JP5877712B2 - 官能基化試薬およびその使用 - Google Patents

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Description

本発明は、官能基化試薬ならびにタンパク質およびポリペプチド類の修飾のためにそれらを使用する方法に関する。本発明は、本発明の方法によって製造された、官能基化されたポリペプチド類の使用にさらに関する。より具体的には、本発明は、ビニル置換基を有し、カップリングパートナー(coupling partner)に共有結合された、窒素を含む複素環式芳香環を含む官能基化試薬を用いる。典型的には、カップリングパートナーは、ポリ(アルキレングリコール)分子またはグリカン群(glycan group)などのポリペプチドの特性を代替することができる。
ポリエチレングリコール(PEG)ポリマーを治療用ポリペプチド類に共有結合させることができること、ペグ化(pegylation)と呼ばれる方法が、当分野において知られている。ペグ化は、通常、典型的にはヒドロキシル基、チオール基、アミン基またはカルボン酸基などの官能基を含む誘導体を使用して、ポリペプチドをPEG分子の反応性誘導体と反応させて行われる。ペグ化反応において、PEG分子の反応性官能基は、ポリペプチド内に存在するアミノ酸のアミノ基、カルボキシル基またはチオール基と、あるいはポリペプチドの反応性N-またはC-末端と安定な共有結合を形成する。一般的に、ペグ化反応は、マレイミドなどの反応性架橋試薬の使用を必要とする。
しかしながら、主に反応性架橋剤の使用の結果として、ペグ化は比較的制御されていない反応であることも知られている。なぜならPEG分子は数多くの異なる方法で、ポリペプチド類内に存在する複数の官能基と反応することができ、これにより不均質な生成物を生成するためである。これは、得られるペグ化された(pegylated)ポリペプチド類が、直鎖または分枝状の構造を有することができ、および/またはそれぞれのポリペプチドと結合した様々な数のPEG分子を有することを意味する。反応は、タンパク質の種類および濃度、反応時間、温度およびpH値などの因子によって影響を受け、これらの全ては反応の最終生成物に影響を与える。
一般的に、ペグ化を行って、ポリペプチド類の薬物速度論的特性または免疫学的特性、特に静脈内投与されるものに影響を与える。特に、ポリペプチド類を代替して、その安定性、生物学的半減期、水溶性および免疫学的特徴を改善することができる。その質量を増加させるため(例えば20〜50kDa)のポリペプチドのペグ化は、腎臓を通ってすぐに排出されにくく、それゆえ長い間体内に留まることを意味すると考えられる。さらに、ペグ化されたポリペプチド類は、内因性酵素による分解から保護され、これはin vivoの半減期の増加を助けると考えられる。in vivoの半減期を増加させること、およびポリペプチド薬の有効性を改善することは、患者が必要とするポリペプチドの頻度または用量の低減を導き、それゆえポリペプチドに対する免疫反応の低下を助けるものとさらに考えられる。ペグ化は、疎水性ポリペプチド類に対する水溶性の改善を助けることもできる。
しかしながら、ペグ化されたポリペプチド類の特性は、特に治療用ポリペプチド類において望ましい一方、ペグ化反応における制御の欠如は問題のままであり、これはたいてい様々な広い範囲の特性を有する広い範囲の製品を導く。さらに、ポリペプチド類は複合分子であるため、保護基を使用して反応の部位および/または範囲を制御すること、例えば小分子の化学において可能であることは困難である。
ポリペプチド類のグリコシル化は、ポリペプチド類の構造および機能を代替する翻訳後修飾の天然の形態である。天然において、グリコシル化は、様々な種類のグリコシル化されたポリペプチド類の部位特異的修飾を導く酵素過程によって導入される。N-結合されたグリコシル化において、グリカン類は、アスパラギン側鎖のアミド窒素に結合し、O-結合されたグリコシル化において、グリカン類は、セリンおよびトレオニン側鎖のヒドロキシ酸素に結合する。グリコシル化の他の形態には、セリンのヒドロキシ酸素に結合したグリコサミノグリカン類、グリカン類がセラミドに結合した糖脂質類、タンパク質または脂質のどちらかに結合していないヒアルロナン、およびグリカン結合を通してタンパク質を脂質に結合したGPIアンカーが含まれる。
グリコシル化はたいてい真核細胞におけるポリペプチド類に付加されるが、治療用ポリペプチド類の組み換え発現のためにたいてい使用される原核宿主において発現されるポリペプチド類にめったに付加されないという、当分野における一般的な問題が存在する。原核宿主において生成されたポリペプチド類内のグリコシル化が存在しないことは、異質なものとして認識されたポリペプチド類を導き得るか、他にその天然の形態とは異なる特性を有することを意味する。また、ポリペプチド類の特性を調整するためのこの使用において、天然のグリコシル化が存在しない部位における、ポリペプチド類へのグリコシル化を設計することが困難であるという問題も存在する。
WO 88/05433は、ポリペプチド類の結合体を製造するための架橋試薬、および信号発生または細胞毒性化学物質を開示する。架橋試薬は広い範囲の芳香族の窒素を含む複素環式化合物、特に2-、3-または4-ビニルピリジンおよびビニルピリミジンからなり、これらに信号発生または細胞毒性化学物質が、架橋試薬に存在する活性化されたエステル置換基を介して結合することができる。結合反応は、ポリペプチド類内に存在するチオール基と反応する試薬のビニル基に依存する。WO 88/05433に開示された化合物の全ては、芳香族の窒素を含む複素環の官能基として、電子吸引性置換基を含む。WO 88/05433は、架橋試薬を使用したポリペプチドへの信号発生または細胞毒性化学物質の結合を示すいかなる実施例も提供していないことに注意されたい。
