CN118451086A - 一种蛋白和/或多肽糖基化修饰的方法 - Google Patents
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Abstract
提供了一种蛋白和/或多肽糖基化修饰的方法,属于药物化学技术领域。以糖基亚磺酸盐为原料,提供了一种对蛋白质和/或多肽进行糖基化修饰的方法,该方法反应原料易得,反应条件温和,反应耗时较短,反应过程可控,所得糖基化修饰的蛋白和/或多肽收率高,纯度高。糖基化修饰方法不仅适用于含二硫键的蛋白质和/或多肽,还适用于含巯基的蛋白质和/或多肽,甚至适用于同时含二硫键和巯基的蛋白质和/或多肽,应用前景广阔。
Description
本发明属于药物化学技术领域,具体涉及一种蛋白和/或多肽糖基化修饰的方法。
糖基化是蛋白质的一种重要的翻译后修饰。所有生物的细胞表面都由许多不同类型的糖链所包被,而且在细胞内也存在各种类型的糖基化。糖蛋白是许多生物过程的基本物质,这些过程包括细胞生长、细胞与细胞的粘着、免疫应答、受精、凝血块的降解、病毒增殖、寄生虫感染和炎症反应等。随着人类基因组计划的完成以及蛋白质组技术的不断发展,糖基化蛋白质组的研究受到了越来越受到广泛的重视。
目前,蛋白质糖基化工程的研究多集中于药物方面和食品方面,研究发现,蛋白质糖基化可增加重组蛋白药物的半衰期及靶向性;对鱼肉蛋白质、卵清蛋白、β-乳球蛋白、牛血清蛋白、谷蛋白等蛋白质进行糖基化,结果表明,新合成的糖蛋白在乳化性、溶解性、热稳定性、抗菌性、抗氧化性等功能特性方面都有不同程度的提高;对改性后糖蛋白的营养学和毒理学进行的研究结果表明,糖基化反应在一定程度上能抑制β-乳球蛋白的过敏反应特性,蛋白质中的必需氨基酸除赖氨酸有少量损失外,对其他氨基酸基本没有影响。因此,对蛋白质糖基化改性的方法进行研究具有重要意义。
目前蛋白质糖基化方法主要包括干热法和湿热法。其中,干热法糖基化是最先使用的蛋白质糖基化方法,也是蛋白质糖基化处理的最主要方法。通常,先将蛋白质和多糖按一定比例在水溶液中进行混合,经干燥得到两者的混合粉末,然后在一定的温度、湿度和时间条件下诱导糖基化反应,反应完毕后迅速冷却以终止糖基化反应。干热法糖基化具有操作简单,反应条件容易控制,无需加入其他试剂,反应产物接枝度高等优点,但反应时间较长,反应时间通常为几天到几周。而蛋白质湿热法糖基化是基于液相对蛋白和糖进行热处理从而使蛋白质糖基化改性的一种方法,多用于蛋白质与小分子糖之间的接枝反应。湿热法糖基化具有反应时间短,反应迅速等优点,但是,一方面,由于美拉德反应的初级反应为可逆反应,水作为初级反应的反应产物在体系中大量存在,抑制了糖基化反应的进行;另一方面,蛋白质在水中进行高温处理容易发生变性聚集,加速反应向高级阶段进行,甚至生成有毒有害物质,如丙烯酰胺和4-甲基咪唑等。因此湿热法糖基化存在反应不完全,接枝度低,产物复杂,反应难控制的问题。
开发出一种反应原料易得,反应条件温和,反应耗时较短,反应过程可控的方法来对蛋白质或多肽进行糖基化修饰具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种反应原料易得,反应条件温和,反应耗时较 短,反应过程可控的对蛋白质和/或多肽进行糖基化修饰的新方法。
本发明提供了一种蛋白和/或多肽糖基化修饰的方法,所述方法包括以下步骤:
以包括糖基亚磺酸盐、蛋白和/或多肽、氧化剂在内的物质为原料在溶剂中反应,得到糖基化修饰的蛋白和/或多肽;
其中,所述蛋白和/或多肽中含巯基和/或二硫键;
所述糖基亚磺酸盐的结构如式W所示:
其中,n选自0或1;
a选自3或4;
R各自独立地选自L
1R
x;或者两个相邻的R连接成环,另外的R各自独立地选自L
1R
x,所述环为未被取代或被一个或两个以上L
1R
x取代的环;
L
1选自无或C
1~2亚烷基,R
x选自氢、羟基、C
1~6烷基、OAc、OBn、OR
8、NR
9R
10、
Ph、氨基、
i选自0-6的整数;
R
11、R
12、R
13、R
14各自独立地选自L
2R
y;L
2选自无或C
1~2亚烷基,R
y选自氢、羟基、C
1~6烷基、OAc、OBn、OR
8、NR
9R
10;
R
8选自C
1~6烷基;
R
9选自氢、C
1~6烷基、Ac、Bn;
R
10选自氢、C
1~6烷基、Ac、Bn;
j为1、2或3;
M
j+为j价阳离子。
进一步地,所述氧化剂选自双氧水,过氧叔丁醇,过硫酸钾,氧气,叔丁基过氧化物中的一种或两种以上;
和/或,所述溶剂为水性溶液,优选为水或缓冲液;
和/或,所述反应的温度为室温;
和/或,所述反应是在惰性气体氛围下进行的。
进一步地,所述蛋白和/或多肽中含巯基,蛋白和/或多肽中的氨基酸残基个数为70-1000个;
所述方法为方法1或方法2;
