵母细胞，例如，电穿孔法或化学法。优选地，采用电穿孔法来转化酵母细胞。电穿孔法的具体操作为本领域技术人员所公知，在此不再赘述。
本发明中，对使用的酵母细胞没有特别的要求，可以为野生型的各种酵母细胞，也可以为缺陷型酵母细胞。优选地，使用野生型酵母细胞进行转化。
根据本发明，为了获得转入有本发明的表达载体的酵母菌株的纯培养物，制备高抗逆性酵母菌株的方法优选还包括：将转化后的酵母细胞在胁迫培养基中进行培养，以去除抗逆性低的酵母细胞。
其中，所述胁迫培养基指能够筛选转化了本发明的表达载体的酵母细胞的培养基，一般指添加了胁迫因子的培养基，所述胁迫因子可以为乙酸、Na2SO4、NaCl、KCl、NH4Ac、KAc、NaAc、苯酚和糠醛中的至少一种。
优选地，所述胁迫培养基含有1-5g/L的乙酸、1-6g/L的Na2SO4、20-60g/L的NaCl、10-30g/L的KCl、20-40g/L的NH4Ac、20-40g/L的NaAc、5-40g/L的KAc、0.1-0.5g/L的苯酚和0.1-0.5g/L的糠醛中的至少一种。更优选地，所述胁迫培养基含有1-3g/L的乙酸、4-6g/L的Na2SO4、35-40g/L的NaCl、20-30g/L的KCl、20-40g/L的NH4Ac、30-40g/L的NaAc和10-30g/L的KAc中的至少一种(优选最多不超过三种)；或者，所述胁迫培养基含有1-3g/L的乙酸和0.15-0.3g/L的糠醛；或者，所述胁迫培养基含有1-3g/L的乙酸和0.2-0.4g/L的苯酚。
根据本发明，在胁迫培养基中进行培养的条件可以为常规的培养酵母细胞的条件，优选情况下，在胁迫培养基中进行培养的条件包括：温度为28-33℃，时间为24-72小时。
本发明提供的酵母菌株为酿酒酵母的菌株，该酵母菌株的保藏号为CGMCC No.8203。
本发明中，将上述保藏号为CGMCC No.8203的酵母菌株命名为酿酒酵母RIPP-06。酿酒酵母RIPP-06具有典型的酿酒酵母菌株生物学特征：细胞呈椭圆形，多边芽殖；菌落凸起、乳白色、圆形、光滑湿润、边缘整齐、容易挑起。而且，酿酒酵母RIPP-06具有典型的酿酒酵母生理生化特征，能发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖，还能有效发酵葡萄糖产乙醇。酿酒酵母RIPP-06发酵初始pH范围为5-5.5，最适pH为5.5。
本发明还提供了上述酵母菌株在生产乙醇中的用途。
此外，本发明提供的生产乙醇的方法包括：用上述酵母菌株对乙醇发酵原液进行乙醇发酵。
本发明中，相对于所述乙醇发酵原液中每克的总糖，所述酵母菌株的接种量可以为常规的数量，例如可以为103-108个酵母菌体，优选为104-107个酵母菌体。
其中，所述酵母菌体的个数以菌落形成单位数计算。菌落形成单位数是在光学显微镜下，用血球计数板计数保温后的溶液中活菌的数目(使用台盼蓝染色法进行染色，死菌染色，活菌不染色)。
本发明中，所述乙醇发酵的条件可以为常规的乙醇发酵条件，例如可以包括：发酵时间可以为36-75小时，发酵温度可以为30-33.5℃，pH值可以为4-5.5。
本发明中，所述酵母菌株可以采用常规的方法接种，例如向乙醇发酵原液中加入5-15体积％的种子液。所述种子液可以为所述酵母菌株的水溶液或培养基溶液，也可以为所述酵母菌株的活化培养液。种子液的制备方法为本领域技术人员所熟知，在此不再赘述。
本发明中，所述乙醇发酵原液的选择可以为乙醇发酵领域常规的选择(如含葡萄糖的培养液)，例如，所述乙醇发酵原液可以为含淀粉的植物材料的酶解产物和/或含纤维素的植物材料的酶解产物。所述含淀粉的植物材料可以为玉米、小麦、木薯和马铃薯等常规的可用于乙醇发酵的植物材料。所述含纤维素的植物材料可以为玉米秸秆等。所述酶解产物的制备方法可以为本领域常规的选择，例如文献(苏小军等，燃料乙醇发酵技术研究进展，湖南农业大学学报(自然科学版)，第33卷第4期，第480页)中记载的方法。
根据本发明提供的生产乙醇的方法，可以得到乙醇含量高的成熟发酵液。成熟发酵液中的乙醇可以用常规的方法和步骤，根据不同工业产品的要求(比如燃料酒精要求乙醇的纯度达99％以上)分离并精制，比如蒸馏、浓缩、除水等步骤。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中的实验和检测方法，如无特殊说明，均为常规方法；所使用仪器，如无特殊说明，均为常规检测和操作仪器；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中采用的培养基等如下：
