CN104558098A - 硫醇基官能化试剂及其用途 - Google Patents

硫醇基官能化试剂及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用聚(亚烷基二醇)分子对多肽进行官能化的试剂和方法，其基于包含具有乙烯基取代基的含氮芳香杂环的官能化试剂，所述乙烯基取代基能与天然存在于所述多肽中的或者引入所述多肽中的一个或更多个硫醇基反应(例如利用一个或更多个半胱氨酸残基的硫醇基)。所述官能化试剂与聚(亚烷基二醇)分子(例如聚乙二醇(PEG)分子)共价连接，使得所述乙烯基与所述多肽中硫醇基之间的反应将所述多肽与所述聚(亚烷基二醇)分子共价连接。

Description

硫醇基官能化试剂及其用途
本申请是申请号为200980154905.1、发明名称为“硫醇基官能化试剂及其用途”的申请的分案申请，该母案申请是2009年12月21日提交的PCT申请PCT/GB2009/002924进入中国国家阶段的申请。
技术领域
本发明涉及官能化试剂以及利用它们修饰蛋白质和多肽的方法。本发明还涉及通过本发明方法制备的官能化多肽的用途。更具体而言，本发明应用与偶联伴侣(coupling partner)共价连接的官能化试剂，所述官能化试剂包含具有乙烯基取代基的含氮芳香杂环。典型地，所述偶联伴侣(例如聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团)能够改变多肽的性质。
背景技术
现有技术中已知，可使聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)聚合物与治疗性多肽共价连接，该过程称为聚乙二醇化(PEG化)。通常典型地使用包含官能团(例如羟基、巯基、胺基或羧酸基团)的衍生物使多肽与PEG分子的反应性衍生物反应来进行PEG化。在PEG化反应中，PEG分子的反应性官能团与多肽中存在的氨基酸的氨基、羧基或硫醇基基团或者与多肽的反应性N-末端或C-末端形成稳定的共价键。一般而言，PEG化反应需要使用反应性交联剂，例如马来酰亚胺。
然而，还已知PEG化是相对不受控制的反应，主要是因为使用反应性交联剂，并且因为PEG分子可以多种不同的方式与多肽中存在的多个官能团反应，从而产生不均一的产物。这意味着所得PEG化多肽可具有直链或支链结构和/或可具有可变数量的与每个多肽偶联的PEG分子。该反应还受诸如蛋白质类型和浓度、反应时间、温度和pH值的因素的影响，所有这些因素均对反应最终产物有影响。
一般而言，进行PEG化以影响多肽(尤其是静脉内施用的那些)的药代动力学或免疫学特性。特别地，可对多肽进行改变以改善其稳定性、生物半衰期、水溶性和免疫学特性。认为对多肽进行PEG化使其质量增加(例如增加20-50kDa)意味着其更不容易通过肾脏排泄，因此在体内存在更长时间。此外，认为PEG化多肽被保护而不受内源性酶的降解。这也有助于延长其体内半衰期。还认为延长体内半衰期和提高多肽药物效力可导致降低患者需要的多肽的频率或剂量，从而有助于降低针对多肽的免疫反应。PEG化还可有助于提高疏水性多肽的水溶性。
然而，虽然PEG化多肽的特性是所期望的(尤其是对于治疗性多肽而言)，但是在PEG化反应中缺乏控制仍然是一个问题，因为这常常得到一系列具有多种不同特性的产物。此外，因为多肽是复杂分子，所以难以使用保护基来控制反应的位点和/或程度，例如这在小分子化学中是可能的。
多肽糖基化是翻译后修饰的天然形式，其改变多肽的结构和功能。从本质上来说，糖基化是由导致不同类型糖基化多肽的位点特异性修饰的酶促过程介导的。在N-连接的糖基化中，聚糖与天冬酰胺侧链的酰胺氮相连，在O-连接的糖基化中，聚糖与丝氨酸和苏氨酸侧链的羟基氧相连。其它形式的糖基化包括与丝氨酸的羟基氧相连的糖胺聚糖、其中聚糖与神经酰胺相连的糖脂、不与蛋白质或脂质相连的透明质酸、以及通过聚糖连接使蛋白质与脂质相连的GPI锚定蛋白。
现有技术中存在的普遍问题是糖基化常添加到真核细胞中的多肽上，而很少添加到在常用治疗性多肽重组表达的原核宿主中表达的多肽上。在原核宿主中产生的多肽缺少糖基化可导致所述多肽被识别为异物或者意味着它们具有不同于其天然形式的其它特性。难以通过基因工程在多肽的非天然糖基化位点上进行糖基化以试图将这用于调节多肽特性也是一个问题。
WO 88/05433公开了用于制备多肽与信号产生或细胞毒性化学实体之缀合物的交联剂。所述交联剂由一系列含氮芳香杂环化合物组成，特别是2-、3-或4-乙烯基吡啶和乙烯基嘧啶，所述信号产生或细胞毒性化学实体可通过所述交联剂中存在的活化酯取代基与所述含氮芳香杂环化合物相连。缀合反应在于使所述试剂的乙烯基与多肽中存在的硫醇基反应。WO 88/05433中公开的化合物均包含吸电子取代基作为所述含氮芳香杂环的官能团。还应当注意的是，WO 88/05433未提供任何表明利用交联剂使信号产生或细胞毒性化学实体与多肽相连的实施例。
WO 2005/024041描述了用于蛋白质组学方法中的对两个或更多个细胞群中蛋白质加质量标签的方法。该加标签方法包括使一个群中的半胱氨酸残基与2-乙烯基吡啶反应，而另一个群中的半胱氨酸残基与C1-4烷基取代的2-乙烯基吡啶反应，从而产生具有可通过质谱区分之质量的加标签蛋白质。
Banas等人(Biochimica et Biophysica Acta，957(2)：178-84，1988)研究了大肠杆菌(E.coli)磷酸果糖-1-激酶半胱氨酸残基的反应性，利用乙烯基吡啶、溴代丙酮酸酯和二硫代硝基苯甲酸来确定多肽中存在的6个半胱氨酸残基的相对反应性。
Fullmer(Analytical Biochemistry，142(2)：336-9，1984)描述了改进肽中氨基酸组成分析的方法，特别是半胱氨酸和色氨酸鉴定的方法。改进之一采用4-乙烯基吡啶来保护二硫键还原断裂之后肽中存在的一半半胱氨酸残基，因为所产生的半胱氨酸衍生物对酸水解稳定。
现有技术中在改善用偶联伴侣(如PEG分子和聚糖基团)衍生化多肽方面仍然存在问题。
发明内容
概括而言，本发明涉及用例如聚(亚烷基二醇)分子和聚糖基团的部分对多肽进行官能化的化合物及其使用方法。该化学是基于包含具有乙烯基取代基的含氮芳香杂环的官能化试剂之上的，所述乙烯基取代基能够与多肽中天然存在的或被引入其中的一个或更多个硫醇基反应，例如通过使用一个或更多个半胱氨酸残基的硫醇基。一般而言，所述官能化试剂与聚(亚烷基二醇)分子(例如聚乙二醇(PEG)分子)或聚糖基团共价连接，因此所述乙烯基与多肽中硫醇基之间的反应使得所述多肽与所述聚(亚烷基二醇)分子和/或所述聚糖基团共价连接。
因此，在一个方面中，本发明提供了这样的方法，其包括使具有至少一个反应性硫醇基的多肽与包含具有乙烯基取代基的含氮芳香杂环的官能化试剂反应，所述乙烯基取代基能够与多肽中至少一个硫醇基反应，其中所述官能化试剂与聚(亚烷基二醇)分子和/或聚糖基团共价连接，以便所述官能化试剂的乙烯基取代基与所述多肽的硫醇基反应，从而使所述聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团与所述多肽共价连接。
在另一个方面中，本发明提供了对具有至少一个反应性硫醇基的多肽进行修饰(例如PEG化或糖基化)的方法，所述方法包括使所述多肽与包含具有乙烯基取代基的含氮芳香杂环的官能化试剂反应，所述乙烯基取代基能够与多肽中至少一个硫醇基反应，其中所述官能化试剂与聚(亚烷基二醇)分子(例如聚乙二醇(PEG)分子)或聚糖基团共价连接，以便所述官能化试剂的乙烯基取代基与所述多肽的硫醇基反应，从而使所述聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团与所述多肽共价连接。
除了使所述官能化试剂与所述多肽反应以将它们连接在一起的步骤之外，本发明的方法还可包括一个或更多个步骤。例如，所述方法可包括使包含具有乙烯基取代基的含氮芳香杂环的官能化试剂前体与所述聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团反应以产生所述官能化试剂的起始步骤。作为替代或者补充，所述方法可包括以下起始步骤：确定多肽中反应性硫醇基的位置、选择用于与本发明官能化试剂反应的一个或更多个硫醇基、以及任选地保护剩余硫醇基中的一些。然后可使所述多肽与本文所述的官能化试剂反应。通过上文应当理解，所述乙烯基与所述多肽硫醇基的反应通常产生-CH2-CH2-S-基团，其使所述官能化试剂与所述多肽共价连接。在该反应中产生的硫醚键在生物条件下通常非常稳定。该稳定性可与现有技术中使用马来酰亚胺作为交联剂形成对比，使用马来酰亚胺作为交联剂具有潜在缺点，当用其对多肽进行衍生化时，多肽在储存过程中发生反应，例如开环。
在其中所述多肽不包含合适的硫醇基或者所述多肽链的所期望位置中不包含合适的硫醇基的本发明实施方案中，本发明可包括对母体多肽进行修饰的起始步骤，例如通过化学反应或定点突变产生在所述多肽的一个或更多个期望位置上具有硫醇基的变体多肽。优选地，这是通过用半胱氨酸残基替代所述多肽中一个或更多个氨基酸来实现的。在涉及多肽糖基化的本发明实施方案中，可对所述母体多肽的天然糖基化位点进行修饰，例如对天冬酰胺、苏氨酸或丝氨酸残基进行修饰，以引入之后可与包含一个或更多个聚糖基团的官能化试剂反应的硫醇基。这是可以进行的，例如当母体多肽的该位点未糖基化时(例如作为其所产生之方式的结果)，或者当糖基化已被除去时。
作为替代或者补充，本发明方法可包括对与反应性硫醇基空间上接近的氨基酸残基进行修饰以提高硫醇基对官能化试剂的反应活性。例如，可对空间上接近的氨基酸残基进行修饰来改变所述反应性硫醇基周围的局部pH、氢键相互作用、水化(waters of hydration)、或空间可接近性。
优选地，所述反应性硫醇基(不论其是天然存在于多肽中还被引入的)是半胱氨酸氨基酸残基的一部分。
在进行上文所述的方法后，然后可在一个或更多个其它步骤中对所述PEG化或糖基化多肽进行纯化或分离。
在又一个方面中，本发明提供了下式所示的用于用聚(亚烷基二醇)或聚糖基团对多肽进行官能化的化合物：
其中：
X和Y独立地选自CH或N；
其中至少R1以及任选地R2与聚(亚烷基二醇)分子和/或聚糖基团共价连接；
其中：
R1以及任选地R2独立地选自：-(CH2)n-Z-(CH2)o-R，其中Z是O、S或NH，n是0至10，o是0至10，并且其中R是氢、聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团；或者
-C(O)-Z-(CH2)o-R，Z是O、S或NH，o是0至10，并且其中R是氢、聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团；或者
-(CH2)n-Z-C(O)-(CH2)o-R，其中Z是O、S或NH，n是0至10，o是0至10，并且其中R是氢、聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团；或者