方法1包括以下步骤:先以含巯基的蛋白和/或多肽、化合物A为原料在溶剂中进行第一步反应,然后加入糖基亚磺酸盐、氧化剂,进行第二步反应,得到糖基化修饰的蛋白和/或多肽;化合物A为
其中,LG为离去基团,R
w为烷基、芳基或杂芳基,或者R
w与LG连接成环;优选地,化合物A为
其中R
z为C
1-8烷基,优选为C
1-3烷基;
方法2包括以下步骤:以含巯基的蛋白和/或多肽、糖基亚磺酸盐、氧化剂为原料在溶剂中反应,得到糖基化修饰的蛋白和/或多肽。
进一步地,方法1中,所述含巯基的蛋白和/或多肽、化合物A、糖基亚磺酸盐、氧化剂的摩尔比为1:(10-300):(20-600):(20-600),优选为1:200:400:400;和/或,所述含巯基的蛋白和/或多肽与溶剂的比例为(0.05-0.5)μmol:1mL,优选为0.1μmol:1mL;和/或,所述第一步反应的时间为1-20分钟,优选为10分钟;所述第二步反应的时间为0.2-1.5小时,优选为1小时;
方法2中,所述含巯基的蛋白和/或多肽、糖基亚磺酸盐、氧化剂的摩尔比为1:(20-600):(20-600),优选为1:400:400;和/或,所述含巯基的蛋白和/或多肽与溶剂的比例为(0.05-0.5)μmol:1mL,优选为0.1μmol:1mL;和/或,所述反应的时间为0.2-1.5小时,优选为1小时。
进一步地,所述含巯基的蛋白和/或多肽选自含巯基的Affibody,Mucin 1蛋白,GTP酶,含巯基的非结构性蛋白,含巯基的淀粉样蛋白;
优选地,所述含巯基的Affibody的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步地,所述蛋白和/或多肽中含巯基,蛋白和/或多肽中的氨基酸残基个数为1-100个;
所述方法为方法3或方法4;
方法3包括以下步骤:先以含巯基的蛋白和/或多肽、化合物A为原料在溶剂中进行第一步反应,然后加入糖基亚磺酸盐、氧化剂,进行第二步反应,得到糖基化修饰的蛋白和/或多肽;化合物A结构为
其中,LG为离去基团,R
w为烷基、芳基或杂芳基,或者R
w与LG连接成环;优选地,化合物A为
其中R
z为C
1-8烷基,优选为C
1-3烷基;
方法4包括以下步骤:以含巯基的蛋白和/或多肽、糖基亚磺酸盐、氧化剂为原料在溶剂中反应,得到糖基化修饰的蛋白和/或多肽。
进一步地,方法3中,所述含巯基的蛋白和/或多肽、化合物A、糖基亚磺酸盐、氧化剂的摩尔比为1:(1-3):(3-10):(3-10),优选为1:3:6:6;和/或,所述含巯基的蛋白和/或多肽与溶剂的比例为(0.01-0.2)mmol:1mL,优选为0.01mmol:1mL;和/或,所述第一步反应的时间为1-20分钟,优选 为10分钟;所述第二步反应的时间为0.2-1.5小时,优选为1小时;
方法4中,所述含巯基的蛋白和/或多肽、糖基亚磺酸盐、氧化剂的摩尔比为1:(3-10):(3-10),优选为1:6:6;和/或,所述含巯基的蛋白和/或多肽与溶剂的比例为(0.01-0.2)mmol:1mL,优选为0.01mmol:1mL;和/或,所述反应的时间为0.2-1.5小时,优选为1小时。
进一步地,所述含巯基的蛋白和/或多肽选自αVβ3整合素结合肽,细胞穿透肽-R8,还原型谷胱甘肽。
进一步地,所述蛋白和/或多肽中含二硫键,蛋白和/或多肽中的氨基酸残基个数为2-2000个;
所述方法包括以下步骤:将糖基亚磺酸盐、含二硫键的蛋白和/或多肽、氧化剂在溶剂中反应,得到糖基化修饰的蛋白和/或多肽。
进一步地,所述含二硫键的蛋白和/或多肽、糖基亚磺酸盐、氧化剂的摩尔比为1:(60-600):(20-600),优选为1:400:400;
和/或,所述含二硫键的蛋白和/或多肽与溶剂的比例为(0.05-0.5)μmol:1mL,优选为0.1μmol:1mL;
和/或,所述反应的时间为0.2-1.5小时,优选为0.5-1小时。
进一步地,所述含二硫键的蛋白和/或多肽选自赫赛汀,伊诺珠单抗奥加明,TGuard蛋白,布伦妥昔单抗维多汀,米维西单抗索拉维辛,Upifitamab利索多汀,恩福单抗维多汀,塞托珠单抗格列宁,泰利苏单抗维多汀,图沙米特单抗拉维坦辛,去甲状腺素瘤雷夫坦星,他卡西单抗泰德隆,淀粉样β/A4蛋白,Jag1蛋白,溶菌酶,iRGD肽,胰岛素。
进一步地,所述蛋白和/或多肽中含巯基和二硫键;
所述方法为方法5或方法6;
方法5包括以下步骤:先以含巯基和二硫键的蛋白和/或多肽、化合物A为原料在溶剂中进行第一步反应,然后加入糖基亚磺酸盐a、氧化剂,进行第二步反应,得到糖基亚磺酸盐a修饰的蛋白和/或多肽;然后加入糖基亚磺酸盐b、氧化剂,进行第三步反应,得到糖基亚磺酸盐a和糖基亚磺酸盐b修饰的蛋白和/或多肽;化合物A结构为
其中,LG为离去基团,R
w为烷基、芳基或杂芳基,或者R
w与LG连接成环;优选地,化合物A为
其中R
z为C
1-8烷基,优选为C
1-3烷基;