WO 2005/024041は、プロテオミクス法における使用のための2つ以上の細胞集団における質量標識タンパク質(mass-tagging protein)の方法を記載している。標識は、集団の1つにおけるシステイン残基を2-ビニルピリジンと、および他の集団におけるシステイン残基をC1〜4アルキルで置換された2-ビニルピリジンと反応させることを含み、これにより質量分析によって区別可能な質量を有する、標識されたタンパク質を生成する。
Banasら(Biochimica et Biophysica Acta、957(2): 178-84、1988)は、ビニルピリジン、ブロモピルベートおよびジチオニトロ安息香酸を使用して、E. coli ホスホフルクト-1-キナーゼのシステイン残基の反応性を研究して、ポリペプチド内に存在する6つのシステイン残基の相対的な反応性を定めた。
Fullmer(Analytical Biochemistry、142(2): 336-9、1984)は、ペプチド類のアミノ酸組成物の分析、特にシステインおよびトリプトファンの同定を改善する方法を記載している。改善のうちの1つは、生成したシステイン誘導体は酸の加水分解に対して安定であるため、ジスルフィド結合の還元開裂後に4-ビニルピリジンを使用してペプチド内に存在するシステイン残基の半分を保護する。
WO 88/05433 WO 2005/024041
Banasら、Biochimica et Biophysica Acta、957(2): 178-84、1988 Fullmer、Analytical Biochemistry、142(2): 336-9、1984
PEG分子およびグリカン群などのカップリングパートナーとのポリペプチド類の誘導体化を改善する、当分野における問題が存在したままである。
概して、本発明は、化合物、ならびにポリ(アルキレングリコール)分子およびグリカン群などの部分でポリペプチド類を官能基化するためのその使用方法に関する。この化学は、天然に存在するか、または例えば1つ以上のシステイン残基のチオール基を用いることによってポリペプチドに導入される、1つ以上のチオール基と反応することができるビニル置換基を有する、窒素を含む複素環式芳香環を含む官能基化試薬に基づいている。一般的に、官能基化試薬は、ポリエチレングリコール(PEG)分子などのポリ(アルキレングリコール)分子、またはグリカン群に共有結合されており、ビニル基とポリペプチド内のチオール基との間の反応が、ポリペプチドをポリ(アルキレングリコール)分子および/またはグリカン群に共有結合する。
したがって、一態様において、本発明は、少なくとも1つの反応性チオール基を有するポリペプチドを、ポリペプチドの少なくとも1つのチオール基と反応することができるビニル基を有する、窒素を含む複素環式芳香環を含む官能基化試薬と反応させることを含む方法を提供し、ここで官能基化試薬は、ポリ(アルキレングリコール)分子および/またはグリカン群に共有結合されて、官能基化試薬のビニル置換基がポリペプチドのチオール基と反応し、これによりポリ(アルキレングリコール)分子またはグリカン群をポリペプチドに共有結合する。
さらなる態様において、本発明は、少なくとも1つの反応性チオール基を有するポリペプチドを修飾する方法、例えばペグ化またはグリコシル化する方法を提供し、この方法は、ポリペプチドを、ポリペプチドの少なくとも1つのチオール基と反応することができるビニル置換基を有する、窒素を含む複素環式芳香族環を含む官能基化試薬と接触させることを含み、ここで、官能基化試薬は、ポリ(アルキレングリコール)分子、例えばポリエチレングリコール(PEG)分子またはグリカン群に共有結合されており、官能基化試薬のビニル置換基がポリペプチドのチオール基と反応し、これによりポリ(アルキレングリコール)分子またはグリカン群をポリペプチドに共有結合する。
本発明の方法は、官能基化試薬とポリペプチドとを反応させてそれらを一緒に結合する工程に加えて、1つ以上の工程を含んでもよい。例として、この方法は、ビニル置換基を有する、窒素を含む複素環式芳香族環を含む前駆体官能基化試薬を、ポリ(アルキレングリコール)分子またはグリカン群と反応させて、官能基化試薬を製造する初期工程を含んでもよい。代わりにまたは加えて、この方法は、本発明による官能基化試薬との反応のための1つ以上のチオール基を選択し、場合によって残りのチオール基のうちのいくつかを保護する、ポリペプチド内の反応性チオール基の位置を決定する初期工程を含んでもよい。その後、ポリペプチドを、本明細書に記載した官能基化試薬と反応させてもよい。上記から、ビニル基とポリペプチドのチオール基との反応は、一般的に、-CH2-CH2-S-基を生成し、官能基化試薬とポリペプチドとを共有結合することが理解される。この反応において生成されるチオエステル結合は、一般的に、生物学的条件下で非常に安定である。この安定性は、保存で開環などの反応を受けるポリペプチドを誘導体化するために使用される場合、潜在的な欠点に苦しむ架橋試薬としてマレイミドを使用する先行技術と対照的である。
ポリペプチドが好適なチオール基を含まない、またはポリペプチド鎖内の所望の位置に好適なチオール基を含まない本発明の実施形態において、本発明は、例えば化学反応または部位特異的変異導入(site directed mutagenesis)によって元のポリペプチドを修飾して、ポリペプチドの1つ以上の所望の位置にチオール基を有する変異ポリペプチドを製造する初期工程を含んでもよい。好ましくは、これはシステイン残基でポリペプチド内のアミノ酸のうちの1つ以上を置換することによって行われる。ポリペプチド類のグリコシル化に関する本発明の実施形態において、元のポリペプチドは、天然のグリコシル化部位、例えばアスパラギン、トレオニンまたはセリン残基において修飾されて、その後1つ以上のグリカン群を含む官能基化試薬と反応することができるチオール基を導入されてもよい。これは、元のポリペプチドがこの位置でグリコシル化されない場合、例えば、生成される方法の結果として、またはグリコシル化が取り除かれた場合に行われてもよい。