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)RIPP-0于2013年9月24日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(缩写为CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCC No.8202。
YEPD培养基：葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L。
筛选培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，琼脂粉20g/L，乙酸3g/L，胁迫因子(Na2SO4、NaCl、KCl、NH4Ac、NaAc等)5-40g/L，自然pH，倒平板备用。
酸性种子培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，乙酸1-3g/L，pH5.0。
葡萄糖发酵培养基：葡萄糖80g/L，蛋白胨5g/L，酵母抽提物3g/L，CaCl2 0.25g/L，MgCl2 0.25g/L，KH2PO4 2.5g/L，pH 5.5。根据需要单独加入乙酸、糠醛等胁迫因子(抑制成分)作为含有抑制成分的葡萄糖发酵培养基。
发酵液的成分采用高效液相色谱法测定：样品经准确稀释后，先经10000r/min高速离心10min，上清液经0.45μm微孔滤膜过滤后进样测定。高效液相色谱条件为：Agilent 1260液相色谱仪，Hi-plex H(8μm，7.7×30μm)色谱柱，柱温60℃，流动相为乙腈：水(80:20)，流速0.5mL/min。
糖利用率(％)＝(培养基中的糖含量-发酵液中残糖含量)/培养基中糖含量×100％。
乙醇产量(g/L)定义为每升发酵液中乙醇的含量，其值越高，表明菌株发酵产乙醇的能力及乙醇耐受性越强。
实施例1
委托上海吉玛(GenePharma)公司合成碱基序列如SEQ ID NO:2所示的突变的核酸lsm6，参照《分子克隆实验指南(第三版)》(Sambrook J,2001)中的方法，将lsm6连接在酿酒酵母质粒pAUR123的BamHI酶切位点和XhoI酶切位点之间，构成重组表达载体pAUR-lsm6。
实施例2
(1)挑取酿酒酵母RIPP-0单菌落至YEPD培养基中，30℃、180r/min培养至对数中后期(约16h)，4000r/min离心5min收集细胞，用4℃无菌水和pH7.5、10mM的Tris-HCl缓冲液洗涤两次，加入0.6M山梨醇溶液悬浮细胞，稀释至浓度约为105-106个细胞/mL，取0.2ml菌液，将实施例1获得重组表达载体pAUR-lsm6以电击转化法(参照《分子克隆实验指南(第三版)》，Sambrook J，2001)转入酿酒酵母RIPP-0宿主菌中，菌液加入1mLYEPD培养基，于30℃下孵育1h。
(2)将步骤(1)孵育1h后的菌液均匀涂布于含有3g/L乙酸和30g/LNH4Ac、以及3g/L乙酸和40g/L NaAc的两种复合筛选平板上，30℃下培养60h，得到初筛菌株64株。
(3)将初筛菌株接入酸性种子培养基中，30℃、200r/min培养24h后，得到生物量正常、镜检正常的菌株35株，离心收集细胞得到菌泥，并将菌泥接入装有100mL葡萄糖发酵培养基(含有3g/L的乙酸)的250mL三角瓶中，初始细胞浓度约为1.0-1.2g/L(细胞干重计)，30℃、120r/min进行复筛。分析上述菌株的乙酸耐受性和乙醇产量，从中获得9株30℃耐受3g/L乙酸、乙醇产量大于20g/L的重组菌株。进而对9株菌的乙酸(3g/L)、糠醛(0.2g/L)、苯酚(0.3g/L)、Na2SO4(5g/L)、NaCl(40g/L)、KCl(25g/L)、NH4Ac(20g/L)、NaAc(30g/L)等胁迫因子的耐受性和乙醇产量进行分析，即用含有如上所述的胁迫因子的筛选培养基培养这9株菌，最终获得1株耐受多重抑制成分而具有高抗逆性的酿酒酵母菌株RIPP-06，该酵母菌株在含有上述胁迫因子的筛选培养基中均能生长且乙醇产量高，且酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)RIPP-06于2013年9月24日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(缩写为CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCC No.8203。
实施例3
本实施例用来说明本发明获得的酵母菌株的葡萄糖发酵性能。
(1)制备种子液
将酿酒酵母RIPP-0和RIPP-06分别接种于酸性种子培养基(含乙酸3g/L)，30℃、200r/min振荡培养12h，得到一级种子培养液；