方法6包括以下步骤:先以含巯基和二硫键的蛋白和/或多肽、糖基亚磺酸盐a、氧化剂为原料在溶剂中进行第(1)步反应,得到糖基亚磺酸盐a修饰的蛋白和/或多肽;然后加入糖基亚磺酸盐b、氧化剂,进行第(2)步反应,得到糖基亚磺酸盐a和糖基亚磺酸盐b修饰的蛋白和/或多肽;
糖基亚磺酸盐a为上述的糖基亚磺酸盐,糖基亚磺酸盐b为上述的糖基亚磺酸盐,糖基亚磺酸盐a、糖基亚磺酸盐b相同或不同;
进一步地,方法5中,所述含巯基和二硫键的蛋白和/或多肽、化合物A、糖基亚磺酸盐a、糖基亚磺酸盐b、第二步反应采用的氧化剂、第三步反应采用的氧化剂的摩尔比为1:(1-3):(1-3):(1-3):(1-3):(1-3),优选为1:1.2:1.2:2:1.6:2;和/或,所述含巯基和二硫键的蛋白和/或多肽与溶剂的比例为(0.001-0.01)mmol:1mL,优选为0.005mmol:1mL;和/或,所述第一步反应的时间为5-20分钟,优选为10分钟;所述第二步反应的时间为0.2-1.5小时,优选为1小时;所述第三步反应的时间为0.2-1.5小时,优选为1小时;
方法6中,所述含巯基和二硫键的蛋白和/或多肽、糖基亚磺酸盐a、糖基亚磺酸盐b、第(1)步反应采用的氧化剂、第(2)步反应采用的氧化剂的摩尔比为1:(1-3):(1-3):(1-3):(1-3),优选为1:1.2:2:1.6:2;和/或,所述含巯基和二硫键的蛋白和/或多肽与溶剂的比例为(0.001-0.01)mmol:1mL,优选为0.005mmol:1mL;和/或,所述第(1)步反应的时间为0.2-1.5小时,优选为1小时;所述第(2)步反应的时间为0.2-1.5小时,优选为1小时。
进一步地,所述含巯基和二硫键的蛋白和/或多肽选自氨基酸序列为CCRGDKGPDC的多肽、氨基酸序列为SKDACIRTCVMCDEQ的多肽、Sublancin抗菌肽。
进一步地,所述糖基亚磺酸盐的结构如式I所示:
其中,n选自0或1;
a选自3或4;
R各自独立地选自L
1R
x;或者两个相邻的R连接成环,另外的R各自独立地选自L
1R
x,所述环为未被取代或被一个或两个以上L
1R
x取代的环;
L
1选自无或C
1~2亚烷基,R
x选自氢、羟基、C
1~6烷基、OAc、OBn、OR
8、NR
9R
10、
Ph、氨基、
i选自0-6的整数;;
R
11、R
12、R
13、R
14各自独立地选自L
2R
y;L
2选自无或C
1~2亚烷基,R
y选自氢、羟基、C
1~6烷基、OAc、OBn、OR
8、NR
9R
10;
R
8选自C
1~6烷基;
R
9选自氢、C
1~6烷基、Ac、Bn;
R
10选自氢、C
1~6烷基、Ac、Bn;
M
+为一价阳离子。
进一步地,所述糖基亚磺酸盐的结构如式II所示:
其中,R
1、R
2、R
3、R
4各自独立地选自L
1R
x;或者R
1、R
2、R
3、R
4中两个相邻的基团连接成环,另外两个基团各自独立地选自L
1R
x,所述环为未被取代或被一个或两个以上L
1R
x取代的5~6元环;
L
1选自无或亚甲基,R
x选自氢、羟基、C
1~5烷基、OAc、OBn、OR
8、NR
9R
10、
Ph、氨基、
i选自0-4的整数;
R
11、R
12、R
13、R
14各自独立地选自L
2R
y;L
2选自无或亚甲基,R
y选自氢、羟基、C
1~5烷基、OAc、OBn、OR
8、NR
9R
10;
R
8选自C
1~5烷基;
R
9选自氢、C
1~5烷基、Ac、Bn;
R
10选自氢、C
1~5烷基、Ac、Bn;
M
+为一价金属阳离子。
进一步地,所述糖基亚磺酸盐的结构如式III所示:
其中,R
5、R
6、R
7各自独立地选自L
1R
x;或者R
5、R
6、R
7中两个相邻的基团连接成环,另外一个基团为L
1R
x,所述环为未被取代或被一个或两个以上L
1R
x取代的5~6元环;
L
1选自无或亚甲基,R
x选自氢、羟基、C
1~5烷基、OAc、OBn、OR
8、 NR
9R
10、
Ph、氨基、
i选自0-4的整数;;
R
11、R
12、R
13、R
14各自独立地选自L
2R
y;L
2选自无或亚甲基,R
y选自氢、羟基、C
1~5烷基、OAc、OBn、OR
8、NR
9R
10;
R
8选自C
1~5烷基;
R
9选自氢、C
1~5烷基、Ac、Bn;
R
10选自氢、C
1~5烷基、Ac、Bn;
M
+为一价金属阳离子。
进一步地,所述5~6元环为5~6元饱和氧杂环;
R
8选自C
1~3烷基;
R
9选自氢、C
1~3烷基、Ac、Bn;
R
10选自氢、C
1~3烷基、Ac、Bn;
M
+选自Na
+、K
+、Li
+。
进一步地,所述糖基亚磺酸盐的结构选自:
本发明还提供了上述方法制备得到的糖基化修饰的蛋白和/或多肽。
