CN104560711A - 一种带自抗菌功能细胞培养微流控芯片 - Google Patents

一种带自抗菌功能细胞培养微流控芯片 Download PDF

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Abstract

一种带自抗菌功能细胞培养微流控芯片，由柔性聚合物表层薄膜、上层芯片、下层芯片、微阀和导管构成，所述柔性聚合物表层薄膜上设有细胞培养室、培养液导管通孔、培养废液微阀通孔、缓冲液导管通孔和富集腔微阀通孔；所述上层芯片上设有细胞培养室底槽、培养废液微阀底槽、培养废液出口、缓冲液导管底槽、细胞分离流道、富集腔、富集腔微阀底槽和分离废液出口；所述下层芯片上表面铺设有与上层芯片细胞培养室底槽、细胞分离流道和富集腔位置相对应的驱动电极；所述导管由培养液导管和缓冲液导管构成；所述微阀由培养废液微阀和富集腔微阀构成。本发明具有小型化、高效率、低成本、可重复使用、自抗菌功能等优点，在生物医学领域具有很大使用前景。

Description

一种带自抗菌功能细胞培养微流控芯片
技术领域
本发明属于微流控芯片技术领域，涉及一种带自抗菌功能细胞培养微流控芯片。
背景技术
微加工和微流控技术的发展，特别是微全分析系统概念的提出，开创了细胞培养芯片这一新的研究领域。常规的培养细胞多利用CO2培养箱中进行，在病毒学、免疫学、遗传学、肿瘤学等各个领域都得到了广泛的应用。将微流控芯片和细胞培养技术相结合所得到的细胞培养芯片，通过结构和微流体控制技术模拟细胞生长的真实环境，易于控制细胞生长的微环境，进行单细胞的控制和操纵。同时，培养芯片体积小，利于培养过程中直接观察细胞生长状态，细胞操作方法简单，节约试剂。
在细胞培养方面，污染是细胞培养技术中面临的主要问题。由于每一种细胞有其独特的培养体系，因此污染造成的后果也不尽相同。某些污染的发生往往难以察觉和检测，而且污染源能长期共存于培养体系中，这类污染事实上大部分被人们忽视了。培养的细胞作为一个生物体，会对培养环境以及环境中的污染物作出相应的反应，造成培养细胞生物学特性的改变,而对实验结果造成潜在的威胁，而且随着污染时间的延长而增加。
培养环境中的物理、化学及生物因素都可能侵入培养环境造成污染。由于入侵的微生物在培养体系中不断增殖、代谢，因此生物性的污染对细胞的危害最大。随着污染微生物的不断增殖，交叉污染的可能性也不断增加。此外，微生物代谢消耗大量必需的养分，同时产生多种有毒的代谢产物，如酶、抗原及毒素等，进一步对细胞产生毒害作用。
纳米银(Nano Silver)就是将粒径做到纳米级的金属银单质。纳米银粒径大多在0~100纳米左右，对大肠杆菌、淋球菌、沙眼衣原体等数十种致病微生物都有强烈的抑制和杀灭作用，而且不会产生耐药性。
发明内容
本发明的目的是提供一种带自抗菌功能细胞培养微流控芯片，在芯片结构制备过程中掺杂银纳米颗粒，实现具有自抗菌功能的微流控芯片制备，适用于两种以上混合细胞的培养、分离、富集及检测，具有小型化、高效率、低成本、可重复使用等优点，在生物医学领域具有很大使用前景。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种带自抗菌功能细胞培养微流控芯片，由柔性聚合物表层薄膜、上层芯片、下层芯片、微阀和导管构成，其中：
所述柔性聚合物表层薄膜上设有细胞培养室、培养液导管通孔、培养废液微阀通孔、缓冲液导管通孔和富集腔微阀通孔；
所述上层芯片上设有细胞培养室底槽、培养废液微阀底槽、培养废液出口、缓冲液导管底槽、细胞分离流道、富集腔、富集腔微阀底槽和分离废液出口，其中：细胞培养室底槽与细胞培养室对接，培养废液微阀底槽与培养废液微阀通孔对接，缓冲液导管底槽与缓冲液导管通孔对接，富集腔微阀底槽与富集腔微阀通孔对接，细胞分离流道分别与细胞培养室底槽、缓冲液导管底槽和富集腔连通，富集腔微阀底槽分别与富集腔和分离废液出口连通；