-Y-(CH2)n-Z-C(O)-(CH2)o-R，其中Y是芳基基团、O、S或NH，Z是O或NH，n是0至10，o是0至10，并且其中R是氢、聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团；或者
-Y-R，其中Y是O或S，R是氢、聚糖、聚(亚烷基二醇)分子、芳基或C1-10烷基；
前提是当R2不与聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团相连时，其可另外选自氢或吸电子基团，例如卤素(F、Cl或Br)、-NO2、-CO2H、-CO2R4、COR4、-CHO、-CN、-CF3、-SO2NR4R5、烷基或苯基，其中R4和R5独立地选自氢或C1-10烷基；
或者R2和R3一起形成稠合(杂)芳香环取代基，其可包括但不限于吲哚、吲唑、苯并咪唑、喹啉、异喹啉、氮丙啶(aziradine)或嘌呤；
或者R3选自氢或选自以下的取代基：卤素；羟基；醚(例如C1-7烷氧基)；甲酰基；酰基(例如C1-7烷基酰基、C5-20芳基酰基)；羧基；酯；酰氧基；酰胺基(amido)；酰基胺基(acylamido)；硫代酰胺基(thioamido)；四唑基；氨基(amino)；硝基；亚硝基；叠氮基；氰基；异氰基；氰氧基(cyanato)；异氰氧基(isocyanato)；硫氰基；异硫氰基；硫醚(例如C1-7烷硫基)；磺酸；磺酸酯/盐；砜；磺酰基氧基；亚磺酰基氧基；硫酰氨基(sulfamino)；磺酰氨基(sulfonamino)；亚磺酰氨基(sulfinamino)；氨磺酰基；磺酰胺基；C1-7烷基(包括例如未被取代的C1-7烷基、C1-7卤代烷基或C1-7羟基烷基、C1-7羧基烷基、C1-7氨基烷基)。
在一些实施方案中，就上文所述的连接基而言，Y是O或NH，其它基团如上文所定义。作为补充或替代，所述吸电子基团不是烷基。
优选地，所述含氮芳香杂环是取代的吡啶环(X和Y都是CH)或取代的嘧啶环(X和Y之一是CH，另一个为N)。
优选地，用于使所述聚(亚烷基二醇)分子和/或所述聚糖基团与所述含氮芳香杂环相连的R1和/或R2基团独立地选自-(CH2)n-Z-(CH2)o-R或-C(O)-Z-(CH2)o-R，其中取代基如上文所定义。更优选地，在R1和R2基团中，o是0并且所述基团可表示为-(CH2)n-Z-R或-C(O)-Z-R，其中取代基如上文所定义。
通过包括与所述含氮芳香杂环相连的一个或两个基团可以是聚(亚烷基二醇)分子和/或聚糖基团的可能性，本发明使得R1和R2都能是聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团，或者一个是聚(亚烷基二醇)分子，一个是聚糖基团，从而得到混合的官能化试剂。
优选地，所述含氮芳香杂环是吡啶环、嘧啶环或叠氮环(azidinering)。更优选地，所述含氮芳香杂环是吡啶环或嘧啶环，最优选地，其为吡啶环。当使用吡啶环或嘧啶环时，优选地，所述乙烯基相对于氮杂原子而言处在2位。
然而，在一些实施方案中，可使用更延长的稠合芳香杂环体系，例如吲哚、吲唑、苯并咪唑、喹啉、异喹啉、氮丙啶或嘌呤。
一般而言，所述聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团与上述式中所示的R1和/或R2基团直接共价相连。所述连接基可具有不同的长度以使所述聚(亚烷基二醇)分子或所述聚糖基团离所述多肽更近或更远。可选择所述连接基(linker)的长度。
然而，在一些实施方案中，在所述R1基团和所述聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团之间包括延长的连接基可能是理想的。这样的连接基可能是改变官能化基团的溶解性或免疫学特性所必需的。
本发明优选的一类官能化试剂可以下述通式表示：
其中：
至少R1以及任选地R2与聚(亚烷基二醇)分子和/或聚糖基团共价连接；
并且进一步其中：
R1以及任选地R2独立地选自：-(CH2)n-Z-(CH2)o-C(O)-R，其中Z是O、S或NH，n是0至10，o是0至10，并且其中R是氢、聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团；或者
-(CH2)n-Z-(CH2)o-R，其中Z是O、S或NH，n是0至10，o是0至10，并且其中R是氢、聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团；或者
-C(O)-Z-(CH2)o-R，Z是O、S或NH，o是0至10，并且其中R是氢、聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团；或者
-(CH2)n-Z-C(O)-(CH2)o-R，其中Z是O、S或NH，n是0至10，o是0至10，并且其中R是氢、聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团；或者
-Y-(CH2)n-Z-C(O)-(CH2)o-R，其中Y是芳基基团、O、S或NH，Z是O或NH，n是0至10，o是0至10，并且其中R是氢、聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团；或者
-Y-R，其中Y是O或S，R是氢、聚糖、聚(亚烷基二醇)分子、芳基或C1-10烷基；
前提是当R2不与聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团相连时，其可另外选自氢或吸电子基团，例如卤素(F、Cl或Br)、-NO2、-CO2H、-CO2R4、COR4、-CHO、-CN、-CF3、-SO2NR4R5、烷基或苯基，其中R4和R5独立地选自氢或C1-10烷基。
在优选的一类官能化试剂中，
R1是-(CH2)n-Z-(CH2)o-C(O)-R，其中Z是O、S或NH，n是0至10，o是0至10，并且其中R是一个或多个聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团；和/或
R2是氢、烷基或-(CH2)n-Z-(CH2)o-C(O)-R，其中Z是O、S或NH，n是0至10，o是0至10，并且其中R是一个或多个聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团。
在又一个方面中，本发明提供了包含一个或多个聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团的多肽缀合物，其中所述多肽是治疗性多肽，其通过其中存在的硫醇基和上文所述的官能化试剂与所述聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团共价连接。
在又一个方面中，本发明提供了用于治疗的上文所述的多肽缀合物。
下面通过举例(而不限于此)并参照附图来描述本发明的实施方案。
附图说明
图1.一系列连接基与谷胱甘肽的相对反应速率。
图2.用乙烯基吡啶-PEG衍生物对比马来酰亚胺-PEG来标记人重组干扰素-β。
图3.pH对用乙烯基吡啶-5k-PEG标记BSA的速率的影响。
图4.5kDa PEG/吡啶与重组IFN-β(C17S，D80N)反应的温度依赖性。
图5.用PermaLink对模型蛋白质进行官能化。
图6.连接基对半胱氨酸残基的特异性。
发明详述
多肽
本发明方法通常适用于一系列基于能够特异性和直接地引入官能团(特别是将聚(亚烷基二醇)分子和聚糖基团引入到多肽中)的反应之上的应用。所述方法适用于任何大小或类型的多肽，从单个氨基酸和肽至分子量高达或超过100kDa的多肽和蛋白质。因此，方便时，本文所述的方法通常用“多肽”来描述，应当考虑的是这包括较短序列的氨基酸(例如长度从2、3、4、5或10个氨基酸至长度为30、40或50个氨基酸)，现有技术中有时称其为肽。还应当考虑的是该术语包括通常称为蛋白质的具有二级、三级或四级结构的多肽以及多结构域蛋白质。
本文所公开的方法和试剂特别可用于对治疗性多肽进行官能化，例如来改变其药理学特性(例如稳定性、生物半衰期或水溶性)或多肽的免疫学性质。
可根据本发明进行修饰的合适种类的多肽的实例包括促红细胞生成素(EPO)、干扰素、白细胞介素、趋化因子、淋巴因子、细胞因子、胰岛素、单克隆抗体及片段、重组抗体及片段、凝血因子、集落刺激因子(CSF)、生长激素、纤溶酶原激活因子、病毒衍生肽、生殖激素、治疗性酶和载体蛋白质(例如用于制备缀合疫苗)。可使用的多肽的具体实例包括集落刺激因子(CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、因子VIIa、因子VIII、因子IX、人生长激素(hGH)、DNA酶、胰岛素、胰高血糖素、VEGF、VEGF受体、TNF、TNF受体、血小板衍生生长因子(PDGF)、组织纤溶酶原激活因子(tPA)、促红细胞生成素(EPO)、恩夫韦肽(enfurvirtide)、胰岛素样生长因子(IGF)、神经生长因子(NGF)、IL-1、IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、IL-24、干扰素β-1a、干扰素β-1b、干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素α或干扰素γ。
在本发明中，作为抗体的多肽的含义包括天然或者部分或全部合成产生的免疫球蛋白。该术语还涵盖包含抗原结合结构域的任何多肽或蛋白质。包含抗原结合结构域的抗体片段包括Fab、scFv、Fv、dAb、Fd片段、双功能抗体(diabody)、三功能抗体(triabody)或纳米抗体。可利用单克隆抗体和其它抗体并采用重组DNA技术来产生保留原始抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。这样的技术可包括将编码抗体的互补决定区(CDR)或免疫球蛋白可变区的DNA引入到不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区中。参见例如EP 0 184 187A、GB 2,188,638或EP 0 239 400A。抗体可以多种方式进行修饰，并且所述术语应当解释为涵盖含有具有所需特异性之抗体抗原结合结构域的任何特异性结合成员或物质。因此，该术语涵盖抗体片段和衍生物，包括包含天然或者全部或部分合成的免疫球蛋白结合结构域的任何多肽。因此，包含与另一条多肽相融合的免疫球蛋白结合结构域或其等价物的嵌合分子也包括在其中。嵌合抗体的克隆和表达描述于EP 0 120 694A和EP 0 125023A中。