代わりにまたは加えて、本発明の方法は、反応性チオール基と空間的に近位にあるアミノ酸残基を修飾して、官能基化試薬へのチオール基の反応性を改善することを含んでもよい。例として、空間的に近位にあるアミノ酸残基に修飾を行い、局所的なpH、水素結合相互作用、水和水、または反応性チオール基のまわりの立体的な近づきやすさを代えてもよい。
好ましくは、反応性チオール基は、それがポリペプチド内に天然に存在する、または導入されている場合、システインアミノ酸残基の一部である。
上で規定した方法を行った後、ペグ化またはグリコシル化されたポリペプチドは、1つ以上のさらなる工程で精製または単離されてもよい。
さらなる態様において、本発明は、ポリペプチドをポリ(アルキレングリコール)またはグリカン群で官能基化するための、以下の式:
で表される化合物を提供し、
ここで、
XおよびYは、独立に、CHまたはNから選択され;
少なくともR1、場合によってR2は、ポリ(アルキレングリコール)分子および/またはグリカン群に共有結合され、
R1、場合によってR2は、独立に、
-(CH2)n-Z-(CH2)o-R(ここで、ZはO、SまたはNHであり、nは0から10であり、oは0から10であり、Rは水素、ポリ(アルキレングリコール)分子またはグリカン群である); あるいは
-C(O)-Z-(CH2)o-R(ここで、ZはO、SまたはNHであり、oは0から10であり、Rは水素、ポリ(アルキレングリコール)分子またはグリカン群である); あるいは
-(CH2)n-Z-C(O)-(CH2)o-R(ここで、ZはO、SまたはNHであり、nは0から10であり、oは0から10であり、Rは水素、ポリ(アルキレングリコール)分子またはグリカン群である); あるいは
-Y-(CH2)n-Z-C(O)-(CH2)o-R(ここで、Yはアリール基、O、SまたはNHであり、ZはOまたはNHであり、nは0から10であり、oは0から10であり、Rは水素、ポリ(アルキレングリコール)分子またはグリカン群である); あるいは
-Y-R(ここで、YはOまたはSであり、Rは水素、グリカン、ポリ(アルキレングリコール)分子、アリールまたはC1〜10アルキルである);
から選択され、
ただし、R2がポリ(アルキレングリコール)分子またはグリカン群に結合されていない場合、それは、水素、または電子吸引性基、例えばハロゲン(F、Cl、またはBr)、-NO2、-CO2H、-CO2R4、COR4、-CHO、-CN、-CF3、-SO2NR4R5、アルキルもしくはフェニルからさらに選択されてもよく、ここで、R4およびR5は、独立に、水素またはC1〜10アルキルから選択され;
あるいは、R2とR3とが一緒に、縮合(ヘテロ)芳香環置換基を形成し、これには、これに限定されないが、インドール、インダゾール、ベンズイミダゾール、キノリン、イソキノリン、アジラジンまたはプリンが含まれてもよく;
あるいは、R3は、水素、または、ハロ; ヒドロキシ; エーテル(例えばC1〜7アルコキシ); ホルミル; アシル(例えばC1〜7アルキルアシル、C5〜20アリールアシル); カルボキシ; エステル; アシルオキシ; アミド; アシルアミド; チオアミド; テトラゾリル; アミノ; ニトロ; ニトロソ; アジド; シアノ; イソシアノ; シアナート; イソシアナート; チオシアノ; イソチオシアノ; チオエーテル(例えばC1〜7アルキルチオ); スルホン酸; スルホネート; スルホン; スルホニルオキシ; スルフィニルオキシ; スルファミノ; スルホンアミノ; スルフィンアミノ; スルファミル; スルホンアミド; C1〜7アルキル(例えば置換されていないC1〜7アルキル、C1〜7ハロアルキルまたはC1〜7ヒドロキシアルキル、C1〜7カルボキシアルキル、C1〜7アミノアルキルを含む)から選択される置換基から選択される。
いくつかの実施形態において、上記のリンカーとして、Yは、上で規定した他の基を有するOまたはNHである。加えてまたは代わりに、電子吸引性基は、アルキル基ではない。
好ましくは、窒素を含む複素環式芳香環は、置換されたピリジン環(XおよびYは両方ともCHである)または置換されたピリミジン環(XおよびYのうちの1つはCHであり、もう1つはNである)である。
好ましくは、ポリ(アルキレングリコール)分子および/またはグリカン基を、窒素を含む複素環式芳香環に結合するためのR1および/またはR2基は、独立に、上で規定した置換基を有する-(CH2)n-Z-(CH2)o-Rまたは-C(O)-Z-(CH2)o-Rから選択される。より好ましくは、R1およびR2基において、oは0であり、これらの基は、上で規定した置換基を有する-(CH2)n-Z-Rまたは-C(O)-Z-Rとして表される。
窒素を含む複素環式芳香環に結合した基のうちの1つまたは2つがポリ(アルキレングリコール)分子および/またはグリカン群であってもよい可能性を含むことによって、本発明は、R1およびR2を、両方ともポリ(アルキレングリコール)分子またはグリカン群とするか、1つをポリ(アルキレングリコール)分子として1つをグリカン群とすることができ、これにより混合された官能基化試薬を製造することができる。
好ましくは、窒素を含む複素環式芳香環は、ピリジン環、ピリミジン環またはアジジン環である。より好ましくは、窒素を含む複素環式芳香環は、ピリジン環またはピリミジン環であり、最も好ましくは、これはピリジン環である。ピリジン環またはピリジミジン環が用いられる場合、好ましくは、ビニル基は、窒素のヘテロ原子に対して2位に存在する。
しかしながら、いくつかの実施形態において、より広がった縮合複素環式芳香環系、例えばインドール、インダゾール、ベンズイミダゾール、キノリン、イソキノリン、アジラジンまたはプリンを用いることができる。