所述下层芯片上表面铺设有与上层芯片细胞培养室底槽、细胞分离流道和富集腔位置相对应的驱动电极，即抛物线式电极区、分离叉指电极和富集叉指电极区，抛物线式电极区、分离叉指电极和富集叉指电极区均连接有金属焊点；
所述导管由培养液导管和缓冲液导管构成，培养液导管与培养液导管通孔对接，缓冲液导管与缓冲液导管通孔对接；
所述微阀由培养废液微阀和富集腔微阀构成，培养废液微阀与培养废液微阀通孔对接， 富集腔微阀与富集腔微阀通孔对接。
本发明中，所述柔性聚合物表层薄膜、上层芯片和下层芯片可使用PDMS、环氧树脂（epoxy resin）、硅胶等作为基底，基底中均混有纳米银粉，纳米银粉的加入量为基底的1~5wt.%。
本发明中，所述细胞培养室直径为0.4~5cm，细胞分离流道宽度为0.05~1mm，富集腔宽2~5mm、长3~8mm；微阀内径为0.1~1mm；芯片外部尺寸长50~100mm，宽50~100mm，满足小型化要求。
本发明具有如下优点：
1、纳米载银无机抗菌剂是一种新型抗菌剂，由具有抑菌活性的银离子包覆在纳米级载体(如沸石、磷酸锆等)上构成。使用过程中载体释放出银离子破坏微生物膜屏障结构、原生质酶活性及DNA 分解，从而起到杀灭微生物的作用。本发明提供的自抗菌功能细胞培养微流控芯片集细胞分离和检测功能于一体。
2、本发明利用纳米银的抗菌功能，在细胞培养微流控芯片结构制作过程中将纳米银颗粒掺杂进入芯片结构，使细胞在整个培养过程中时刻起到抑制、消灭细菌作用，大大减小细胞培养期间受污染的可能。
3、本发明利用微流控芯片多功能集成特点，借鉴介电电泳细胞分离技术，设计功能电极单元，根据不同细胞的介电性质不同，利用介电力实现细胞的定向移动，实现细胞的富集检测功能。
4、本发明可实现灌流式细胞培养过程中培养液的连续更换，长时抗菌功能。
5、本发明作为一种非接触式的细胞培养、分离技术，具有效率高、污染小、易于操作简单、试剂消耗少、便于观察分析等优点，在生物领域和医学领域具有重要意义。
附图说明
图1为本发明提供的自抗菌功能细胞培养芯片结构三维分解示意图；
图2为下层芯片微电极结构平面俯视图；
图3为本发明培养的肾癌细胞细胞实物图；
图中，1-下层芯片；2-上层芯片；3-柔性聚合物薄膜；4-培养废液微阀；5-缓冲液导管；6-培养液导管；7-1号富集腔微阀；8-2号富集腔微阀；9-培养废液微阀通孔；10-缓冲液导管通孔；11-培养液导管通孔；12-1号富集腔微阀通孔；13-2号富集腔微阀通孔；14-细胞培养室；15-细胞培养室底槽；16-培养废液微阀槽；17-缓冲液导管槽；18-细胞分离流道；19-1号富集腔；20-2号富集腔；21-1号富集腔微阀底槽；22-2号富集腔微阀底槽；23-培养废液出口；24-1号分离废液出口；25-2号分离废液出口；26-金属焊点；27-分离叉指电极；28-1号富集腔叉指电极；29-2号富集腔叉指电极；30-抛物线电极。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
如图1-2所示，本发明提供的带自抗菌功能细胞培养微流控芯片由下层芯片1、上层芯片2、柔性聚合物薄膜3、微阀和导管构成，其中：
所述柔性聚合物表层薄膜3上设有细胞培养室14、培养液导管通孔11、培养废液微阀通孔9、缓冲液导管通孔10、1号富集腔微阀通孔12和2号富集腔微阀通孔13。
所述上层芯片2上设有细胞培养室底槽15、培养废液微阀底槽16、培养废液出口23、缓冲液导管底槽17、细胞分离流道18、1号富集腔19、2号富集腔20、1号富集腔微阀底槽21、2号富集腔微阀底槽22、1号分离废液出口24和2号分离废液出口25。其中：细胞培养室底槽15与细胞培养室14对接，培养废液微阀底槽16与培养废液微阀通孔9对接，缓冲液导管底槽17与缓冲液导管通孔10对接，1号富集腔微阀底槽21与1号富集腔微阀通孔12对接，2号富集腔微阀底槽22与2号富集腔微阀通孔13对接，细胞分离流道18分别与细胞培养室底槽15、缓冲液导管底槽17、1号富集腔19和2号富集腔20连通，1号富集腔微阀底槽21分别与1号富集腔19和1号分离废液出口24连通，2号富集腔微阀底槽22分别与2号富集腔20和2号分离废液出口25连通。