已表明，全抗体的片段可执行结合抗原的功能。结合片段的实例是(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段；(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iii)由单一抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)由VH结构域组成的dAb片段(Ward，E.S.等，Nature341，544-546(1989)))；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab’)2片段，包含两个相连Fab片段的双价片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域通过肽接头相连，所述肽接头允许所述两个结构域相结合形成抗原结合位点(Bird等，Science，242；423-426，1988；Huston等，PNAS USA，85：5879-5883，1988)；(viii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)以及(ix)“双功能抗体”，通过基因融合构建的多价或多特异性片段(WO 94/13804；Holliger等，P.N.A.S.USA，90：6444-6448，1993)。可通过引入连接VH和VL结构域的二硫键桥使Fv、scFv或双功能抗体分子稳定化(Reiter等，Nature Biotech，14：1239-1245，1996)。也可制备包含与CH3结构域相连的scFv的微抗体(Hu等，Cancer Res.，56：3055-3061，1996)。
对蛋白质进行修饰或官能化的方法
本发明提供了一种利用多肽中存在的或之前已引入到多肽中的硫醇基(例如在一个或更多个半胱氨酸残基上)对目的蛋白质进行修饰或者官能化的便利方法。在优选的实施方案中，本文所公开的方法采用适用于修饰蛋白质和其它生物材料的试剂和条件。特别地，本发明方法中所用的反应条件有助于避免当利用现有技术中的试剂(例如马来酰亚胺)时易出现的问题，利用马来酰亚胺易于产生具有一系列不同特性的不同产物的混合物。如上文所述，可利用现有的硫醇基或者通过在所述方法的初始步骤中引入硫醇基(例如通过使多肽的一个或更多个官能团反应而产生硫醇基，或者通过将硫醇基或其前体引入到多肽中)，来对目的多肽进行修饰。例如，这可包括将半胱氨酸残基引入到所述多肽的期望对其进行官能化的位点上的步骤。这可应用于用于本发明反应的便利的半胱氨酸残基不存在于起始或野生型多肽中的情形下。方便地，这可利用多肽定点突变来实现，现有技术中已经充分确认了定点突变的用途。
本发明的方法特别适用于利用聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团对多肽进行官能化。本发明方法和试剂的一个优选用途是用于利用一个或更多个聚糖基团对目的多肽进行糖基化。所述糖基可以是天然或合成的单糖、寡糖或多糖。该方法可用于对目的蛋白质进行糖基化，或者用于在希望进行糖基化而在蛋白质产生过程中未引入糖基化的情形下引入糖基化，例如由于蛋白质已经在细菌细胞中产生这一事实，或者特别是对于肽而言它们已经通过化学合成而产生的情况下。
利用本发明控制确定位点上糖基化的能力代表了用于改造重组蛋白质(例如治疗性蛋白质和抗体以及其片段)的有用工具，体现在其制备中以及在控制其免疫原性和药理学特性(例如半衰期)中。目前，重组蛋白质治疗剂的制造昂贵并且缓慢，因为常使用哺乳细胞系来制造以保证蛋白质被糖基化。本文所公开的方法可用于在细菌细胞系中制备之后对多肽添加糖基化，在细菌细胞系中表达的效率通常更高，从而有助于提高蛋白质生产的速度和/或经济性，同时保留糖基化。或者，对于在使表达产物糖基化的细胞系中表达的多肽而言，本发明可用于修饰或添加糖基化。
在优选的实施方案中，所用的碳水化合物可包括通常在N-或O-连接的糖蛋白上出现的天然支链寡糖的化学修饰衍生物或其降解产物。可用在本发明中的糖基是本领域中众所周知的，包括存在于N-或O-连接的糖基化真核细胞蛋白质中的糖基和人造糖基，例如参见WO03/025133和WO 2004/083807中所公开的糖基及其制备和鉴定方法。
在序列肽段中，发现N-连接的聚糖与天冬酰胺的R-基团氮(N)相连。所述序列肽段是Asn-X-Ser或Asn-X-Thr序列，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸，并且可包括N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖、神经氨酸、N-乙酰基葡糖胺、果糖、麦芽糖、岩藻糖和其它单糖。
在真核细胞中，N-连接的聚糖来源于细胞质和内质网中组装的核心14-糖单元。首先，将2个N-乙酰基葡糖胺残基连接到多萜醇磷酸酯上，所述多萜醇磷酸酯是内质网膜外侧上的脂质。然后将5个甘露糖残基添加到该结构上。此时，部分完成的核心聚糖跨越在所述内质网膜上，使其现在位于网状腔(reticular lumen)内。然后继续在内质网中组装，添加4个另外的甘露糖残基。最后，向此结构上添加3个葡萄糖残基。全部组装完毕后，所述聚糖通过糖基转移酶、寡糖基转移酶整体转移到网状腔内的新生肽链上。因此，该N-连接聚糖的核心结构由14个残基(3个葡萄糖、9个甘露糖和2个N-乙酰基葡糖胺)组成。
在真核细胞中，O-连接聚糖每次将一个糖组装到高尔基体中肽链的丝氨酸或苏氨酸残基上。与N-连接聚糖不同，到目前为止还没有已知的共有序列。然而，在所述丝氨酸或所述苏氨酸的-1或+3位上将脯氨酸替代有利于O-连接糖基化。
O-连接聚糖合成中所连接的第一个单糖是N-乙酰基-半乳糖胺。此后，几个不同的路径都是可行的。核心1结构是通过添加半乳糖而生成的。核心2结构是通过将N-乙酰基-葡糖胺添加到所述核心1结构的N-乙酰基-半乳糖胺上而生成的。核心3结构是通过将单个N-乙酰基-葡糖胺添加到初始的N-乙酰基-半乳糖胺上而生成的。核心4结构是通过将另一个N-乙酰基-葡糖胺添加到所述核心3结构上而生成的。其它的核心结构尽管较不常用但都是可行的。
O-连接聚糖中常见的结构形式是将聚乳糖胺单元添加到不同的核心结构上。这些可通过反复添加半乳糖和N-乙酰基-葡糖胺单元来形成。O-连接聚糖的聚乳糖胺链上常被添加唾液酸(与神经氨酸相似)残基帽。如果还将岩藻糖残基添加到紧挨倒数第二个残基的位置上，则形成唾液酸化的路易斯-X(sialyl-lewis-X，SLeX)结构。
本发明的方法还可用于制备缀合疫苗，例如通过使一种或更多种抗原分子与载体蛋白质相连而形成的缀合疫苗，从而将所述载体蛋白质的免疫学特性赋予给所述抗原分子。该方法常用在抗原分子是聚糖基团(例如抗原性多糖)的情形下，因为它们往往是相对弱的抗原。本文所公开的方法通过使用本发明的官能化试剂而允许多种抗原分子与载体蛋白质相连接(优选在蛋白质载体的一个位置上)。缀合疫苗的实例包括B型流感嗜血杆菌(haemophilus influenzae)疫苗(“Hib疫苗)，其中Hib多糖与蛋白质载体(例如破伤风痉挛毒素、突变型白喉蛋白质或B群脑膜炎球菌外膜蛋白质)缀合；脑膜炎球菌缀合疫苗，其中一个或更多个脑膜炎球菌脑膜炎血清型多糖(例如A、C、Y或W-135)与蛋白质载体缀合；肺炎球菌多糖疫苗(PPSV)，其中所述多糖是来自不同血清型肺炎球菌的细胞膜糖(例如1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F)，其与载体蛋白质例如白喉蛋白质缀合。上文所述的任何疫苗的蛋白质和多糖组分均可利用本发明的官能化试剂相连。
本文所公开的方法还可用于对蛋白质进行改造，所述蛋白质含有用于修饰治疗性蛋白质的药理学性质的其它部分。一个优选的实施例是多肽与聚(亚烷基二醇)分子尤其是聚乙二醇(PEG)分子的缀合，其可用于改善多肽治疗剂的半衰期或其它药理学特性。本发明的方法根据硫醇基在蛋白质中的位置以有选择性的方式为目的蛋白质进行PEG化提供机会。本领域中聚(亚烷基二醇)分子与聚(亚烷基氧化物)分子的名称可互换使用并且都是聚醚。聚(亚烷基二醇)分子可以具有直链、支链、梳形或星形结构并且通常是高度水溶性的。
此外，基本的聚(亚烷基二醇)结构可具有一个或更多个反应性官能团，例如羟基、胺、羧酸、卤代烷或硫醇基，以促进聚(亚烷基二醇)分子与其它物质(例如多肽)的反应。优选的聚(亚烷基二醇)分子包括其中一个或更多个羟基位置被化学基团(如具有1-4个碳原子的烷基基团)取代的那些分子。尽管技术人员能结合其它聚(亚烷基二醇)分子(例如聚丙二醇或聚乙二醇-聚丙二醇共聚物)来利用本文所述的技术，但是，用于本发明的最优选的聚(亚烷基二醇)分子是聚乙二醇(“PEG”)分子。聚(亚烷基二醇)分子(包括PEG)的分子量通常为约400Da至约80kDa，更优选约1kDa至约60kDa，并且更优选约5kDa至约50kDa，例如，分子量为10kDa、20kDa、30kDa或40kDa。可用在本发明中的聚(亚烷基二醇)分子是本领域中众所周知的并且可以公开得到，例如可从供应商如SigmaAldrich商购得到。
PEG化是已知的用于改变治疗性多肽(例如肽、蛋白质和抗体)特性的策略。一般而言，PEG分子与多肽相连接用于改变其构象、静电或疏水特性并导致其生物学和药理学特性的改善，例如增加药物溶解度、减少给药频率、调整(尤其是延长)循环半衰期、增加药物稳定性以及增强对蛋白质降解的抗性。PEG化通过使治疗性多肽与一个或更多个PEG聚合物分子相缀合而增加所述多肽的分子量来发挥作用。本发明方法具有的优点在于硫醇基的存在确定了PEG分子在多肽中的引入位置。
实施例
阐述下述实施例为了给本领域普通技术人员提供如何实施本发明的完整公开内容和描述，而不是旨在限制本发明的范围。
实验
将四-(三苯基膦)钯(0)(5mol％，62.3mg)加入到(6-氯吡啶-3-基)甲基乙酸酯(200mg)的DME(10mL)溶液中，并将溶液于室温下搅拌(20分钟)。然后将K2CO3(0.16g，1.1当量)、水(3mL)和2，4，6-三乙烯基环三硼氧烷-吡啶复合物(0.29g，1.1当量)加入到所述溶液中并回流加热所得混合物(24小时)。然后将所述混合物冷却至室温并用乙醚(100mL)萃取，用水(30mL)清洗萃取物。用MgSO4干燥乙醚萃取物，然后用正己烷(100mL)稀释。用氧化铝(2g)过滤溶液并且真空浓缩洗脱液得到黄色油。将所述油用硅胶色谱(10→80％EtOAc/石油醚)纯化，得到作为无色油的(6-乙烯基吡啶-3-基)甲基乙酸酯(172mg，90％)。
1H NMR，400MHz(CDCl3)：9.16(d，1H，H-6，J＝2.3Hz)，8.24(dd，1H，H-4，J＝2，3和8Hz)，7.39(d，1H，H-3，J＝8Hz)，6.85(dd，1H，H-A，J＝11和17.6Hz)，6.33(dd，1H，H-C，J＝1.2和17.6Hz)，5.61(1H，H-B，J＝1.2和11Hz)，4.40(m，2H，-CH2)，1.40(m，3H，-OCH3).13C NMR，100MHz(CDCl3)：165.23，159.07，150.79，137.56，136.18，124.72，120.91，120.62，61.28，14.25.ESI-HRMS预测值为C10H11NO2＝177.0790.实测值为M+H＝178.0868.