一般的に、ポリ(アルキレングリコール)分子またはグリカン群は、上の式に示したR1および/またはR2基に直接共有結合する。結合基は様々な長さを有してもよく、ポリ(アルキレングリコール)分子またはグリカン群を、ポリペプチドから近くまたは遠くに離れさせる。リンカーの長さは、選択し得る。
しかしながら、いくつかの実施形態において、R1基とポリ(アルキレングリコール)分子またはグリカン群との間に伸びたリンカーを含むことが望ましい。このようなリンカーは、官能基化基の相溶性または免疫特性を代替する必要があってもよい。
本発明による好ましい分類の官能基化試薬は、以下の一般式:
で表されてもよく、
ここで、
少なくともR1、場合によってR2は、ポリ(アルキレングリコール)分子および/またはグリカン群に共有結合され、
R1、場合によってR2は、独立に、
-(CH2)n-Z-(CH2)o-C(O)-R(ここで、ZはO、SまたはNHであり、nは0から10であり、oは0から10であり、Rは水素、ポリ(アルキレングリコール)分子またはグリカン群である); あるいは
-(CH2)n-Z-(CH2)o-R(ここで、ZはO、SまたはNHであり、nは0から10であり、oは0から10であり、Rは水素、ポリ(アルキレングリコール)分子またはグリカン群である); あるいは
-C(O)-Z-(CH2)o-R(ここで、ZはO、SまたはNHであり、oは0から10であり、Rは水素、ポリ(アルキレングリコール)分子またはグリカン群である); あるいは
-(CH2)n-Z-C(O)-(CH2)o-R(ここで、ZはO、SまたはNHであり、nは0から10であり、oは0から10であり、Rは水素、ポリ(アルキレングリコール)分子またはグリカン群である); あるいは
-Y-(CH2)n-Z-C(O)-(CH2)o-R(ここで、Yはアリール基、O、SまたはNHであり、ZはOまたはNHであり、nは0から10であり、oは0から10であり、Rは水素、ポリ(アルキレングリコール)分子またはグリカン群である); あるいは
-Y-R(ここで、YはOまたはSであり、Rは水素、グリカン、ポリ(アルキレングリコール)分子、アリールまたはC1〜10アルキルである);
から選択され、
ただし、R2がポリ(アルキレングリコール)分子またはグリカン群に結合されていない場合、それは、水素、または電子吸引性基、例えばハロゲン(F、Cl、またはBr)、-NO2、-CO2H、-CO2R4、COR4、-CHO、-CN、-CF3、-SO2NR4R5、アルキルもしくはフェニルからさらに選択されてもよく、ここで、R4およびR5は、独立に、水素またはC1〜10アルキルから選択される。
好ましい分類の官能基化試薬において、
R1は、-(CH2)n-Z-(CH2)o-C(O)-R(ここで、ZはO、SまたはNHであり、nは0から10であり、oは0から10であり、Rは1つ以上のポリ(アルキレングリコール)分子またはグリカン群である)であり; および/または
R2は、水素、アルキルまたは-(CH2)n-Z-(CH2)o-C(O)-R(ここで、ZはO、SまたはNHであり、nは0から10であり、oは0から10であり、Rは1つ以上のポリ(アルキレングリコール)分子またはグリカン群である)である。
さらなる態様において、本発明は、1つ以上のポリ(アルキレングリコール)分子またはグリカン群を含むポリペプチド結合体を提供し、ここで、ポリペプチドは、ポリペプチド内に存在するチオール基と上で規定した官能基化試薬を介してポリ(アルキレングリコール)分子またはグリカン群と共有結合された治療用ポリペプチドである。
さらなる態様において、本発明は、治療における使用のための上で規定したポリペプチド結合体を提供する。
本発明の実施形態はここに例として記載され、添付する図への参照によって制限されない。
広い範囲のリンカーのグルタチオンとの反応の相対速度。 ビニルピリジン-PEG誘導体対マレイミド-PEGによるヒト組み換えインターフェロン-ベータの標識。 ビニルピリジン-5k-PEGによるBSAの標識の速度に対するpHの影響。 組み換えIFNベータ(C17S、D80N)による5kDaのPEG/ピリジン反応の温度依存性。 PermaLinkによるモデルのタンパク質の官能基化。 システイン残基のためのリンカーの特異性。
(ポリペプチド類)
本発明の方法は、一般的に、具体的におよび直接的に官能基、特にポリ(アルキレングリコール)分子およびグリカン群をポリペプチド類に導入することができる反応に基づいて、広い範囲の用途に適用可能である。記載された方法は、単独のアミノ酸およびペプチド類から100kDaまでまたは100kDaを超える分子量を有するポリペプチド類およびタンパク質まで、任意のサイズまたは種類のポリペプチドに適用可能である。したがって、便宜上、本明細書におけるこの方法は、一般的に、「ポリペプチド類」と表して記載されるが、これは、時として先行技術においてペプチド類として表される短い配列のアミノ酸(例えば長さが2、3、4、5または10のアミノ酸から長さが30、40または50のアミノ酸まで)を含むとするべきである。この用語は、一般的にタンパク質、同様にマルチドメインタンパク質として表される、第二級、第三級または第四級構造を有するポリペプチド類を含むとするべきである。
本明細書において開示される方法および試薬は、治療用ポリペプチド類を官能基化するため、例えばポリペプチドの安定性、生物学的半減期または水溶性、あるいは免疫学的特徴などのその薬理学的特性を改良するために特に有用である。