关于本发明的使用术语的定义:除非另有说明,本文中术语提供的初始定义适用于整篇说明书的该术语;对于本文没有具体定义的术语,应该根据公开内容和上下文,给出本领域技术人员能够给予它们的含义。
蛋白质是一种大型生物分子,它由一个或多个由α-氨基酸残基组成的长 链条组成。α-氨基酸分子呈线性排列,相邻α-氨基酸残基的羧基和氨基通过肽键连接在一起,最后经过折叠形成有功能的立体结构。蛋白质的α-氨基酸序列是由对应基因所编码。除了遗传密码所编码的20种“标准”氨基酸,在蛋白质中,某些α-氨基酸残基还可以被改变原子的排序而发生化学结构的变化,从而对蛋白质进行激活或调控。多个蛋白质和矿物质可以一起,往往是通过结合在一起形成稳定的蛋白质复合物,这样的大分子结构就像机械一样,来发挥某一特定功能。
多肽指是由肽键连接的氨基酸短链。多肽属于生物聚合物和低聚物的广泛化学类别。多肽是天然存在的小生物分子,介于氨基酸和蛋白质之间的物质。氨基酸的分子量最小,蛋白质的分子量最大,而肽则是氨基酸单体组成的短链,由肽(酰胺)键连接。当一个氨基酸的羧基基团与另一个氨基酸的氨基反应时,形成该共价化学键。二胜肽(简称二肽),就是由二个氨基酸组成的蛋白质片段,两个或以上的氨基酸脱水缩合形成若干个肽键从而组成一个多肽,多个肽进行多级折叠就组成一个蛋白质分子。
抗体指是指机体由于抗原的刺激而产生的具有保护作用的蛋白质。
Antibody指一种人工修饰了末端氨基酸的抗体。
Mucin-1蛋白指黏蛋白-1。
GTP酶指三磷酸鸟苷酶。
非结构性蛋白指由病毒基因组编码的,在病毒复制或基因表达调控过程中具有一定功能,但最终并不结合生成成熟的病毒,不作为病毒结构一部分的蛋白。
淀粉样蛋白指当组织淀粉样变性时在组织内积聚的来自免疫球蛋白的糖蛋白。
氨基酸残基指由肽键连接的氨基酸失水后剩余部分。组成蛋白质或多肽的氨基酸在相互结合时,由于其部分基团参与了肽键的形成而失去一分子水,因此把多肽中的氨基酸单位称为氨基酸残基。
巯基指-SH,可以是来自半胱氨酸上的巯基;二硫键指-S-S-,可以是两个半胱氨酸以共价键连接形成的二硫键。
本发明以糖基亚磺酸盐为原料,提供了一种对蛋白质和/或多肽进行糖基化修饰的新方法,该方法反应原料易得,反应条件温和,反应耗时较短,反应过程可控,所得糖基化修饰的蛋白和/或多肽收率高,纯度高。
本发明的糖基化修饰方法不仅适用于含二硫键的蛋白质和/或多肽,还适用于含巯基的蛋白质和/或多肽,甚至适用于同时含二硫键和巯基的蛋白质和/或多肽,应用前景广阔。
本发明首次发现,利用本发明的方法对同时含二硫键和巯基的蛋白质和/或多肽进行糖基化修饰时,糖基化基团先修饰蛋白质和/或多肽中的巯基,再修饰蛋白质和/或多肽中的二硫键。本发明的方法能够对同时含二硫键和巯基的蛋白质和/或多肽进行过程可控的、多种糖基化修饰,应用前景广阔。
显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段, 在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
图1为本发明糖基化修饰蛋白质和/或多肽的方法的反应过程示意图。
图2为实施例1所得抗体偶联化合物的质量表征图谱。
图3为实施例2所得抗体偶联化合物的质量表征图谱。
图4为实施例5所得一号位巯基木糖基单一取代的多肽的质量表征图谱。
图5为实施例5所得一号位木糖基取代,二号位和九号位葡萄糖基取代的多肽的质量表征图谱。
本发明所用原料与设备均为已知产品,通过购买市售产品所得。
按照以下方法制备糖基亚磺酸盐:
(一)制备糖基亚磺酸盐1
具体操作为:
步骤1:向含有SI-1(3.9g,10mmol,1.0equiv)和25mL CH
2Cl
2的100ml圆底烧瓶中依次加入3-巯基丙酸甲酯(1.3mL,12mmol,1.2equiv)和BF
3·Et
2O(2.5mL,20mmol,2.0equiv)。将反应溶液在室温下搅拌1h,直至TLC监测显示SI-1完全消耗后用饱和NaHCO
3溶液水洗至中性。分离得有机层,并用盐水洗涤、无水硫酸钠干燥后浓缩,得到SI-2,无需纯化直接用于下一步骤。
步骤2:将SI-2溶解在20mL CH
2Cl
2中并在0℃下冷却。在搅拌条件下将m-CPBA(间氯过氧苯甲酸,6g,30mmol,3equiv)缓慢加入到反应溶液中。混合溶液于室温条件下搅拌1小时后过滤,滤液用饱和NaHCO
3溶液洗至中性,无水硫酸钠干燥、浓缩,加入甲基叔丁基醚,析出固体,过滤得到白色固体SI-3。
步骤3:在0℃下将SI-3溶解在20mL MeOH中,向其中加入MeONa(540mg,10mmol,1.0equiv),在0℃下搅拌2小时,TLC监测显示SI-3完全消耗后浓缩。用无水乙醇洗涤并过滤得到白色固体,即糖基亚磺酸盐1。三步总收率为85%。
(二)制备糖基亚磺酸盐2-20
参照上述糖基亚磺酸钠1的制备方法,区别仅在于将原料SI-1替换为对应的原料,分别制备得到糖基亚磺酸盐2-20。