下层芯片1上铺有分离叉指电极27、1号富集叉指电极区28、2号富集叉指电极区29和抛物线式电极区30，其中：抛物线式电极区30与细胞培养室底槽15的位置相对应，分离叉指微电极区27与细胞分离流道18的位置相对应，1号富集叉指微电极区28与1号富集腔19的位置相对应，2号富集叉指微电极区29与2号富集腔20的位置相对应，分离叉指微电极区27、1号富集叉指电极区28、2号富集叉指电极区29和抛物线式电极区30均连接有金属焊点26。
上层柔性薄膜的作用主要是封闭细胞分离流道18、1号富集腔19和2号富集腔20。
采用氧等离子体辉光放电技术对三层结构进行表面处理，并按照上述对接位置紧密键合在一起。
最后将培养废液微阀4与培养废液微阀通孔9对接， 1号富集腔微阀7与1号富集腔微阀通孔12对接，2号富集腔微阀8与2号富集腔微阀通孔13对接，培养液导管6与培养液导管通孔11对接，缓冲液导管5与缓冲液导管10对接，完成整个芯片的组装。
上述带自抗菌功能细胞培养微流控芯片的制作方法，包括如下步骤：
一、用超精密铣削工艺在有机玻璃上加工制得上层芯片腔体与内部液体流道相一致的阳模，应用二次模板复制加工工艺（参见ZL200510127395.2），制备以聚二甲基硅氧烷（PDMS）为基底的芯片微结构。将PDMS预聚体与固化剂以10:1的比例混合，再加入纳米银颗粒，其加入量为PDMS的1~5wt.%，充分混合。真空排气至混合物无气泡，浇铸在阳模上，在50~90℃真空干燥箱中静置1~2小时，固化后脱模，制得所述上层芯片主结构。
二、采用氧等离子体辉光放电技术对三层结构进行表面处理，并按照上诉对接位置紧密键合在一起。
三、压焊，在相应位置组装微流体控制器件，如微阀。
短期培养细胞：
培养细胞前，先将整个芯片进行高温灭菌消毒。
培养过程中，关闭培养废液微阀4、1号富集腔微阀7和2号富集腔微阀8，由培养液导管6向细胞培养室14内输入培养液，在细胞培养室14内培养细胞。换液时，由培养液导管6输入新的培养液，同时适当打开培养废液微阀4，控制流量，保持细胞培养室14内的液面高度。
同时，可对下层芯片1上的抛物线式电极区30加以适当频率和电压大小的交流电，利用介电力控制细胞的生长范围，方便对细胞生长状况进行实时观察。
培养过程中，1号富集腔微阀7和2号富集腔微阀8始终处在关闭状态。
利用本发明提供的芯片培养肾癌细胞的细胞实物图如图3所示。
分离混合细胞：
分离前，关闭培养废液微阀4，打开1号富集腔微阀7和2号富集腔微阀8，同时由缓冲液导管5向芯片内注入相应的缓冲液。保持细胞培养室14内一定的液面高度。
然后将细胞混合液滴入细胞培养室14内，使得混合细胞在缓冲液的带动下经过细胞分离流道18。
在分离过程中，下层芯片1上的分离叉指电极27始终加以适当频率和电压大小的交流电，将频率控制在某一特定范围，使其对不同细胞产生不同方向的介电力，使得细胞在经过铣刨分离通道18后，分别流入不同的支流，进入不同的细胞富集腔。
下层芯片的1号富集叉指电极区28和2号富集叉指电极区29，同样加以适当的交流电，使得其电场对细胞的介电力足够大，将分离后的细胞束缚在1号富集叉指电极区28和2号富集叉指电极区29上方富集，使得其停留在1号富集腔19和2号富集腔20内，不随废液流出。方便制作高纯度生物样品或达到一定的检测值。
检测特定细胞：
在芯片键合之前，在1号富集叉指电极区28和2号富集叉指电极区29的电极表面上做相应的修饰，使其表面带有相应的抗体。
具体操作过程与分离细胞时大致相同，实验过程中时刻关注1号富集腔19和2号富集腔20内是否有相关的现象。