本発明による修飾されてもよい好適な分類のポリペプチドの例には、エリスロポエチン(EPO)、インターフェロン、インターロイキン、ケモカイン、リンホカイン、サイトカイン、インスリン、モノクローナル抗体およびフラグメント、血液凝固因子、コロニー刺激因子(CSFs)、成長ホルモン、プラスミノゲン活性化因子、ウイルス由来ペプチド類、生殖ホルモン、治療用酵素および担体タンパク質(例えば共役ワクチンを作るために使用されるもの)が含まれる。用いられてもよいポリペプチド類の具体的な例には、コロニー刺激因子(CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、第VIIa因子、第VIII因子、第IX因子、ヒト成長ホルモン(hGH)、デオキシリボヌクレアーゼ(DNase)、インスリン、グルカゴン、VEGF、VEGF受容体、TNF、TNF受容体、血小板由来成長因子(PDGF)、組織プラスミノゲン活性化因子(tPA)、エリスロポエチン(EPO)、エンフビルチド(enfurvirtide)、インスリン様成長因子(IGF)、神経成長因子(NGF)、IL-1、IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、IL-24、インターフェロンベータ-1a、インターフェロンベータ-1b、インターフェロンアルファ-2a、インターフェロンアルファ-2b、インターフェロンアルファ、またはインターフェロンガンマが含まれる。
本発明において、抗体であるポリペプチド類に対する言及には、天然のまたは部分的にもしくは全体的に合成的に生成された免疫グロブリンが含まれる。この用語は、抗原結合ドメインを含む任意のポリペプチドまたはタンパク質に及ぶ。抗原結合ドメインを含む抗体フラグメントには、Fab、scFv、Fv、dAb、Fdフラグメント、二重特異性抗体(diabody)、三重特異性抗体(triabody)またはナノ抗体(nanobody)が含まれる。モノクローナルおよび他の抗体を挙げることも可能であり、組み換えDNA技術の手法を使用して、他の抗体または元の抗体の特異性を保つキメラ分子を生成することも可能である。このような手法は、様々な免疫グロブリンの定常領域もしくはフレームワーク領域を加えた定常領域に対する抗体の、免疫グロブリンの可変領域、または相補性決定領域(CDR)をコード化するDNAを導入することを含んでもよい。例えば、EP0184187A、GB2188638AまたはEP0239400Aを参照されたい。抗体は、数多くの方法で修飾され得、この用語は任意の特定の結合部または必要とされる特異性を有する抗体抗原結合ドメインを有する物質に及ぶものとして解釈されるべきである。したがって、この用語は、天然のまたは全体的にもしくは部分的に合成的の、免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含む、抗体のフラグメントおよび誘導体に及ぶ。それゆえ、別のポリペプチドと縮合した、免疫グロブリン結合ドメインを含むキメラ分子または同等物が含まれる。キメラ抗体のクローニングおよび発現は、EP0120694AおよびEP0125023Aに記載されている。
全抗体のフラグメントは、結合抗原の機能を果たすことができることが示されている。結合フラグメントの例は、(i) VL、VH、CL、CH1ドメインからなるFabフラグメント; (ii) VHおよびCH1ドメインからなるFdフラグメント; (iii) 単一抗体のVLおよびVHドメインからなるFvフラグメント; (iv) VHドメインからなるdAbフラグメント(Ward, E.S.ら、Nature 341、544〜546(1989)); (v) 単離されたCDR領域; (vi) F(ab’)2フラグメント、2つの結合したFabフラグメントを含む二価のフラグメント; (vii) VHドメインとVLドメインが、2つのドメインが結合して抗原結合部位を形成できるペプチドリンカーによって結合された、一本鎖のFv分子(scFv)(Birdら、Science、242; 423〜426、1998; Hustonら、PNAS USA、85: 5879〜5883、1988); (viii) 二重特異性一本鎖Fv二量体(PCT/US92/09965)および(ix) 「二重特異性抗体」、遺伝子融合によって作られた多価のまたは多重特異性フラグメント(WO 94/13804; Holligerら、P.N.A.S. USA、90: 6444〜6448、1993)である。Fv、scFvまたは二重特異性抗体分子は、VHとVLドメインとを結合するジスルフィド架橋の組み込みによって安定化されてもよい(Reiterら、Nature Biotech、14: 1239〜1245、1996)。CH3ドメインに結合したscFvを含むミニ抗体(minibody)を作ってもよい(Huら、Cancer Res.、56: 3055〜3061、1996)。
(タンパク質を修飾または官能基化する方法)
本発明は、ポリペプチドに存在する、またはポリペプチド中に前もって導入されたチオール基、例えば1つ以上のシステイン残基を使用して、対象とするタンパク質を修飾するまたは官能基化するための便利な方法を提供する。好ましい実施形態において、本明細書において開示される方法は、タンパク質および他の生物学的物質を修飾するためによく適合した試薬および条件を用いる。特に、本方法において使用される反応条件は、広範囲の様々な特性を有する様々な生成物の混合物を生成しがちな、マレイミドなどの先行技術の試薬を使用する場合に起こりがちな問題を避けることを助ける。上記のとおり、対象とするポリペプチドは、既存のチオール基を使用して、または、この方法の初期工程においてチオール基を導入することによって、例えばポリペプチドの1つ以上の官能基を反応させてチオール基を生成することによって、またはチオール基もしくはその前駆体をポリペプチドに導入することによって修飾されてもよい。例として、これは、ポリペプチドを官能基化することが望まれる部位において、ポリペプチドにシステイン残基を導入する工程を含んでもよい。これは、本発明による反応のために便利なシステイン残基が、出発または野生型ポリペプチドにおいて存在しない状況において、有用である。都合よく、これは、その使用が当分野において十分に確立されている、ポリペプチドの部位特異的変異導入を使用して達成されてもよい。