糖基亚磺酸盐1-20的结构和表征见表1。糖基亚磺酸盐1-20的三步总收率和纯度见表2。
表1.糖基亚磺酸盐1-20的结构和表征
表2.糖基亚磺酸盐1-20的三步总收率和终产物纯度
实施例1:糖基化修饰含二硫键的抗体的方法
按照上述路线对抗体进行糖基化修饰,合成抗体偶联化合物,具体操作为:将糖基亚磺酸钠(4μmol)、来自罗氏制药的含有二硫键的赫赛汀抗体(0.01μmol),过氧叔丁醇(4μmol)和PBS buffer溶液(0.1mL)称量装至螺旋盖小瓶中混合,小瓶中充满N
2,并用特氟龙衬里的盖子密封。室温静置1小时,反应结束。
将反应液用半透膜(截留分子量为3kDa)分离,得到抗体偶联化合物。单一α构型,收率95%,纯度大于98%。经一级质谱以及二级质谱分析,抗体偶联化合物平均每条重链上接有四个葡萄糖分子,平均每条轻链上接有一个葡萄糖分子。
序列表征如下:
重链(平均每条重链上有四个葡萄糖分子):
轻链(平均每条轻链上有一个葡萄糖分子):
质量表征如图2所示。
实施例2:糖基化修饰含巯基的Affibody的方法
1.制备含有巯基的Affibody
将核苷酸序列为5'-ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCGAAAACCTGTATTTTCAGGGCCATATGGTTGATAACAAATTTAACAAAGAAATGCGCAACGCATATTGGGAAATTGCACTGCTGCCGAATCTGAATAATCAGCAGAAACGTGCGTTTATTCGTAGCCTGTATGATGATCCGAGTCAGAGCGCAAACCTGCTGGCAGAAGCAAAAAAACTGAATGATGCACAGGCACCGAAATGCtaG-3'(SEQ ID NO.3)的基因片段嵌入大肠杆菌的质粒,表达含有巯基的Affibody。然后进行蛋白免疫印迹(Western Blot)曝光,菌体重悬,超声破碎,分离上清液,先经镍柱亲和层析(过程中用binding Buffer冲洗,binding Buffer组成如下:50mM Tris,150mM NaCl,pH=7.4)),然后经蛋白凝胶柱层析,用100mL wash buffer持续洗脱(wash buffer组成如下:50mM Tris,150mM NaCl,20mM imidazole(咪唑),pH=7.4),收集洗脱液,浓缩,获得纯化的含有巯基的Affibody,其序列为: MGSSHHHHHHSSGENLYFQGHMVDNKFNKEMRNAYWEIALLPNLNNQQKRAFIRSLYDDP SQSANLLAEAKKLNDAQAPKC(SEQ ID NO.4)。
2.糖基化修饰含有巯基的Affibody
先将含有巯基的Affibody(0.01μmol)与2-甲基异噻唑并[4,5-b]吡啶-3(2H)-酮(2μmol)和PBS buffer溶液(0.1mL)在螺旋盖小瓶中混合,室温静置10分钟后,将糖基亚磺酸钠(4μmol)、过氧叔丁醇(4μmol)称量装至螺旋盖小瓶中混合,小瓶中充满N
2,并用特氟龙衬里的盖子密封。室温静置1小时,反应结束。
将反应液用半透膜分离(截留分子量为3kDa),得到抗体偶联化合物。单一α构型,收率95%,纯度大于98%。
序列表征如下:
质量表征如下:[M+11H]/11=853.2606(参见图3)。
实施例3:糖基化修饰含巯基的多肽的方法1
按照上述路线糖基化修饰多肽,合成多肽偶联化合物,具体操作为:先将含巯基的还原型谷胱甘肽(0.01mmol)与2-异丙基异噻唑并[4,5-b]吡啶-3(2H)-酮(0.03mmol)和PBS buffer(1mL)混合,室温静置10分钟后,将糖基亚磺酸钠(0.06mmol)、过氧叔丁醇(0.06mmol)称量装至螺旋盖小瓶中混合,小瓶中充满N
2,并用特氟龙衬里的盖子密封。室温静置1小时,反应结束。
将反应液经反相柱分离(梯度洗脱,洗脱剂为乙腈与水的混合溶液,其中乙腈的体积百分数为5%-95%),得到多肽偶联化合物。单一α构型,收率95%,纯度大于98%。结构表征如下:
1H NMR(400MHz,D
2O)δ5.50(d,J=5.5Hz,1H),4.64(dd,J=8.3,5.1Hz,1H),4.04–3.94(m,4H),3.87–3.77(m,3H),3.55(t,J=9.4Hz,1H),3.44(t,J=9.3Hz,1H),3.16–3.04(m,2H),2.64–2.54(m,2H),2.27–2.19(m,2H).
13C NMR(101MHz,D
2O)δ174.42,172.94,172.69,172.21,87.10,73.47,72.53,70.91,69.36,60.28,53.92,52.72,41.12,32.44,30.99,25.63.