将四-(三苯基膦)钯(0)(0.40g，5mol％)加入到6-氯嘧啶-4-羧酸甲酯(1.24g)的DME(35mL)溶液中，并将溶液于室温下搅拌(20分钟)。然后将K2CO3(1.11g，1.2当量)、水(10mL)和2，4，6-三乙烯基环三硼氧烷-吡啶复合物(1.93g，1.2当量)加入到所述溶液中并回流加热所得混合物(24小时)。然后将所述混合物冷却至室温并用乙醚(200mL)萃取，用水(30mL)清洗萃取物。用MgSO4干燥乙醚萃取物，然后用己烷(200mL)稀释。将溶液通过氧化铝(6g)过滤并将洗脱液真空浓缩得到黄色油。然后所述油用硅胶色谱(10→100％EtOAc/石油醚)然后用反相(C18)色谱(40％MeCN/水)进行处理，得到作为白色固体的6-乙烯基嘧啶-4-羧酸甲酯(0.40g，产率34％)。
1H NMR，270MHz(CDCl3)：9.29(d，1H，H-2，J＝1.1Hz)，7.99(d，1H，H-5，J＝1.1Hz)，dd，1H，H-A，J＝10.4和17.3Hz)，6.61(dd，1H，H-C，J＝1.0和17.3Hz)，5.81(dd，1H，H-B，J＝1.0和10.4Hz)，4.02(s，3H，-CH3).13C NMR，67.5MHz(CDCl3)：164.79(2C)，159.22(2C)，134.71，124.92，117.71，53.52.ESI-Ms分子离子预测值为C8H8N2O2＝164.0586.实测值为M+H＝165.0664.
将上文所述的卤代芳烃(130mg)溶解在10ml DME中并用四-(三苯基膦)钯(0)(10mol％，81.38mg)处理。将溶液置于室温下搅拌20分钟。一起加入K2CO3(1.5eq，146mg)与水(3mL)和2，4，6-三乙烯基环三硼氧烷-吡啶复合物(1.5eq，254.24mg)。将反应物回流24小时。使所述反应物冷却至室温并用乙醚(100mL)稀释，将其用水(30mL)清洗。用MgSO4干燥乙醚部分，然后用石油醚(100mL)稀释。使溶液通过短的氧化铝柱。将所述溶液蒸发至干，并先通过硅胶色谱(100％石油醚至10％MeOH/EtOAc)纯化，得到作为黄色油的上述乙烯基吡啶化合物(89mg，产率72％)。
1H NMR，270MHz(CDCl3)：8.43(s，1H，H-6)，7.58(dd，1H，H-4，J＝2.3和8Hz)，7.29(d，1H，H-3，J＝8Hz).6.78(dd，1H，H-A，J＝10.7和17.4Hz)，6.15(dd，1H，H-C，J＝1.1和17.4Hz)，6.06(br.s，1H，-NH)，5.46(dd，1H，H-B，J＝1.1和10.7Hz)，4.37(d，2H，-CH2，J＝5.8Hz)，2.00(s，3H，-CH3).13C NMR，67.5MHz(CDCl3)：170.16，155.21，148.96，136.54，136.34，121.12，118.45，41.02，23.29，ESI-Ms分子离子预测值为C10H12N2O＝176.0950.实测值为M+H＝177.1028.
将上文所述的卤代芳烃(100mg)溶解在5ml脱气的无水甲苯中，加入三丁基(乙烯基)锡(1.5eq，0.25ml)和四-(三苯基膦)钯(0)(5mol％，34mg)。在氮气下将反应物回流1小时。使反应物冷却至室温并用50ml甲苯稀释。将所述反应物通过硅藻土和KF粉末的1∶1混合物过滤。浓缩滤液。将粗产物混悬在50ml EtOAc中并用(1)水和(2)饱和NaCl溶液清洗。将EtOAc部分用MgSO4干燥，过滤并浓缩。粗产物通过硅胶/KF(10％w/w)色谱：10％EtOAc/石油醚至60％EtOAc/石油醚纯化，得到作为纯白色晶体的上述乙烯基吡啶化合物(31mg，产率33％)。
1H NMR，270MHz(CDCl3)：8.56(d，1H，H-6，J＝2Hz)，7.65(dd，1H，H-4，J＝2和8Hz)，7.34(d，1H，H-3，J＝8Hz)，6.81(dd，1H，H-A，J＝11和17.3Hz)，6.20(dd，1H，H-C，J＝1.4和17.3Hz)，5.50(dd，1H，H-B，J＝1.4和11Hz)，5.10(s，2H，-CH2)，2.10(s，3H，-OCH3).13CNMR，67.5MHz(CDCl3)：167.9，149.62，136.77，136.56，130.30，120.96，118.83，63.70，21.00.ESI-HR MS预测值为C10H11NO2＝177.0790；实测值为M+H＝178.0859.
将(4-溴吡啶-2-基)甲醇(100mg，0.53mmol)溶解在无水THF(10ml)中并冷却至0℃。加入对甲苯磺酰氯(2当量，202.8mg，1.06mmol)和1MNaOH(0.7ml)，快速搅拌反应物2小时并同时使其温热至室温。浓缩所述反应物，然后混悬在100ml二氯甲烷中。将其用水和盐水萃取。将二氯甲烷部分用硫酸镁干燥，过滤并浓缩。粗产物通过硅胶色谱纯化(10％-50％乙酸乙酯/石油醚)，得到黄色油(171mg，94％)。
1H NMR，270MHz(CDCl3)：8.30(d，1H，J＝5.5Hz)，7.81(约d，2H)，7.53(dd，1H，J＝0.5和1.9Hz)，7.35-7.31(m，3H)，5.10(s，2H)，2.43(s，3H).13C NMR，67.5MHz(CDCl3)：155.4，150.0，145.4，133.9，130.1，128.2，126.8，125.2，70.9，21.8.ESI-MS：预测值为C13H12Br1N1O3s1＝340.9721和342.9701.实测值为M+H＝341.9790知343.9770.
将(4-溴吡啶-2-基)甲基4-甲基苯磺酸酯(170mg，0.50mmol)溶解在无水DMF(10ml)中。加入碳酸铯(2当量，325.7mg，1.00mmol)和硫代乙醇酸甲酯(5当量，2.50mmol，v＝0.23ml)，在室温下在氮气下快速搅拌反应物3小时。浓缩所述反应物，然后混悬在二氯甲烷中。用水和盐水萃取。将二氯甲烷部分用硫酸镁干燥，过滤并浓缩。粗产物通过硅胶色谱纯化(10％-50％乙酸乙酯/石油醚)，得到黄色油(99.4mg，72％)。
1H NMR，270MHz(CDCl3)：8.35(d，1H，J＝5.2Hz)，7.54(d，1H，J＝2.0Hz)，7.34(dd，1H，J＝1.9和5.2Hz)，3.90(s，2H)，3.70(s，3H)，3.22(s，2H).13C NMR，67.5MHz(CDCl3)：170.6，159.4，150.3，133.5，126.6，195.7，52.6，37.9，32.8.ESI-Ms：预测值为C9H10Br1N1O2S1＝274.9616和276.9595.实测值为M+H＝275.9691和277.9667.
将2-((4-溴吡啶-2-基)甲硫基)乙酸甲酯(0.62g，2.25mmol)溶解在无水脱氧甲苯中。加入钯四(palladium tetrakis)(10mol％，259.6mg，0.22mmol)和三丁基(乙烯基)锡(1.8当量，V＝1.18ml)，并在氮气下回流反应物2小时。冷却所述反应物，然后通过硅胶色谱(含有10％w/w氟化钾)纯化(10％-50％乙酸乙酯/石油醚)，得到黄色油(416mg，83％)。
1H NMR，270MHz(CDCl3)：8.47(d，1H，J＝5.3Hz)，7.31(s，1H)，7.15(dd，1H，J＝1.6和5.3Hz)，6.63(dd，1H，J＝10.7和17.6Hz)，5.96(d，1H，J＝17.6Hz)，5.48(d，1H，J＝10.7Hz)，3.92(s，2H)，3.69(s，3H)，3.21(s，2H).ESI-Ms：预测值为C11H13N1O2S1＝223.0667.实测值为M+H＝224.0720.
在室温下在氩气下将化合物1(59mg，0.32mmol)、三丁基(乙烯基)锡(0.187ml，0.64mmol)和钯四(37mg，0.032mmol)在无水甲苯中的搅拌溶液脱氧。然后在冷却至室温之前在氩气下回流混合物2小时。将所述混合物通过硅藻土过滤并真空浓缩，然后通过快速色谱纯化(50％EtOAc/石油醚至100％EtOAc)，得到37mg作为澄清油的产物(产率85％)。
1H NMR，270MHz(CDCl3)：8.46(d，1H，J＝4.5Hz)，7.19(dd，2H，J＝4.5和16.6Hz)，6.65(dd，1H，J＝10.7和17.6Hz)，5.96(d，1H，J＝17.6)5.48(d，1H，J＝10.7)，4.74(s，2H).ESI-Ms：预测值为C8H9O1N1＝135.0684.实测值为M+H＝136.0760.