本方法は、ポリ(アルキレングリコール)分子またはグリカン群によるポリペプチド類の官能基化における使用に、特に適している。本発明の方法および試薬の1つの好ましい使用は、対象とするポリペプチドを1つ以上のグリカン群でグリコシル化するためである。炭水化物基は、天然に存在する、または合成の単糖類、オリゴ糖類もしくは多糖類である。この方法は、対象とするタンパク質にグリコシル化を加えるか、または、例えば化学合成によって製造された場合、タンパク質が細菌細胞内で、または特にペプチド類のために製造されるという事実によって、グリコシル化が望まれているがタンパク質の製造過程において導入されていない場所にグリコシル化を導入するために使用することができる。
本発明を使用して所定の部位におけるグリコシル化を制御する能力は、その製造において、ならびに免疫原性および薬理学的特性(例えば半減期)の制御において、組み換えタンパク質(例えば治療用タンパク質および抗体)およびそのフラグメントを合成するための有用な手段を表す。現在、組み換えタンパク質治療の製造は高価かつ遅く、これは、哺乳類細胞株が、たいていタンパク質が確実にグリコシル化するための製造のために使用されるからである。本明細書において開示される方法は、発現が一般的により効率的であり、これによりグリコシル化を保ったままタンパク質の製造の速度および/または経済性を改善することを助ける、細菌細胞株における製造の後に、ポリペプチドにグリコシル化を加えるために使用されてもよい。代わりに、発現生成物をグリコシル化する細胞株において発現されたポリペプチド類のために、本発明を使用して修飾またはグリコシル化を加えてもよい。
好ましい実施形態において、用いられる炭水化物は、N-またはO-結合した糖タンパク質で一般的に示される、天然に存在する分岐したオリゴ糖類の化学的に修飾された誘導体、またはその分解生成物を含んでもよい。本発明において使用されてもよい炭水化物群は、当分野においてよく知られており、真核生物のタンパク質のN-またはO-結合したグリコシル化において見出される炭水化物群、および人工の炭水化物群が含まれ、例えばWO 03/025133およびWO 2004/083807に開示された、炭水化物群ならびにそれを製造および特定する方法を参照されたい。
N-結合したグリカン類は、シークオン(sequon)におけるアスパラギンのR基の窒素(N)に結合することが分かる。シークオンは、Asn-X-SerまたはAsn-X-Thr配列であり、ここでXはプロリンを除く任意のアミノ酸であり、N-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、ノイラミン酸、N-アセチルグルコサミン、フルクトース、マンノース、フコースおよび他の単糖類から構成されてもよい。
真核生物において、N-結合したグリカン類は、細胞質および小胞体において組み立てられたコアの14-糖類の単位から得られる。最初に、2つのN-アセチルグルコサミン残基が、小胞体膜の外側でドリコールリン酸、脂質に結合される。その後、5つのマンノース残基がこの構造に付加される。この時点で、部分的に完成したコアのグリカンが小胞体膜を越えて移動して、それは網状の内腔中に位置する。その後、組み立てが、4つのさらなるマンノース残基を付加して小胞体中で続く。最終的に、3つのグルコース残基がこの構造に付加される。完全な組み立てに続いて、グリカンは、網状の内腔中で、グリコシルトランスフェラーゼ、オリゴサッカリルトランスフェラーゼによって、全体で新生ペプチド鎖に移動される。したがって、N-結合したグリカン類のこのコア構造は、14の残基(3つのグルコース、9つのマンノース、および2つのN-アセチルグルコサミン)からなる。
真核生物において、O-結合したグリカン類は、ゴルジ装置内のペプチド鎖のセリンまたはトレオニン残基で、同時に1つの糖類に組み立てられる。N-結合したグリカン類とは異なり、まだ今のところ知られたコンセンサス配列は存在しない。しかしながら、セリンまたはトレオニンに対する-1または+3におけるプロリン残基の配置は、O-結合したグリコシル化に有利である。
O-結合したグリカン類の合成において結合した最初の単糖類は、N-アセチル-ガラクトサミンである。この後、いくつかの異なる経路が可能である。コア1の構造は、ガラクトースの付加によって作り出される。コア2の構造は、コア1の構造のN-アセチルガラクトサミンへのN-アセチル-グルコサミンの付加によって作り出される。コア3の構造は、元のN-アセチル-ガラクトサミンへの1つのN-アセチル-グルコサミンの付加によって作り出される。コア4の構造は、コア3の構造への第二のN-アセチル-グルコサミンの付加によって作り出される。他のコア構造も可能であるが、あまり一般的ではない。
O-結合したグリカン類の一般的な構造的テーマは、様々なコア構造へのポリラクトサミンの付加である。これらは、ガラクトースおよびN-アセチル-グルコサミン単位の繰返し付加によって形成される。O-結合したグリカン類のポリラクトサミン鎖は、たいていシアル酸残基(ノイラミン酸と類似)の付加によってキャップされる。フコース残基が最後から2番目の残基の隣に付加される場合、シアリル-ルイス-X(SLex)構造が形成される。