19F NMR(376MHz,D
2O)δ-75.61.。
实施例4:糖基化修饰含巯基的多肽的方法2
按照上述路线糖基化修饰多肽,合成多肽偶联化合物,具体操作为:将含巯基的还原型谷胱甘肽(0.01mmol)、糖基亚磺酸钠(0.06mmol)、过氧叔丁醇(0.06mmol)和PBS buffer(1mL)称量装至螺旋盖小瓶中混合,小瓶中充满N
2,并用特氟龙衬里的盖子密封。室温静置1小时,反应结束。
将反应液经反相柱分离(梯度洗脱,洗脱剂为乙腈与水的混合溶液,其中乙腈的体积百分数为5%-95%),得到多肽偶联化合物。单一α构型,收率50%,纯度大于98%。结构表征如下:
1H NMR(400MHz,D
2O)δ5.50(d,J=5.5Hz,1H),4.64(dd,J=8.3,5.1Hz,1H),4.04–3.94(m,4H),3.87–3.77(m,3H),3.55(t,J=9.4Hz,1H),3.44(t,J=9.3Hz,1H),3.16–3.04(m,2H),2.64–2.54(m,2H),2.27–2.19(m,2H).
13C NMR(101MHz,D
2O)δ174.42,172.94,172.69,172.21,87.10,73.47,72.53,70.91,69.36,60.28,53.92,52.72,41.12,32.44,30.99,25.63.
19F NMR(376MHz,D
2O)δ-75.61.
实施例5:一锅两步法制备不同糖基化修饰的多肽偶联物
按照上述路线进行不同糖基化修饰,合成多肽偶联化合物,具体操作为:先将既含巯基又含二硫键的多肽(该多肽序列为CCRGDKGPDC(SEQ ID NO.6,二号位与九号位的半胱氨酸形成二硫键),0.005mmol)与2-甲基异噻唑并[4,5-b]吡啶-3(2H)-酮(0.006mmol)和水(1mL)混合,室温静置10分钟后,将木糖基亚磺酸钠(0.006mmol)、过氧叔丁醇(0.008mmol)称量装至螺旋盖小瓶中混合,小瓶中充满N
2,并用特氟龙衬里的盖子密封。室温静置1小时,反应结束,得到一号位巯基木糖基单一取代的多肽。再将葡萄糖基亚磺酸钠(0.01mmol),过氧叔丁醇(0.01mmol)称量装至同一小瓶中混合,小瓶中充满N
2,并用特氟龙衬里的盖子密封。将混合物在室温搅拌1小时,反应结束。
将反应液经反相柱分离(梯度洗脱,洗脱剂为乙腈与水的混合溶液,其中乙腈的体积百分数为5%-95%),得到一号位木糖基取代,二号位和九号位葡萄糖基取代的多肽。单一α构型,收率95%,纯度大于98%。
一号位巯基木糖基单一取代的多肽:
序列表征如下:
C(-Xyl)CRGDKGPDC((SEQ ID NO.7,二号位与九号位的C形成二硫键);
质量表征如下:[M+2H]/2=592.5524(参见图4)。
一号位木糖基取代,二号位和九号位葡萄糖基取代的多肽:
序列表征如下:
C(-Xyl)C(-Glu)RGDKGPDC(-Glu)(SEQ ID NO.8);
质量表征如下:[M+2H]/2=755.7004(参见图5)。
综上,本发明提供了一种蛋白和/或多肽糖基化修饰的方法,属于药物化学技术领域。本发明以糖基亚磺酸盐为原料,提供了一种对蛋白质和/或多肽进行糖基化修饰的方法,该方法反应原料易得,反应条件温和,反应耗时较短,反应过程可控,所得糖基化修饰的蛋白和/或多肽收率高,纯度高。本发明的糖基化修饰方法不仅适用于含二硫键的蛋白质和/或多肽,还适用于含巯基的蛋白质和/或多肽,甚至适用于同时含二硫键和巯基的蛋白质和/或多肽,应用前景广阔。
Claims (20)
- 一种蛋白和/或多肽糖基化修饰的方法,其特征在于:所述方法包括以下步骤:以包括糖基亚磺酸盐、蛋白和/或多肽、氧化剂在内的物质为原料在溶剂中反应,得到糖基化修饰的蛋白和/或多肽;其中,所述蛋白和/或多肽中含巯基和/或二硫键;所述糖基亚磺酸盐的结构如式W所示:其中,n选自0或1;a选自3或4;R各自独立地选自L 1R x;或者两个相邻的R连接成环,另外的R各自独立地选自L 1R x,所述环为未被取代或被一个或两个以上L 1R x取代的环;L 1选自无或C 1~2亚烷基,R x选自氢、羟基、C 1~6烷基、OAc、OBn、OR 8、NR 9R 10、 Ph、氨基、 i选自0-6的整数;R 11、R 12、R 13、R 14各自独立地选自L 2R y;L 2选自无或C 1~2亚烷基,R y选自氢、羟基、C 1~6烷基、OAc、OBn、OR 8、NR 9R 10;R 8选自C 1~6烷基;R 9选自氢、C 1~6烷基、Ac、Bn;R 10选自氢、C 1~6烷基、Ac、Bn;j为1、2或3;M j+为j价阳离子。
- 根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述氧化剂选自双氧水,过氧叔丁醇,过硫酸钾,氧气,叔丁基过氧化物中的一种或两种以上;和/或,所述溶剂为水性溶液,优选为水或缓冲液;和/或,所述反应的温度为室温;和/或,所述反应是在惰性气体氛围下进行的。