将20mg谷胱甘肽(还原形式)溶解在2ml水中。加入2-乙烯基吡啶(1.2当量，6.3μl)。将反应物超声1分钟然后置于室温下搅拌2小时。浑浊溶液最终变透明。将反应物浓缩至干，混悬在MeOH(10ml)并干填到硅胶上。将其上样到硅胶柱上纯化(100％EtOAc至50％(10％NH3/MeOH)/EtOAc)，得到作为白色粉末的产物(23mg，产率86％)。
１H NMR，400MHz(D2O)：8.29(dd，1H，H-18，J＝0.8和5.1Hz)，7.66(ddd，H-20，J＝2.0，7.8和15.7Hz)，7.23(d，1H，H-21，J＝7.8Hz)，7.18(ddd，1H，H-19，J＝0.8，5.1和7.8Hz)，4.37dd，1H，H-7，J＝4.7和9.0Hz)，3.60(m，3H，H-2和H-10)，2.87(m，5-H，H-12A，H-14A和H-14B，H-15A和H-15B)，2.65(dd，1H，H-12B，J＝9.0和14.1Hz)，2.34(m，2H，H-4A和H-B)，1.92(m，2H，H-3A和H-3B).13C NMR，100MHz(D2O)：176.29，174.96，174.20，172.01，159.09，148.36，138.23，124.26，122.48，，54.21，53.10，43.43，36.57，32.98，31.50，31.48，26.40.ESI-Ms分子离子预测值为C17H24N4O6s＝412.1417.实测值为M+H＝413.1447.
将20mg谷胱甘肽(还原形式)溶解在2ml水中。加入2-乙烯基吡啶(1.2当量，6.3μl)。将反应物超声1分钟然后置于室温下搅拌2小时。浑浊溶液最终变透明。将反应物浓缩至干，混悬在MeOH(10ml)并干填到硅胶上。将其上样到硅胶柱上纯化(100％EtOAc至50％(10％NH3/MeOH)/EtOAc)，得到作为白色粉末的产物(21mg，产率78％)。
1H NMR，400MHz(D2O)：7.65(dd，2H，H-18和H-20，J＝1.6和5.1Hz)，6.63(d，2H，H-17和H-21，J＝6.3Hz)，3.74(dd，1H，H-7，J＝4.7和9.0Hz)，2.94m，3H，H-2，H-10A和H-10B)，2.29-2.01(m，6H，H-12A，H-12B，H-14A和H-14B，H-15A和H-15B)，1.69，(t，2H，H-4A和H-4B)，1.32(q，2H，H-3A和H-3B).13C NMR，100MHz(D2O)：175.67，174.35，173.44，171.39，152.15，，146.75，124.62，53.56，52.47，42.81，33.69，32.35，30.88，25.70.ESI-Ms分子离子预测值为C17H24N4O6S＝412.1417.实测值为M+H＝413.1495
结果：除非另外指明，否则所有反应都是在pH 7.5的基于TRIS的缓冲液中进行的。
                                                化学式：C20H28N4O8S
                                                  精确质量：484.1628
                                                     分子量：484.5233
将乙基酯(43.2mg)加入到还原型谷胱甘肽(15mg)和TCEP(10mM)在脱氧水(2ml)中的溶液中。将反应物在N2下搅拌48小时。将反应物浓缩，干填到硅胶上并上样到硅胶柱上。产物用1∶4(10％NH3/MeOH)/EtOAc纯化(16mg，产率68％)。
１H NMR，400MHz(D2O)：9.00(d，1H，H-18，J＝2.0Hz)，8.45(dd，1H，H-20，J＝2.0和8.2Hz)，7.60(d，1H，H-21，J＝8.2Hz)，4.43(dd，1H，H-7，J＝5.1和8.6Hz)，4.35(q，2H，H-24A和H-24B，J＝7.0Hz)，3.78(s，2H，H-10)，3.67(app.t，1H，H-2，J＝6.7Hz)，3.16(m，2H，H-15A和H-15B，)，2.93(m，3H，H-12A，H-14A和H-14B)，2.75(dd，1H，H-12B，J＝8.6和13.6Hz)，2.40(约t，2H，H-4)，2.03(m，2H，H-3)，1.30(t，3H，H-25，J＝7.0Hz).13C NMR，100MHz(D2O)：174.76，174.41，173.74，172.28，165.94，162.25，147.21，141.02，125.74，125.22，62.88，53.91，52.95，42.13，35.57，32.77，31.24，30.66，26.05，13.28.ESI-MS分子离子预测值为C20H28N4O8s＝484.1628.实测值为M-H＝483.2047.
将葡萄糖五乙酸酯(1g)溶解在无水CH2Cl2(10ml)中。缓慢加入HBr[(33％，在乙酸中)，5ml]。将反应装配CaCl2干燥管，并置于室温下搅拌3小时。通过TLC监测反应。一旦完成，就将反应物用100ml冷CH2Cl2稀释并用冷的1)水(100ml)，2)饱和NaHCO3溶液以及3)饱和NaCl溶液清洗。将有机层用MgSO4干燥，过滤并浓缩，以定量产率得到作为白色泡沫的纯的产物。将α-溴化物(100mg)溶解在无水CH2Cl2(5ml)中并置于N2气下。向其中加入2-乙烯基-5-羟甲基吡啶(49.2mg，1.5当量)、AgOTf(93.5mg，1.5当量)和分子筛。将反应置于黑暗中在N2下搅拌过夜。将反应并用100ml CH2Cl2稀释，通过硅藻土过滤，然后用1)饱和NaHCO3溶液以及2)饱和NaCl溶液清洗。将有机层用MgSO4干燥，过滤并浓缩。粗产物通过硅胶色谱(10％EtOAc/石油醚至100％EtOAc)纯化，得到原酸酯(82mg，73％)。将所述原酸酯(73mg)溶解在5ml无水CH2Cl2中并冷却至-20℃，同时置于N2气下。缓慢加入TMSOTf(5.7μl，0.2当量)，通过TLC分析小心地监测反应1小时。一旦完成，马上加入2滴Et3N淬灭反应。将反应物浓缩并通过硅胶色谱纯化，得到糖缀合物(23mg，产率32％)。ESI-MS：分子离子预测值为C22H27NO10＝465.1635，实测值M+H＝466.1718。
在N2气下将乙酰化的糖缀合物(20mg)加入到4ml无水甲醇中。加入新切制的金属钠，并将反应物置于室温下搅拌1小时。通过TLC分析证实反应完成。通过加入Amberlite IR 120+来中和反应，然后过滤并浓缩。将粗产物干填到硅胶上并通过硅胶色谱(10％MeOH/EtOAc)纯化，得到透明的固体(7mg，产率55％)。ESI-MS：分子离子预测值为C14H19NO6＝297.1212，实测值M+H＝298.1277。
                                    化学式：C24H36N4O12S
                                      精确质量：604.2050
                                        分子量：604.6272
将所述糖缀合物(2mg)溶解在180μl含有10mM TCEP的脱氧水中。加入谷胱甘肽(还原形式，3.1mg，1.2当量)，并将反应置于室温下搅拌过夜。质谱证实了产物的存在。ESI-MS：分子离子预测值为C24H36N4O12S＝604.2050，实测值M-H＝603.1955。
本实施例证明了本发明的化合物和方法可用于将多肽与聚糖基团共价缀合。本实施例还表明，该反应对谷胱甘肽中存在的硫醇基而言是特异性的并且没有发生与其它官能团(例如胺和羧酸)的副反应。
将上文所述的卤代芳烃(0.5g)溶解在12ml DME中并用四-(三苯基膦)钯(0)(10mol％，0.41g)处理。将溶液置于室温下搅拌20分钟。将K2CO3(1.5当量，0.73g)与水(3mL)和2，4，6-三乙烯基环三硼氧烷-吡啶复合物(1.5当量，1.27g)一起加入。将反应回流24小时。使反应冷却至室温，然后通过硅藻土过滤。将反应混合物浓缩然后重新混悬在200ml EtOAc中。将其用水(2×100mL)清洗。合并水洗液并浓缩至5ml。将浓缩物上样到C-18反相柱上并用1/10 MeOH/H2O洗脱。合并相关级分并冷冻干燥，得到作为白色固体的产物(188mg，产率40％)。ESI-MS：分子离子预测值为C8H10N2＝134.0844，实测值M+H＝135.0922。
将mPEG-5K-COOH(100mg)与无水甲苯(3×25ml)共蒸发，然后置于高真空泵上干燥2小时。随后，在惰性条件下将PEG溶解在5ml无水DMF中。加入芳香胺(13.4mg，5当量)、PyBOP(52.1mg，5当量)和DIPEA(0.05ml)。将反应置于N2气下在30℃下搅拌过夜。然后将反应浓缩所述并与甲苯(4×25ml)共蒸发。将粗产物混悬在温乙醇中，然后置于-20℃冷冻器中1小时，得到PEG-缀合物沉淀。将混合物过滤并用冷乙醇清洗。将白色蜡状产物(31mg)置于高真空泵上干燥2小时。
将mPEG-2K-NH2(100mg)与无水甲苯(3×25ml)共蒸发，然后置于高真空泵上干燥2小时。随后，在惰性条件下将PEG溶解在5ml无水DMF中。加入芳香胺(37.3mg，5当量)、PyBOP(130.1mg，5当量)和DIPEA(0.05ml)。将反应物置于N2气下在30℃下搅拌过夜。然后将反应浓缩并与甲苯(4×25ml)共蒸发。将粗产物混悬在CH2Cl2中并通过硅胶色谱(100％CH2Cl2至15％MeOH/CH2Cl2)纯化。合并相关级分并浓缩，得到作为透明固体的产物(52mg)。
这些实施例证明了本发明的化合物和方法可用于以特异性方式使多肽与PEG分子共价缀合。
多种连接基与谷胱甘肽的相对反应速率
将所述乙烯基吡啶或乙烯基嘧啶(1.2当量)在200μl氘化DMSO中的溶液加入到NMR管中的还原型谷胱甘肽(6-10mg)在pH7.0的D2O(800μl)中的溶液中。一旦混合后，就迅速将所述管转移到NMR波谱仪中。重新调整锁场和匀场(1-2分钟)。在Varian Mercury(400MHZ)波谱仪上以指定反应时间(16-32)扫描/数据点连续获取波谱。通过测量乙烯基质子信号(δ6.6-6.9ppm)强度随时间的损失来测定相对反应速率。
用乙烯基呲啶-PEG衍生物对比马来酰亚胺-PEG对人重组IFN-β进行标记