本発明の方法は、共役ワクチン、例えば1つ以上の抗原分子を担体タンパク質に結合し、これにより抗原分子の担体タンパク質の免疫学的特徴をもたらすことによって形成される共役ワクチンを作るために使用されてもよい。この方法は、比較的弱い抗原であるという傾向があるため、抗原分子がグリカン群(例えば抗原多糖)である場合にたいてい使用される。本明細書において開示される方法は、複数の抗原分子を、本発明の官能基化試薬の使用を通して、好ましくはタンパク質の担体の1つの位置で、担体タンパク質に結合させることができる。共役ワクチンの例には、Hib多糖類が、テタノスパスミン(tetanospasmin)、変異ジフテリアタンパク質(mutant diphtheria protein)または髄膜炎菌群B外膜タンパク質などのタンパク質の担体に結合された、ヘモフィルスインフルエンザ菌B型ワクチン(「Hibワクチン」); 1つ以上の髄膜炎菌性髄膜炎の血清型多糖類(例えばA、C、YまたはW-135)がタンパク質の担体に結合された、髄膜炎共役ワクチン; 多糖類が、ジフテリアタンパク質などの担体タンパク質と結合された肺炎球菌の様々な血清型(例えば1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F、および23F)からの細胞膜糖類である、肺炎球菌多糖類ワクチン(PPSV)が含まれる。上記のワクチンのいずれかのうちのタンパク質および多糖類の成分は、本発明の官能基化試薬を使用して結合されてもよい。
本明細書において開示された方法を用いて、治療用タンパク質の薬理学的特性を改変するために有用な他の部分を含むタンパク質を合成することもできる。1つの好ましい例は、ポリペプチド治療の半減期または他の薬理学的特性を強化するために使用されてもよい、ポリ(アルキレングリコール)分子、特にポリエチレングリコール(PEG)分子へのポリペプチド類の結合である。本方法は、タンパク質内に存在するチオール基の場所に依存して、選択的な方法で対象とするタンパク質をペグ化するための機会を提供する。ポリ(アルキレングリコール)分子は、ポリ(アルキレンオキシド)分子として、当分野においてほとんど同じ意味で表され、ポリエーテルである。ポリ(アルキレングリコール)分子は、直鎖、分岐状、櫛型、または星型の構造を有してもよく、一般的には非常に水溶性である。
さらに、基本的なポリ(アルキレングリコール)の構造は、1つ以上の反応性官能基、例えばヒドロキシ基、アミン基、カルボン酸基、アルキルハライド基またはチオール基と一緒に提供されて、ポリペプチド類などの他の種とのポリ(アルキレングリコール)分子の反応を促進してもよい。好ましいポリ(アルキレングリコール)分子には、1つ以上のヒドロキシル位において、1から4個の炭素原子を有するアルキル基などの化学基で置換されたものが含まれる。本発明による使用のための最も好ましいポリ(アルキレングリコール)分子は、ポリエチレングリコール(「PEG」)分子であるが、当業者は、他のポリ(アルキレングリコール)分子、例えばポリプロピレングリコールまたはポリエチレン-ポリプロピレングリコールコポリマーと併せて、本明細書に開示された手法を使用することができる。PEGを含むポリ(アルキレングリコール)分子は、典型的には、約400Daから約80kDaの間、より好ましくは約1kDaから約60kDaの間、より好ましくは約5kDaから約50kDaの間の分子量、例えば10kDa、20kDa、30kDaまたは40kDaの分子量を有する。本発明によって使用されてもよいポリ(アルキレングリコール)分子は、当分野においてよく知られており、例えばSigmaAldrichなどの商業的に利用可能な供給業者から、公然と利用可能である。
ペグ化は、治療用ポリペプチド類、例えばペプチド類、タンパク質および抗体の特性を改変させるための知られている戦略である。一般的に、ポリペプチド類に対するPEG分子の結合を使用して、その配座、静電特性または疎水特性を代え、その生物学的および薬理学的特性、例えば薬の溶解度の増加、投与頻度の減少、循環半減期の変化(特に増加)、薬の安定性の増加、およびタンパク質分解に対する耐性の増加における改善を導く。ペグ化は、1つ以上のPEGポリマー分子にポリペプチドを結合させることによる、治療用ポリペプチドの分子量の増加によって作用する。本発明の方法は、ポリペプチドへのPEG分子の導入の部位がチオール基の存在によって規定されるという利点を有する。
以下の実施例は、本発明を実行する方法の完全な開示および記載を当業者に提供するために記載され、本発明の範囲を限定することを意図しない。
(実験)
テトラキス-(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)(5mol%、62.3mg)を、DME(10mL)中の(6-クロロピリジン-3-イル)メチルアセテート(200mg)の溶液に加え、溶液を放置して室温で攪拌した(20分間)。その後、K2CO3(0.16g、1.1等量)、水(3mL)および2,4,6-トリビニルシクロトリボロキサン-ピリジン錯体(0.29g、1.1等量)を溶液に加え、得られた混合物を還流で加熱した(24時間)。その後、混合物を室温に冷却し、ジエチルエーテル(100mL)で抽出し、抽出物を水(30mL)で洗浄した。ジエチルエーテル抽出物をMgSO4上で乾燥し、その後ヘキサン(100mL)で希釈した。この溶液を、酸化アルミニウム(2g)を通して濾過し、溶離液を真空中で濃縮して黄色の油を得た。油をシリカゲルクロマトグラフィー(10→80% EtOAc/Petエーテル)によって精製して、無色の油として(6-ビニルピリジン-3-イル)メチルアセテートを得た(172mg、90%)。
1H NMR、400MHz(CDCl3): 9.16(d、1H、H-6、J=2.3Hz)、8.24(dd、1H、H-4、J=2.3および8Hz)、7.39(d、1H、H-3、J=8Hz)、6.85(dd、1H、H-A、J=11および17.6Hz)、6.33(dd、1H、H-C、J=1.2および17.6Hz)、5.61(1H、H-B、J=1.2および11Hz)、4.40(m、2H、-CH2)、1.40(m、3H、-OCH3)。
13C NMR、100MHz(CDCl3): 165.23、159.07、150.79、137.56、136.18、124.72、120.91、120.62、61.28、14.25。
ESI-HRMS C10H11NO2の予測値=177.0790。測定値M+H=178.0868。