- 根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:所述蛋白和/或多肽中含巯基,蛋白和/或多肽中的氨基酸残基个数为70-1000个;所述方法为方法1或方法2;方法1包括以下步骤:先以含巯基的蛋白和/或多肽、化合物A为原料在溶剂中进行第一步反应,然后加入糖基亚磺酸盐、氧化剂,进行第二步反应,得到糖基化修饰的蛋白和/或多肽;化合物A为 其中,LG为离去基团,R w为烷基、芳基或杂芳基,或者R w与LG连接成环;优选地,化合物A为 其中R z为C 1-8烷基,优选为C 1-3烷基;方法2包括以下步骤:以含巯基的蛋白和/或多肽、糖基亚磺酸盐、氧化剂为原料在溶剂中反应,得到糖基化修饰的蛋白和/或多肽。
- 根据权利要求3所述的方法,其特征在于:方法1中,所述含巯基的蛋白和/或多肽、化合物A、糖基亚磺酸盐、氧化剂的摩尔比为1:(10-300):(20-600):(20-600),优选为1:200:400:400;和/或,所述含巯基的蛋白和/或多肽与溶剂的比例为(0.05-0.5)μmol:1mL,优选为0.1μmol:1mL;和/或,所述第一步反应的时间为1-20分钟,优选为10分钟;所述第二步反应的时间为0.2-1.5小时,优选为1小时;方法2中,所述含巯基的蛋白和/或多肽、糖基亚磺酸盐、氧化剂的摩尔比为1:(20-600):(20-600),优选为1:400:400;和/或,所述含巯基的蛋白和/或多肽与溶剂的比例为(0.05-0.5)μmol:1mL,优选为0.1μmol:1mL;和/或,所述反应的时间为0.2-1.5小时,优选为1小时。
- 根据权利要求3或4所述的方法,其特征在于:所述含巯基的蛋白和/或多肽选自含巯基的Affibody,Mucin 1蛋白,GTP酶,含巯基的非结构性蛋白,含巯基的淀粉样蛋白;优选地,所述含巯基的Affibody的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
- 根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:所述蛋白和/或多肽中含巯基,蛋白和/或多肽中的氨基酸残基个数为1-100个;所述方法为方法3或方法4;方法3包括以下步骤:先以含巯基的蛋白和/或多肽、化合物A为原料在溶剂中进行第一步反应,然后加入糖基亚磺酸盐、氧化剂,进行第二步反应,得到糖基化修饰的蛋白和/或多肽;化合物A结构为 其中,LG为离去基团,R w为烷基、芳基或杂芳基,或者R w与LG连接成环;优选地,化合物A为 其中R z为C 1-8烷基,优选为C 1-3烷基;方法4包括以下步骤:以含巯基的蛋白和/或多肽、糖基亚磺酸盐、氧化剂为原料在溶剂中反应,得到糖基化修饰的蛋白和/或多肽。
- 根据权利要求6所述的方法,其特征在于:方法3中,所述含巯基的蛋白和/或多肽、化合物A、糖基亚磺酸盐、氧化剂的摩尔比为1:(1-3):(3-10):(3-10),优选为1:3:6:6;和/或,所述含巯基的蛋白和/或多肽与溶剂的比例 为(0.01-0.2)mmol:1mL,优选为0.01mmol:1mL;和/或,所述第一步反应的时间为1-20分钟,优选为10分钟;所述第二步反应的时间为0.2-1.5小时,优选为1小时;方法4中,所述含巯基的蛋白和/或多肽、糖基亚磺酸盐、氧化剂的摩尔比为1:(3-10):(3-10),优选为1:6:6;和/或,所述含巯基的蛋白和/或多肽与溶剂的比例为(0.01-0.2)mmol:1mL,优选为0.01mmol:1mL;和/或,所述反应的时间为0.2-1.5小时,优选为1小时。
- 根据权利要求6或7所述的方法,其特征在于:所述含巯基的蛋白和/或多肽选自αVβ3整合素结合肽,细胞穿透肽-R8,还原型谷胱甘肽。
- 根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:所述蛋白和/或多肽中含二硫键,蛋白和/或多肽中的氨基酸残基个数为2-2000个;所述方法包括以下步骤:将糖基亚磺酸盐、含二硫键的蛋白和/或多肽、氧化剂在溶剂中反应,得到糖基化修饰的蛋白和/或多肽。
- 根据权利要求9所述的方法,其特征在于:所述含二硫键的蛋白和/或多肽、糖基亚磺酸盐、氧化剂的摩尔比为1:(60-600):(20-600),优选为1:400:400;和/或,所述含二硫键的蛋白和/或多肽与溶剂的比例为(0.05-0.5)μmol:1mL,优选为0.1μmol:1mL;和/或,所述反应的时间为0.2-1.5小时,优选为0.5-1小时。
- 根据权利要求9或10所述的方法,其特征在于:所述含二硫键的蛋白和/或多肽选自赫赛汀,伊诺珠单抗奥加明,TGuard蛋白,布伦妥昔单抗维多汀,米维西单抗索拉维辛,Upifitamab利索多汀,恩福单抗维多汀,塞托珠单抗格列宁,泰利苏单抗维多汀,图沙米特单抗拉维坦辛,去甲状腺素瘤雷夫坦星,他卡西单抗泰德隆,淀粉样β/A4蛋白,Jag1蛋白,溶菌酶,iRGD肽,胰岛素。
- 根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:所述蛋白和/或多肽中含巯基和二硫键;所述方法为方法5或方法6;方法5包括以下步骤:先以含巯基和二硫键的蛋白和/或多肽、化合物A为原料在溶剂中进行第一步反应,然后加入糖基亚磺酸盐a、氧化剂,进行第二步反应,得到糖基亚磺酸盐a修饰的蛋白和/或多肽;然后加入糖基亚磺酸盐b、氧化剂,进行第三步反应,得到糖基亚磺酸盐a和糖基亚磺酸盐b修饰的蛋白和/或多肽;化合物A结构为 其中,LG为离去基团,R w为烷基、芳基或杂芳基,或者R w与LG连接成环;优选地,化合物A为 其中R z为C 1-8烷基,优选为C 1-3烷基;方法6包括以下步骤:先以含巯基和二硫键的蛋白和/或多肽、糖基亚磺 酸盐a、氧化剂为原料在溶剂中进行第(1)步反应,得到糖基亚磺酸盐a修饰的蛋白和/或多肽;然后加入糖基亚磺酸盐b、氧化剂,进行第(2)步反应,得到糖基亚磺酸盐a和糖基亚磺酸盐b修饰的蛋白和/或多肽;糖基亚磺酸盐a为权利要求1所述的糖基亚磺酸盐,糖基亚磺酸盐b为权利要求1所述的糖基亚磺酸盐,糖基亚磺酸盐a、糖基亚磺酸盐b相同或不同;