进行该反应以比较利用本发明PEG-吡啶缀合物与利用PEG和现有技术中的交联剂马来酰亚胺对多肽干扰素β的标记。重组干扰素β(C17S，D80N)与PEG-吡啶或PEG马来酰亚胺反应。通过定点突变(StrageneQuickchange)使人干扰素β-1成纤维细胞(Origene Technologies)发生C17S突变以除去内源性游离半胱氨酸以及发生D80C突变以替代内源性糖基化位点。将重组干扰素β用0.1mM TECP还原12小时，然后与PEG/吡啶或PEG/马来酰亚胺在pH 7.5和37℃下在图表中指定的时间点进行反应。蛋白质用SDS-PAGE解析并转移到硝酸纤维素膜上。用抗干扰素β抗体探测膜上未反应的和PEG化的IFN β。第二抗体反应用ECL检测系统(Amershan，GE Healthcare)来检测。
在这两种情形下，PEG分子的分子量都是5kD。结果如图2中所示，并且表明，随着分子量从约20kD增加至25kD，随反应时间增加，利用本发明的缀合物使平均一个PEG-缀合物与干扰素β偶联。相反，与马来酰亚胺的反应明显特异性较差，并且导致多个PEG分子与干扰素β缀合。
pH对乙烯基吡啶-5k-PEG标记BSA速率的影响
研究了用5kD PEG/吡啶对牛血清白蛋白(Sigma)进行官能化的pH依赖性。在4℃下将BSA用1mM DTT还原12小时，然后在室温下与5kDPEG/吡啶反应指定的时间。蛋白质用SDS-PAGE解析并用考马斯亮蓝染色以可视化。
图3中的结果是在pH 5.5和7.5下获得的，表明缀合反应在这两个pH下都进行，但是在pH 7.5下进行得更快。这在其它实验中也得到了证实，这表明所述反应可应用在宽的pH范围内，包括与蛋白质生物化学相关的生理pH范围。该结果还表明，可用pH来控制所述缀合反应的速率。
5kD PEG/吡啶与重组IFN β(Cl 7S，N80C)反应的温度依赖性
在指定温度下在pH7用5mM 5kDa PEG乙烯基吡啶试剂处理IFN β突变体。在指定时间点取出等份量并加入DTT淬灭反应。蛋白质用SDS-PAGE解析并转移到硝酸纤维素膜上。用抗干扰素β抗体探测膜上未反应的和PEG化的IFN β。第二抗体反应用ECL检测系统(Amershan，GE Healthcare)来检测。结果见图4。
蛋白质官能化反应
反应条件
将蛋白质在脱氧的反应缓冲液(NaC2H3O，20mM，pH5.5)中稀释(5mg/ml)并在氮气下用三-(羧乙基).膦盐酸盐(TCEP，5mM)或β-巯基乙胺(BMEA，5mM)还原3小时。随后通过三次超滤(Milipore centricons截留分子量10kDa)或两次透析(醋酸纤维素膜，截留分子量6-8kDa)除去过量还原剂。制备PEG在反应缓冲液中的10倍溶液并加入到所述蛋白质溶液中，得到含有蛋白质(1mg/ml)加1.5-5摩尔每升PEG(根据需要)的反应混合物。将所述混合物在密封管中孵育过夜(37℃)。
FPLC
将反应混合物用10mM NaC2H3O(pH4.5)稀释5-10倍。将样品上样到SP-琼脂糖阳离子交换柱上，所述柱预先用3倍柱体积的结合缓冲液(10mM NaC2H3O，pH4.5)平衡。在清洗除去未结合的级分之后(3倍柱体积的结合缓冲液)，将蛋白质用线性盐梯度(50-200mM NaCl，10mMNaC2H3O，pH4.5)洗脱，并收集1.5ml级分。通过凝胶电泳分析含有所述蛋白质的级分。
SDS PAGE分析
通过凝胶电泳评价蛋白质的PEG化程度。通常在上样到NUPAGEBisTris 4-12％凝胶(Invitrogen)之前，将蛋白质样品(1-10μg)用含有1mM二硫苏糖醇(DTT)的上样染料稀释并煮沸3分钟使之失活。采用考马斯亮蓝染色检测蛋白质(蓝色)和Dragendorff(碘铋酸盐)以使聚乙二醇可视(橙色-褐色)。
用PermaLink对模型蛋白质进行官能化
选用环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)木聚糖酶(S22C)突变体(BcxS22C)作为模型蛋白质来举例说明本发明是如何可采用所述Permalik官能化试剂来用聚糖或PEG分子对多肽进行官能化的。实验细节列举在图5中，其中表明：(A)PL-LK-07的结构。(B)用三-(羧乙基)-膦盐酸盐(TCEP，5mM)将BcxS22C(5mg/m1)在脱氧的乙酸钠缓冲液(20mM，pH5.5)中的溶液还原3小时。随后通过三次超滤(Miliporecentricons，截留分子量10kDa)除去过量还原剂。将所述PEG(1.5当量)加入到所述蛋白质溶液(1mg/ml)中并孵育过夜(37℃)。通过液相色谱使用琼脂糖SP阳离子交换柱回收反应混合物中的PEG化蛋白质。将样品稀释5倍并上样到预先在结合缓冲液(10mM乙酸钠，pH4.5)中平衡的柱上。将产物用线性盐梯度(50-200mM NaCl，在结合缓冲液中)洗脱并收集1.5ml级分。(c)通过SDS PAGE分析含有蛋白质的在280nm显示有UV吸收的级分。这表明，乙烯基吡啶化合物是用于将聚乙二醇(PEG)与蛋白质半胱氨酸残基连接的有效试剂，并且这些反应的产物可以高纯度获得。
所述官能化试剂对半胱氨酸残基中硫醇基的特异性
由于基于马来酰亚胺的连接基化学的缺点之一是缺乏反应特异性，因此检测了本发明的官能化试剂以测定其对半胱氨酸残基的特异性，结果报告在图6中。为了测量所述连接基对半胱氨酸残基的特异性，使用了不存在半胱氨酸的野生型Bcx样品。首先将该蛋白质用三-(羧乙基)-膦盐酸盐(TCEP，5mM)在乙酸钠缓冲液(20mM，pH5.5)中还原3小时。此后，通过三次超滤(Milipore centricons，截留分子量10kDa)除去任何残留的还原剂。将所得浓缩蛋白质溶液在相关缓冲液(50mM，柠檬酸缓冲液pH3，乙酸缓冲液pH6，tris缓冲液pH9)中稀释至1.2mg/ml。将PEG(5当量)溶液加入到所述蛋白质中使最终蛋白质浓度为1mg/ml。将反应孵育过夜(16小时，37℃)。通过在4-12％SDS PAGE上运行反应样品来计算PEG化产物的量。这表明，与马来酰亚胺试剂相比，所述乙烯基吡啶试剂对半胱氨酸残基(相比于其它氨基酸)的巯基的特异性更强。
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以下内容对应于本申请母案的原始权利要求书
1.一种用于修饰具有至少一个反应性硫醇基的多肽的方法，所述方法包括使所述多肽与包含具有乙烯基取代基的含氮芳香杂环的官能化试剂相接触，所述乙烯基取代基能够与所述多肽的至少一个硫醇基反应，其中所述官能化试剂与聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团共价连接，使得所述官能化试剂的乙烯基取代基与所述多肽的硫醇基反应，从而使所述聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团与所述多肽共价连接。
2.一种方法，其包括使具有至少一个反应性硫醇基的多肽与包含具有乙烯基取代基的含氮芳香杂环的官能化试剂相接触，所述乙烯基取代基能够与所述多肽的至少一个硫醇基反应，其中所述官能化试剂与聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团共价连接，使得所述官能化试剂的乙烯基取代基与所述多肽的所述硫醇基反应，从而使得所述聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团与所述多肽共价连接。
3.项1或项2的方法，还包括使包含具有乙烯基取代基的含氮芳香杂环的官能化试剂前体与所述聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团反应来产生所述官能化试剂的初始步骤。
4.前述项中任一项的方法，其中所述聚(亚烷基二醇)分子是聚乙二醇(PEG)分子。
5.前述项中任一项的方法，其中所述含氮芳香杂环是吡啶环、嘧啶环或叠氮环。
6.前述项中任一项的方法，还包括确定所述多肽中反应性硫醇基的位置，以及任选地将其中的一些进行保护。
7.前述项中任一项的方法，还包括通过化学反应或通过定点突变以产生在所述多肽的一个或更多个期望位置上具有硫醇基的变体多肽来对母体多肽进行修饰的起始步骤。
8.前述项中任一项的方法，其中所述硫醇基存在于半胱氨酸残基中。
9.前述项中任一项的方法，其中所述包含具有乙烯基取代基的含氮芳香杂环的官能化试剂以下述通式表示：
其中：
X和Y独立地选自CH或N；
其中至少R1以及任选地R2与聚(亚烷基二醇)分子和/或聚糖基团共价连接；
其中：
R1以及任选地R2独立地选自：
-(CH2)n-Z-(CH2)o-C(O)-R，其中Z是O、S或NH，n是0至10，o是0至10，并且其中R是氢、聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团；或者
-(CH2)n-Z-(CH2)o-R，其中Z是O、S或NH，n是0至10，o是0至10，并且其中R是氢、聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团；或者
-C(O)-Z-(CH2)o-R，其中Z是O、S或NH，o是0至10，并且其中R是氢、聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团；或者
-(CH2)n-Z-C(O)-(CH2)o-R，其中Z是O、S或NH，n是0至10，o是0至10，并且其中R是氢、聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团；或者
-Y-(CH2)n-Z-C(O)-(CH2)o-R，其中Y是芳基基团、O、S或NH，Z是O或NH，n是0至10，o是0至10，并且其中R是氢、聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团；或者
-Y-R，其中Y是O或S，R是氢、聚糖、聚(亚烷基二醇)分子、芳基或C1-10烷基；
前提是当R2不与聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团相连时，其可另外选自氢或吸电子基团，例如卤素(F、Cl或Br)、-NO2、-CO2H、-CO2R4、COR4、-CHO、-CN、-CF3、-SO2NR4R5、烷基或苯基，其中R4和R5独立地选自氢或C1-10烷基；
或者R2和R3一起形成稠合(杂)芳环取代基，其可包括但不限于吲哚、吲唑、苯并咪唑、喹啉、异喹啉、氮丙啶或嘌呤；