将所述一级种子培养液离心后，细胞转接于种子培养基(不含乙酸)，30℃、200r/min振荡培养16h，得到种子液。
(2)发酵葡萄糖产乙醇
将步骤(1)得到的种子液离心，收集细胞得到菌泥，将菌泥(以细胞干重计，控制初始细胞浓度为1.2g/L)接入装有100ml葡萄糖发酵培养基的250ml的摇瓶中，30℃、120r/min振荡培养，进行厌氧发酵。每次接种3个平行样，结果取平均值。
上述条件发酵72h后，取5ml发酵液，10000r/min离心10min，上清液经0.45μm微孔滤膜过滤后进行发酵液成分测定。结果表明，发酵80g/L葡萄糖72h，原始菌株酿酒酵母RIPP-0糖利用率为95.1％，乙醇产量为37.8g/L；酿酒酵母RIPP-06糖利用率为98.5％，乙醇产量为39.8g/L，较原始菌株的葡萄糖发酵性能有所提高。
实施例4
本实施例用来说明本发明获得的酵母菌株在含有抑制成分(1g/L乙酸)的葡萄糖发酵培养基中的发酵性能。
(1)制备种子液
同实施例3的步骤(1)。
(2)在抑制成分的存在下发酵葡萄糖产乙醇
将步骤(1)得到的种子液离心，收集细胞得到菌泥，将菌泥(以细胞干重计，控制初始细胞浓度为1.2g/L)接入装有100ml含抑制成分的葡萄糖发酵培养基的250ml的摇瓶中，其余步骤同实施例3的步骤(2)。结果表明，发酵80g/L葡萄糖72h，原始菌株酿酒酵母RIPP-0糖利用率为95.6％，乙醇产量为20.6g/L；酿酒酵母RIPP-06糖利用率为97.3％，乙醇产量为38.2g/L，在抑制成分的存在下较原始菌株的葡萄糖发酵性能明显提高。
实施例5
本实施例用来说明本发明获得的酵母菌株在含有抑制成分(3g/L乙酸)的葡萄糖发酵培养基中的发酵性能。
(1)制备种子液
同实施例3的步骤(1)。
(2)在抑制成分的存在下发酵葡萄糖产乙醇
将步骤(1)得到的种子液离心，收集细胞得到菌泥，将菌泥(以细胞干重计，控制初始细胞浓度为1.2g/L)接入装有100ml含抑制成分的葡萄糖发酵培养基的250ml的摇瓶中，其余步骤同实施例3的步骤(2)。结果表明，发酵72h，原始菌株RIPP-0葡萄糖利用率为83.8％，乙醇产量为9.4g/L；酿酒酵母RIPP-06葡萄糖利用率为96.6％，乙醇产量为30.1g/L，在抑制成分的存在下较原始菌株的葡萄糖发酵性能明显提高。
实施例6
本实施例用来说明本发明获得的酵母菌株在含有抑制成分(1g/L乙酸和0.2g/L糠醛)的葡萄糖发酵培养基中的发酵性能。
(1)制备种子液
同实施例3的步骤(1)。
(2)在抑制成分的存在下发酵葡萄糖产乙醇
将步骤(1)得到的种子液离心，收集细胞得到菌泥，将菌泥(以细胞干重计，控制初始细胞浓度为1.2g/L)接入装有100ml含抑制成分的葡萄糖发酵培养基的250ml的摇瓶中，其余步骤同实施例3的步骤(2)。结果表明，发酵72h，原始菌株酿酒酵母RIPP-0葡萄糖利用率为85.5％，乙醇产量为7.5g/L，发酵基本被抑制；酿酒酵母RIPP-06葡萄糖利用率为95.4％，乙醇产量为35.3g/L，在抑制成分的存在下较原始菌株的葡萄糖发酵性能明显提高。
实施例7
本实施例用来说明本发明获得的酵母菌株在含有抑制成分(1g/L乙酸和0.3g/L苯酚)的葡萄糖发酵培养基中的发酵性能。
(1)制备种子液
同实施例3的步骤(1)。
(2)在抑制成分的存在下发酵葡萄糖产乙醇
将步骤(1)得到的种子液离心，收集细胞得到菌泥，将菌泥(以细胞干重计，控制初始细胞浓度为1.2g/L)接入装有100ml含抑制成分的葡萄糖发酵培养基的250ml的摇瓶中，其余步骤同实施例3的步骤(2)。结果表明，发酵72h，原始菌株酿酒酵母RIPP-0葡萄糖利用率为82.1％，乙醇产量为6.6g/L，发酵基本被抑制；酿酒酵母RIPP-06葡萄糖利用率为95.2％，乙醇产量为35.3g/L，在抑制成分的存在下较原始菌株的葡萄糖发酵性能明显提高。
实施例8
按照与实施例2相同的方法用重组表达载体pAUR-lsm6转化酿酒酵母S288C(购自ATCC，货号为204508D-5TM)，获得1株酿酒酵母菌株RIPP-D20，按照与实施例3-7相同的方法对其发酵性能进行测定，结果如下表1所示。
表1
酿酒酵母S288C是一株抗逆性较低的酿酒酵母菌株，但从表1中的结果可以看出，往酿酒酵母S288C中转入本发明的核酸后，其能够利用多种含抑制成分的原料发酵产乙醇，说明转化本发明突变的核酸能够明显增强不同酵母菌株的抗逆性和乙醇发酵性能。
对比例1
委托上海吉玛(GenePharma)公司合成碱基序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的突变的核酸lsm6-N1和lsm6-N2，参照《分子克隆实验指南(第三版)》(Sambrook J,2001)中的方法，将lsm6-N1和lsm6-N2分别连接在酿酒酵母质粒pAUR123的BamHI酶切位点和XhoI酶切位点之间，构成重组表达载体pAUR-lsm6-N1和pAUR-lsm6-N2。