- 根据权利要求12所述的方法,其特征在于:方法5中,所述含巯基和二硫键的蛋白和/或多肽、化合物A、糖基亚磺酸盐a、糖基亚磺酸盐b、第二步反应采用的氧化剂、第三步反应采用的氧化剂的摩尔比为1:(1-3):(1-3):(1-3):(1-3):(1-3),优选为1:1.2:1.2:2:1.6:2;和/或,所述含巯基和二硫键的蛋白和/或多肽与溶剂的比例为(0.001-0.01)mmol:1mL,优选为0.005mmol:1mL;和/或,所述第一步反应的时间为5-20分钟,优选为10分钟;所述第二步反应的时间为0.2-1.5小时,优选为1小时;所述第三步反应的时间为0.2-1.5小时,优选为1小时;方法6中,所述含巯基和二硫键的蛋白和/或多肽、糖基亚磺酸盐a、糖基亚磺酸盐b、第(1)步反应采用的氧化剂、第(2)步反应采用的氧化剂的摩尔比为1:(1-3):(1-3):(1-3):(1-3),优选为1:1.2:2:1.6:2;和/或,所述含巯基和二硫键的蛋白和/或多肽与溶剂的比例为(0.001-0.01)mmol:1mL,优选为0.005mmol:1mL;和/或,所述第(1)步反应的时间为0.2-1.5小时,优选为1小时;所述第(2)步反应的时间为0.2-1.5小时,优选为1小时。
- 根据权利要求12或13所述的方法,其特征在于:所述含巯基和二硫键的蛋白和/或多肽选自氨基酸序列为CCRGDKGPDC的多肽、氨基酸序列为SKDACIRTCVMCDEQ的多肽、Sublancin抗菌肽。
- 根据权利要求1-14任一项所述的方法,其特征在于:所述糖基亚磺酸盐的结构如式I所示:其中,n选自0或1;a选自3或4;R各自独立地选自L 1R x;或者两个相邻的R连接成环,另外的R各自独立地选自L 1R x,所述环为未被取代或被一个或两个以上L 1R x取代的环;L 1选自无或C 1~2亚烷基,R x选自氢、羟基、C 1~6烷基、OAc、OBn、OR 8、 NR 9R 10、 Ph、氨基、 i选自0-6的整数;;R 11、R 12、R 13、R 14各自独立地选自L 2R y;L 2选自无或C 1~2亚烷基,R y选自氢、羟基、C 1~6烷基、OAc、OBn、OR 8、NR 9R 10;R 8选自C 1~6烷基;R 9选自氢、C 1~6烷基、Ac、Bn;R 10选自氢、C 1~6烷基、Ac、Bn;M +为一价阳离子。
- 根据权利要求15所述的方法,其特征在于:所述糖基亚磺酸盐的结构如式II所示:其中,R 1、R 2、R 3、R 4各自独立地选自L 1R x;或者R 1、R 2、R 3、R 4中两个相邻的基团连接成环,另外两个基团各自独立地选自L 1R x,所述环为未被取代或被一个或两个以上L 1R x取代的5~6元环;L 1选自无或亚甲基,R x选自氢、羟基、C 1~5烷基、OAc、OBn、OR 8、NR 9R 10、 Ph、氨基、 i选自0-4的整数;R 11、R 12、R 13、R 14各自独立地选自L 2R y;L 2选自无或亚甲基,R y选自氢、羟基、C 1~5烷基、OAc、OBn、OR 8、NR 9R 10;R 8选自C 1~5烷基;R 9选自氢、C 1~5烷基、Ac、Bn;R 10选自氢、C 1~5烷基、Ac、Bn;M +为一价金属阳离子。
- 根据权利要求15所述的方法,其特征在于:所述糖基亚磺酸盐的结构如式III所示:其中,R 5、R 6、R 7各自独立地选自L 1R x;或者R 5、R 6、R 7中两个相邻的基团连接成环,另外一个基团为L 1R x,所述环为未被取代或被一个或两个以上L 1R x取代的5~6元环;L 1选自无或亚甲基,R x选自氢、羟基、C 1~5烷基、OAc、OBn、OR 8、NR 9R 10、 Ph、氨基、 i选自0-4的整数;;R 11、R 12、R 13、R 14各自独立地选自L 2R y;L 2选自无或亚甲基,R y选自氢、羟基、C 1~5烷基、OAc、OBn、OR 8、NR 9R 10;R 8选自C 1~5烷基;R 9选自氢、C 1~5烷基、Ac、Bn;R 10选自氢、C 1~5烷基、Ac、Bn;M +为一价金属阳离子。
- 根据权利要求16或17所述的方法,其特征在于:所述5~6元环为5~6元饱和氧杂环;R 8选自C 1~3烷基;R 9选自氢、C 1~3烷基、Ac、Bn;R 10选自氢、C 1~3烷基、Ac、Bn;M +选自Na +、K +、Li +。
- 根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述糖基亚磺酸盐的结构选自:
- 权利要求1-19任一项所述方法制备得到的糖基化修饰的蛋白和/或多肽。
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