或者R3选自氢或选自以下的取代基：卤素、羟基、醚、甲酰基、酰基、羧基、酯、酰氧基、酰胺基、酰基胺基、硫代酰胺基、四唑基、氨基、硝基、亚硝基、叠氮基、氰基、异氰基、氰氧基、异氰氧基、硫氰基、异硫氰基、硫醚、磺酸、磺酸酯/盐、砜、磺酰基氧基、亚磺酰基氧基、硫酰氨基、磺酰氨基、亚磺酰氨基、氨磺酰基、磺酰胺基、C1-7烷基。
10.项9的方法，其中X和Y都是CH或者X和Y之一是CH而另一个是N。
11.项9或项10的方法，其中R1或R2之一包含聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团。
12.项9或项10的方法，其中R1和R2都包含聚(亚烷基二醇)分子和/或聚糖基团。
13.项9或项10的方法，其中R1和R2之一包含聚(亚烷基二醇)分子并且R1和R2中另一个包含聚糖基团。
14.项9至13中任一项的方法，其中用于使所述聚(亚烷基二醇)分子和/或所述聚糖基团与所述含氮芳香杂环相连的所述R1和/或R2基团独立地选自-(CH2)n-Z-(CH2)o-R或-C(O)-Z-(CH2)o-R。
15.项9至13中任一项的方法，其中在所述R1和R2基团中，o是0并且所述基团可表示为-(CH2)n-Z-R或-C(O)-Z-R。
16.前述项中任一项的方法，其中所述官能化试剂以下述通式之一表示：
其中：
至少R1以及任选地R2与聚(亚烷基二醇)分子和/或聚糖基团共价连接；
并且进一步地其中：
R1以及任选地R2独立地选自：
-(CH2)n-Z-(CH2)o-C(O)-R，其中Z是O、S或NH，n是0至10，o是0至10，并且其中R是氢、聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团；或者
-(CH2)n-Z-(CH2)o-R，其中Z是O、S或NH，n是0至10，o是0至10，并且其中R是氢、聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团；或者
-C(O)-Z-(CH2)o-R，Z是O、S或NH，o是0至10，并且其中R是氢、聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团；或者
-(CH2)n-Z-C(O)-(CH2)o-R，其中Z是O、S或NH，n是0至10，o是0至10，并且其中R是氢、聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团；或者
-Y-(CH2)n-Z-C(O)-(CH2)o-R，其中Y是芳基基团、O、S或NH，Z是O或NH，n是0至10，o是0至10，并且其中R是氢、聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团；或者
-Y-R，其中Y是O或S，R是氢、聚糖、聚(亚烷基二醇)分子、芳基或C1-10烷基；
前提是当R2不与聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团相连时，其可另外选自氢或吸电子基团，例如卤素(F、Cl或Br)、-NO2、-CO2H、-CO2R4、COR4、-CHO、-CN、-CF3、-SO2NR4R5、烷基或苯基，其中R4和R5独立地选自氢或C1-10烷基。
17.前述项中任一项的方法，其中所述聚糖是用于使所述多肽糖基化的碳水化合物基团。
18.项17的方法，其中所述糖基是天然或合成的单糖、寡糖或多糖。
19.项17或项18的方法，其中所述聚糖是N-连接或O-连接的糖基。
20.项1至19中任一项的方法，其中所述聚(亚烷基二醇)分子基团的分子量为1kDa至50kDa。
21.前述项中任一项的方法，其中所述聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团与所述多肽缀合以改变所述多肽的药理学特性。
22.项21的方法，其中所述药理学特性是所述多肽的稳定性、生物半衰期、水溶性和/或免疫学性质。
23.前述项中任一项的方法，其中所述多肽是促红细胞生成素、干扰素、白细胞介素、趋化因子、淋巴因子、细胞因子、胰岛素、单克隆抗体或其片段、重组抗体或其片段、凝血因子、集落刺激因子、生长激素、纤溶酶原激活因子、病毒衍生肽、生殖激素、治疗性酶或用于缀合物疫苗的载体蛋白。
24.项23的方法，其中所述缀合物疫苗是在载体蛋白与一个或更多个作为抗原性多糖的聚糖基团之间形成的。
25.下式所示的用于使用聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团对多肽进行官能化的化合物：
其中：
X和Y独立地选自CH或N；
其中至少R1以及任选地R2与聚(亚烷基二醇)分子和/或聚糖基团共价连接；
其中：
R1以及任选地R2独立地选自：
.(CH2)n-Z-(CH2)o-R，其中Z是O、S或NH，n是0至10，o是0至10，并且其中R是氢、聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团；或者
-C(O)-Z-(CH2)o-R，其中Z是O、S或NH，o是0至10，并且其中R是氢、聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团；或者
-(CH2)n-Z-C(O)-(CH2)o-R，其中Z是O、S或NH，n是0至10，o是0至10，并且其中R是氢、聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团；或者
-Y-(CH2)n-Z-C(O)-(CH2)o-R，其中Y是芳基基团、O、S或NH，Z是O或NH，n是0至10，o是0至10，并且其中R是氢、聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团；或者
-Y-R，其中Y是O或S，R是氢、聚糖、聚(亚烷基二醇)分子、芳基或C1-10烷基；
前提是当R2不与聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团相连时，其可另外选自氢或吸电子基团，例如卤素(F、Cl或Br)、-NO2、-CO2H、-CO2R4、COR4、-CHO、-CN、-CF3、-SO2NR4R5、烷基或苯基，其中R4和R5独立地选自氢或C1-10烷基；
或者R2和R3一起形成稠合(杂)芳环取代基，其可包括但不限于吲哚、吲唑、苯并咪唑、喹啉、异喹啉、氮丙啶或嘌呤；
或者R3选自氢或选自以下的取代基：卤素、羟基、醚、甲酰基、酰基、羧基、酯、酰氧基、酰胺基、酰基胺基、硫代酰胺基、四唑基、氨基、硝基、亚硝基、叠氮基、氰基、异氰基、氰氧基、异氰氧基、硫氰基、异硫氰基、硫醚、磺酸、磺酸酯/盐、砜、磺酰基氧基、亚磺酰基氧基、硫酰氨基、磺酰氨基、亚磺酰氨基、氨磺酰基、磺酰胺基、C1-7烷基。
26.项25的化合物，其中X和Y都是CH或者X和Y之一是CH而另一个是N。
27.项24或项25的化合物，其中所述聚(亚烷基二醇)分子是聚乙二醇。
28.项25至27中任一项的化合物，其中R1或R2之一包含聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团。
29.项25至27中任一项的化合物，其中R1和R2包含聚(亚烷基二醇)分子和/或聚糖基团。
30.项25至27中任一项的化合物，其中R1和R2之一包含聚(亚烷基二醇)分子并且R1和R2中另一个包含聚糖基团。
31.项25至30中任一项的化合物，其中用于使所述聚(亚烷基二醇)分子和/或所述聚糖基团与所述含氮芳香杂环相连的所述R1和/或R2基团独立地选自-(CH2)n-Z-(CH2)o-R或者-C(O)-Z-(CH2)o-R。
32.项25至30中任一项的方法，其中在R1和R2基团中，o是0并且所述基团可表示为-(CH2)n-Z-R或-C(O)-Z-R。
33.下述通式之一所示的用于用聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团对多肽进行官能化的化合物：
其中：
至少R1以及任选地R2与聚(亚烷基二醇)分子和/或聚糖基团共价连接；
并且进一步地其中：
R1以及任选地R2独立地选自：
-(CH2)n-Z-(CH2)o-R，其中Z是O、S或NH，n是0至10，o是0至10，并且其中R是氢、聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团；或者
-C(O)-Z-(CH2)o-R，Z是O、S或NH，o是0至10，并且其中R是氢、聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团；或者
-(CH2)n-Z-C(O)-(CH2)o-R，其中Z是O、S或NH，n是0至10，o是0至10，并且其中R是氢、聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团；或者
-Y-(CH2)n-Z-C(O)-(CH2)o-R，其中Y是芳基基团、O、S或NH，Z是O或NH，n是0至10，o是0至10，并且其中R是氢、聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团；或者
-Y-R，其中Y是O或S，R是氢、聚糖、聚(亚烷基二醇)分子、芳基或C1-10烷基；
前提是当R2不与聚(亚烷基二醇)分子或聚糖基团相连时，其可另外选自氢或吸电子基团，例如卤素(F、Cl或Br)、-NO2、-CO2H、-CO2R4、COR4、-CHO、-CN、-CF3、-SO2NR4R5、烷基或苯基，其中R4和R5独立地选自氢或C1-10烷基。
34.通过使项25至33中任一项的化合物与多肽的一个或更多个硫醇基反应而形成的缀合物。
35.通过使项25至33中任一项的化合物与多肽的一个或更多个硫醇基反应而形成的缀合物，其用于医学处理方法。
36.项35的用于处理方法的缀合物，其中所述处理是治疗或诊断。
37.项35的用于处理方法的缀合物，其中所述缀合物是疫苗。
38.项37的用于处理方法的缀合物，其中所述疫苗是在载体蛋白和一个或更多个作为抗原性多糖的聚糖基团之间形成的。

Claims (32)

1.一种用于修饰具有至少一个反应性硫醇基的多肽的方法，所述方法包括使所述多肽与包含具有乙烯基取代基的含氮芳香杂环的官能化试剂相接触，所述乙烯基取代基能够与所述多肽的至少一个硫醇基反应，其中所述官能化试剂与聚(亚烷基二醇)分子共价连接，使得所述官能化试剂的乙烯基取代基与所述多肽的硫醇基反应，从而使所述聚(亚烷基二醇)分子与所述多肽共价连接。