gccaccatgtccggaaaagcatctacagagggtagcgttactacggagtttctctctgatatcattggtaagacagtgaacgtcaaacttgcctcgggtttactctacagcggaagattggaatccattgatggttttatgaatgttgcactatcgagtgccactgaacactacgagagtaataacaataagcttctaaataagttcaatagtgatgtctttttgaggggcacgcaggtcatgtatatcagtgaacaaaaaatatag(SEQ ID NO:3)
gccaccatgtccggaaaagcttctacagagggtagcgttactacggagtttctctctgatatcattggtaagacagtgaacgtcaaacttgcctcgggtttactctacagcggaagattggaatccattgatggttttatgaatgttgcactatcgagtgccactgaacactacgagagtaataacaataagcttctaaataagttcaatagtgatgtctttttgaggggcacgcaggtcatgtatatcagtgaacaaaaaatatag(SEQ ID NO:4)
按照与实施例2相同的方法用重组表达载体pAUR-lsm6-N1和pAUR-lsm6-N2转化酵母菌株RIPP-0，获得酿酒酵母菌株RIPP-D11和RIPP-D12，按照与实施例3-7相同的方法对其发酵性能进行测定，结果如下表2所示，比较表2中显示的结果和实施例3-7的结果可以看出，采用非本发明突变的核酸构建的表达载体转化酵母后获得的酵母菌株的发酵性能明显低于本发明方法获得的酵母菌株。
表2
从以上实施例可以看出，将本发明的突变的核酸构建的表达载体转化酵母后，能够获得糖利用率和乙醇产量均较高的酵母菌株。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (13)
1.一种突变的核酸，其特征在于，该突变的核酸的序列如SEQ ID NO:1所示，或者，该突变的核酸的序列由5’端连接有Kozak序列的SEQ ID NO:1组成。
2.根据权利要求1所述的突变的核酸，其中，所述突变的核酸的序列如SEQ ID NO:2所示。
3.一种表达载体，其特征在于，该表达载体插入有权利要求1或2所述的突变的核酸。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其中，所述表达载体中的启动子为组成型启动子或诱导型启动子。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其中，所述表达载体中的启动子为Padh1启动子、Ppgk启动子或Pfbp启动子。
6.根据权利要求3所述的表达载体，其中，所述表达载体为在质粒pAUR123的BamHI酶切位点和XhoI酶切位点之间插入权利要求1或2所述的突变的核酸而得到的表达载体。
7.一种制备高抗逆性酵母菌株的方法，其特征在于，该方法包括：使用权利要求3-6中任意一项所述的表达载体转化酵母细胞，得到转化后的酵母细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，该方法还包括：将转化后的酵母细胞在胁迫培养基中进行培养。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述胁迫培养基含有1-5g/L的乙酸、1-6g/L的Na2SO4、20-60g/L的NaCl、10-30g/L的KCl、20-40g/L的NH4Ac、20-40g/L的NaAc、5-40g/L的KAc、0.1-0.5g/L的苯酚和0.1-0.5g/L的糠醛中的至少一种。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中，在胁迫培养基中进行培养的条件包括：温度为28-33℃，时间为24-72小时。
11.一种酵母菌株，该酵母菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的菌株，所述酵母菌株的保藏号为CGMCC No.8203。
12.权利要求11所述的酵母菌株在生产乙醇中的用途。
13.一种生产乙醇的方法，该方法包括：用权利要求11所述的酵母菌株对乙醇发酵原液进行乙醇发酵。
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