Claims (8)

1.一种带自抗菌功能细胞培养微流控芯片，其特征在于所述芯片由柔性聚合物表层薄膜、上层芯片、下层芯片、微阀和导管构成，其中：
所述柔性聚合物表层薄膜上设有细胞培养室、培养液导管通孔、培养废液微阀通孔、缓冲液导管通孔和富集腔微阀通孔；
所述上层芯片上设有细胞培养室底槽、培养废液微阀底槽、培养废液出口、缓冲液导管底槽、细胞分离流道、富集腔、富集腔微阀底槽和分离废液出口，其中：细胞培养室底槽与细胞培养室对接，培养废液微阀底槽与培养废液微阀通孔对接，缓冲液导管底槽与缓冲液导管通孔对接，富集腔微阀底槽与富集腔微阀通孔对接，细胞分离流道分别与细胞培养室底槽、缓冲液导管底槽和富集腔连通，富集腔微阀底槽分别与富集腔和分离废液出口连通；
所述下层芯片上表面铺设有与上层芯片细胞培养室底槽、细胞分离流道和富集腔位置相对应的驱动电极；
所述导管由培养液导管和缓冲液导管构成，培养液导管与培养液导管通孔对接，缓冲液导管与缓冲液导管通孔对接；
所述微阀由培养废液微阀和富集腔微阀构成，培养废液微阀与培养废液微阀通孔对接， 富集腔微阀与富集腔微阀通孔对接。
2.根据权利要求1所述的带自抗菌功能细胞培养微流控芯片，其特征在于所述细胞培养室直径为0.4~5cm。
3.根据权利要求1所述的带自抗菌功能细胞培养微流控芯片，其特征在于所述细胞分离流道宽度为0.05~1mm。
4.根据权利要求1所述的带自抗菌功能细胞培养微流控芯片，其特征在于所述富集腔宽2~5mm、长3~8mm。
5.根据权利要求1所述的带自抗菌功能细胞培养微流控芯片，其特征在于所述微阀内径为0.1~1mm。
6.根据权利要求1所述的带自抗菌功能细胞培养微流控芯片，其特征在于所述芯片外部尺寸长50~100mm，宽50~100mm。
7.根据权利要求1所述的带自抗菌功能细胞培养微流控芯片，其特征在于所述柔性聚合物表层薄膜、上层芯片和下层芯片使用PDMS、环氧树脂或硅胶作为基底，基底中混有纳米银粉。
8.根据权利要求1所述的带自抗菌功能细胞培养微流控芯片，其特征在于所述纳米银粉的加入量为基底的1~5wt.%。
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