2.一种方法，其包括使具有至少一个反应性硫醇基的多肽与包含具有乙烯基取代基的含氮芳香杂环的官能化试剂相接触，所述乙烯基取代基能够与所述多肽的至少一个硫醇基反应，其中所述官能化试剂与聚(亚烷基二醇)分子共价连接，使得所述官能化试剂的乙烯基取代基与所述多肽的所述硫醇基反应，从而使得所述聚(亚烷基二醇)分子与所述多肽共价连接。
3.权利要求1或权利要求2的方法，还包括使包含具有乙烯基取代基的含氮芳香杂环的官能化试剂前体与所述聚(亚烷基二醇)分子反应来产生所述官能化试剂的初始步骤。
4.前述权利要求中任一项的方法，其中所述聚(亚烷基二醇)分子是聚乙二醇(PEG)分子。
5.前述权利要求中任一项的方法，其中所述含氮芳香杂环是吡啶环、嘧啶环或叠氮环。
6.前述权利要求中任一项的方法，还包括确定所述多肽中反应性硫醇基的位置，以及任选地将其中的一些进行保护。
7.前述权利要求中任一项的方法，还包括通过化学反应或通过定点突变以产生在所述多肽的一个或更多个期望位置上具有硫醇基的变体多肽来对母体多肽进行修饰的起始步骤。
8.前述权利要求中任一项的方法，其中所述硫醇基存在于半胱氨酸残基中。
9.前述权利要求中任一项的方法，其中所述包含具有乙烯基取代基的含氮芳香杂环的官能化试剂以下述通式表示：
其中：
X和Y独立地选自CH或N；
其中至少R1以及任选地R2与聚(亚烷基二醇)分子共价连接；
其中：
R1以及任选地R2独立地选自：
-(CH2)n-Z-(CH2)o-C(O)-R，其中Z是O、S或NH，n是0至10，o是0至10，并且其中R是氢或聚(亚烷基二醇)分子；或者
-(CH2)n-Z-(CH2)o-R，其中Z是O、S或NH，n是0至10，o是0至10，并且其中R是氢或聚(亚烷基二醇)分子；或者
-C(O)-Z-(CH2)o-R，其中Z是O、S或NH，o是0至10，并且其中R是氢或聚(亚烷基二醇)分子；或者
-(CH2)n-Z-C(O)-(CH2)o-R，其中Z是O、S或NH，n是0至10，o是0至10，并且其中R是氢或聚(亚烷基二醇)分子；或者
-Y-(CH2)n-Z-C(O)-(CH2)o-R，其中Y是芳基基团、O、S或NH，Z是O或NH，n是0至10，o是0至10，并且其中R是氢或聚(亚烷基二醇)分子；或者
-Y-R，其中Y是O或S，R是氢、聚(亚烷基二醇)分子、芳基或C1-10烷基；
前提是当R2不与聚(亚烷基二醇)分子相连时，其可另外选自氢或吸电子基团，例如卤素(F、Cl或Br)、-NO2、-CO2H、-CO2R4、COR4、-CHO、-CN、-CF3、-SO2NR4R5、烷基或苯基，其中R4和R5独立地选自氢或C1-10烷基；
或者R2和R3一起形成稠合(杂)芳环取代基，其可包括但不限于吲哚、吲唑、苯并咪唑、喹啉、异喹啉、氮丙啶或嘌呤；
或者R3选自氢或选自以下的取代基：卤素、羟基、醚、甲酰基、酰基、羧基、酯、酰氧基、酰胺基、酰基胺基、硫代酰胺基、四唑基、氨基、硝基、亚硝基、叠氮基、氰基、异氰基、氰氧基、异氰氧基、硫氰基、异硫氰基、硫醚、磺酸、磺酸酯/盐、砜、磺酰基氧基、亚磺酰基氧基、硫酰氨基、磺酰氨基、亚磺酰氨基、氨磺酰基、磺酰胺基、C1-7烷基。
10.权利要求9的方法，其中X和Y都是CH或者X和Y之一是CH而另一个是N。
11.权利要求9或权利要求10的方法，其中R1或R2之一包含聚(亚烷基二醇)分子。
12.权利要求9或权利要求10的方法，其中R1和R2都包含聚(亚烷基二醇)分子。
13.权利要求9至12中任一项的方法，其中用于使所述聚(亚烷基二醇)分子与所述含氮芳香杂环相连的所述R1和/或R2基团独立地选自-(CH2)n-Z-(CH2)o-R或-C(O)-Z-(CH2)o-R。
14.权利要求9至12中任一项的方法，其中在所述R1和R2基团中，o是0并且所述基团可表示为-(CH2)n-Z-R或-C(O)-Z-R。
15.前述权利要求中任一项的方法，其中所述官能化试剂以下述通式之一表示：
其中：
至少R1以及任选地R2与聚(亚烷基二醇)分子共价连接；
并且进一步地其中：
R1以及任选地R2独立地选自：
-(CH2)n-Z-(CH2)o-C(O)-R，其中Z是O、S或NH，n是0至10，o是0至10，并且其中R是氢或聚(亚烷基二醇)分子；或者
-(CH2)n-Z-(CH2)o-R，其中Z是O、S或NH，n是0至10，o是0至10，并且其中R是氢或聚(亚烷基二醇)分子；或者
-C(O)-Z-(CH2)o-R，Z是O、S或NH，o是0至10，并且其中R是氢或聚(亚烷基二醇)分子；或者
-(CH2)n-Z-C(O)-(CH2)o-R，其中Z是O、S或NH，n是0至10，o是0至10，并且其中R是氢或聚(亚烷基二醇)分子；或者
-Y-(CH2)n-Z-C(O)-(CH2)o-R，其中Y是芳基基团、O、S或NH，Z是O或NH，n是0至10，o是0至10，并且其中R是氢或聚(亚烷基二醇)分子；或者
-Y-R，其中Y是O或S，R是氢、聚(亚烷基二醇)分子、芳基或C1-10烷基；
前提是当R2不与聚(亚烷基二醇)分子相连时，其可另外选自氢或吸电子基团，例如卤素(F、Cl或Br)、-NO2、-CO2H、-CO2R4、COR4、-CHO、-CN、-CF3、-SO2NR4R5、烷基或苯基，其中R4和R5独立地选自氢或C1-10烷基。
16.权利要求1至15中任一项的方法，其中所述聚(亚烷基二醇)分子基团的分子量为1kDa至50kDa。
17.前述权利要求中任一项的方法，其中所述聚(亚烷基二醇)分子与所述多肽缀合以改变所述多肽的药理学特性。
18.权利要求17的方法，其中所述药理学特性是所述多肽的稳定性、生物半衰期、水溶性和/或免疫学性质。
19.前述权利要求中任一项的方法，其中所述多肽是促红细胞生成素、干扰素、白细胞介素、趋化因子、淋巴因子、细胞因子、胰岛素、单克隆抗体或其片段、重组抗体或其片段、凝血因子、集落刺激因子、生长激素、纤溶酶原激活因子、病毒衍生肽、生殖激素、治疗性酶或用于缀合物疫苗的载体蛋白。
20.一种用于使用聚(亚烷基二醇)分子对多肽进行官能化的化合物，所述化合物包含具有乙烯基取代基的含氮芳香杂环，其中所述化合物与聚(亚烷基二醇)分子共价连接。
21.根据权利要求20所述的用于使用聚(亚烷基二醇)分子对多肽进行官能化的化合物，其中所述化合物如下式所示：
其中：
X和Y独立地选自CH或N；
其中至少R1以及任选地R2与聚(亚烷基二醇)分子共价连接；
其中：
R1以及任选地R2独立地选自：
-(CH2)n-Z-(CH2)o-R，其中Z是O、S或NH，n是0至10，o是0至10，并且其中R是氢或聚(亚烷基二醇)分子；或者
-C(O)-Z-(CH2)o-R，其中Z是O、S或NH，o是0至10，并且其中R是氢或聚(亚烷基二醇)分子；或者
-(CH2)n-Z-C(O)-(CH2)o-R，其中Z是O、S或NH，n是0至10，o是0至10，并且其中R是氢或聚(亚烷基二醇)分子；或者
-Y-(CH2)n-Z-C(O)-(CH2)o-R，其中Y是芳基基团、O、S或NH，Z是O或NH，n是0至10，o是0至10，并且其中R是氢或聚(亚烷基二醇)分子；或者
-Y-R，其中Y是O或S，R是氢、聚(亚烷基二醇)分子、芳基或C1-10烷基；
前提是当R2不与聚(亚烷基二醇)分子相连时，其可另外选自氢或吸电子基团，例如卤素(F、Cl或Br)、-NO2、-CO2H、-CO2R4、COR4、-CHO、-CN、-CF3、-SO2NR4R5、烷基或苯基，其中R4和R5独立地选自氢或C1-10烷基；
或者R2和R3一起形成稠合(杂)芳环取代基，其可包括但不限于吲哚、吲唑、苯并咪唑、喹啉、异喹啉、氮丙啶或嘌呤；
或者R3选自氢或选自以下的取代基：卤素、羟基、醚、甲酰基、酰基、羧基、酯、酰氧基、酰胺基、酰基胺基、硫代酰胺基、四唑基、氨基、硝基、亚硝基、叠氮基、氰基、异氰基、氰氧基、异氰氧基、硫氰基、异硫氰基、硫醚、磺酸、磺酸酯/盐、砜、磺酰基氧基、亚磺酰基氧基、硫酰氨基、磺酰氨基、亚磺酰氨基、氨磺酰基、磺酰胺基、C1-7烷基。
22.权利要求21的化合物，其中X和Y都是CH或者X和Y之一是CH而另一个是N。
23.权利要求20至22任一项的化合物，其中所述聚(亚烷基二醇)分子是聚乙二醇。
24.权利要求20至23中任一项的化合物，其中R1或R2之一包含聚(亚烷基二醇)分子。
25.权利要求20至23中任一项的化合物，其中R1和R2包含聚(亚烷基二醇)分子。
26.权利要求20至25中任一项的化合物，其中用于使所述聚(亚烷基二醇)分子与所述含氮芳香杂环相连的所述R1和/或R2基团独立地选自-(CH2)n-Z-(CH2)o-R或者-C(O)-Z-(CH2)o-R。
27.权利要求20至25中任一项的方法，其中在R1和R2基团中，o是0并且所述基团可表示为-(CH2)n-Z-R或-C(O)-Z-R。
28.下述通式之一所示的用于用聚(亚烷基二醇)分子对多肽进行官能化的化合物：
其中：
至少R1以及任选地R2与聚(亚烷基二醇)分子共价连接；
并且进一步地其中：
R1以及任选地R2独立地选自：
-(CH2)n-Z-(CH2)o-R，其中Z是O、S或NH，n是0至10，o是0至10，并且其中R是氢或聚(亚烷基二醇)分子；或者
-C(O)-Z-(CH2)o-R，Z是O、S或NH，o是0至10，并且其中R是氢或聚(亚烷基二醇)分子；或者
-(CH2)n-Z-C(O)-(CH2)o-R，其中Z是O、S或NH，n是0至10，o是0至10，并且其中R是氢或聚(亚烷基二醇)分子；或者
-Y-(CH2)n-Z-C(O)-(CH2)o-R，其中Y是芳基基团、O、S或NH，Z是O或NH，n是0至10，o是0至10，并且其中R是氢或聚(亚烷基二醇)分子；或者
-Y-R，其中Y是O或S，R是氢、聚(亚烷基二醇)分子、芳基或C1-10烷基；
前提是当R2不与聚(亚烷基二醇)分子相连时，其可另外选自氢或吸电子基团，例如卤素(F、Cl或Br)、-NO2、-CO2H、-CO2R4、COR4、-CHO、-CN、-CF3、-SO2NR4R5、烷基或苯基，其中R4和R5独立地选自氢或C1-10烷基。
29.通过使权利要求20至28中任一项的化合物与多肽的一个或更多个硫醇基反应而形成的缀合物。
30.通过使权利要求20至28中任一项的化合物与多肽的一个或更多个硫醇基反应而形成的缀合物，其用于医学处理方法。
31.权利要求30的用于处理方法的缀合物，其中所述处理是治疗或诊断。
32.权利要求30的用于处理方法的缀合物，其中所述缀合物是疫苗。
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