テトラキス-(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)(0.40g、5mol%)を、DME(35mL)中のメチル6-クロロピリミジン-4-カルボキシレート(1.24g)の溶液に加え、溶液を放置して室温で攪拌した(20分間)。その後、K2CO3(1.11g、1.2等量)、水(10mL)および2,4,6-トリビニルシクロトリボロキサン-ピリジン錯体(1.93g、1.2等量)を溶液に加え、得られた混合物を還流で加熱した(24時間)。その後、混合物を室温に冷却し、ジエチルエーテル(200mL)で抽出し、抽出物を水(30mL)で洗浄した。ジエチルエーテル抽出物をMgSO4上で乾燥し、その後ヘキサン(200mL)で希釈した。この溶液を、酸化アルミニウム(6g)を通して濾過し、溶離液を真空中で濃縮して黄色の油を得た。その後、油をシリカゲルクロマトグラフィー(10→100% EtOAc/Petエーテル)、続けて逆相(C18)クロマトグラフィー(40% MeCN/水)にかけて、白色の固体としてメチル6-ビニルピリミジン-4-カルボキシレートを得た(0.40g、34%の収率)。
1H NMR、270MHz(CDCl3): 9.29(d、1H、H-2、J=1.1Hz)、7.99(d、1H、H-5、J=1.1Hz)、dd、1H、H-A、J=10.4および17.3Hz)、6.61(dd、1H、H-C、J=1.0および17.3Hz)、5.81(dd、1H、H-B、J=1.0および10.4Hz)、4.02(s、3H、-CH3)。
13C NMR、67.5MHz(CDCl3): 164.79(2C)、159.22(2C)、134.71、124.92、117.71、53.52。
ESI-MS 分子イオンC8H8N2O2の予測値=164.0586。測定値M+H=165.0664。
上のアリールハライド(130mg)を10mlのDME中に溶解し、テトラキス-(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)(10mol%、81.38mg)で処理した。溶液を放置して室温で20分間攪拌した。K2CO3(1.5等量、146mg)を、水(3ml)および2,4,6-トリビニルシクロトリボロキサン-ピリジン錯体(1.5等量、254.24mg)と一緒に加えた。反応物を24時間還流した。反応物を室温に冷却し、ジエチルエーテル(100ml)で希釈した。これを水(30ml)で洗浄した。ジエチルエーテルをMgSO4上で乾燥し、石油エーテル(100ml)で希釈した。この溶液を、短い酸化アルミニウムのカラムを通した。溶液を蒸発して乾燥し、粗生成物を、最初にシリカゲルクロマトグラフィー: 100%のPetエーテルから10%のMeOH/EtOAcで精製して、黄色の油として上のビニルピリジン化合物を得た(89mg、72%の収率)。
1H NMR、270MHz(CDCl3): 8.43(s、1H、H-6)、7.58(dd、1H、H-4、J=2.3および8Hz)、7.29(d、1H、H-3、J=8Hz)、6.78(dd、1H、H-A、J=10.7および17.4Hz)、6.15(dd、1H、H-C、J=1.1および17.4Hz)、6.06(br. s、1H、-NH)、5.46(dd、1H、H-B、J=1.1および10.7Hz)、4.37(d、2H、-CH2、J=5.8Hz)、2.00(s、3H、-CH3)。
13C NMR、67.5MHz(CDCl3): 170.16、155.21、148.96、136.54、136.34、121.12、118.45、41.02、23.29。
ESI-MS 分子イオンC10H12N2Oの予測値=176.0950。測定値M+H=177.1028。
100mgの上のアリールハライドを、5mlの脱気した無水トルエン中に溶解した。トリブチル(ビニル)スズ(1.5等量、0.25ml)およびテトラキス-(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)(5mol%、34mg)を加えた。反応物を窒素下で1時間還流した。反応物を放置して室温に冷却し、50mlのトルエンで希釈した。反応物を、セライトとKFパウダーの1:1の混合物を通して濾過した。濾過物を濃縮した。粗生成物を50mlのEtOAcで再懸濁し、(1) 水および(2) 飽和NaCl溶液で洗浄した。EtOAcをMgSO4上で乾燥し、濾過し、濃縮した。粗生成物を、シリカゲル/KF(10%w/w)クロマトグラフィー: 10%のEtOAc/Petエーテルから60%のEtOAc/Petエーテルで精製して、純粋な白色の結晶として上のビニルピリジン化合物を得た(31mg、33%の収率)。
1H NMR、270MHz(CDCl3): 8.56(d、1H、H-6、J=2Hz)、7.65(dd、1H、H-4、J=2および8Hz)、7.34(d、1H、H-3、J=8Hz)、6.81(dd、1H、H-A、J=11および17.3Hz)、6.20(dd、1H、H-C、J=1.4および17.3Hz)、5.50(dd、1H、H-B、J=1.4および11Hz)、5.10(s、2H、-CH2)、2.10(s、3H、-OCH3)。
13C NMR、67.5MHz(CDCl3): 167.9、149.62、136.77、136.56、130.30、120.96、118.83、63.70、21.00。
ESI-HR MS C10H11NO2の予測値=177.0790。測定値M+H=178.0859。
(4-ブロモピリジン-2-イル)メタノール(100mg、0.53mmol)を無水THF(10mL)中に溶解し、0℃に冷却した。塩化トシル(2等量、202.8mg、1.06mmol)および1M NaOH(0.7ml)を加え、反応物を急速に2時間攪拌し、室温に温めた。その後、反応物を濃縮し、100mlのジクロロメタン中に再懸濁した。これを水とブラインで抽出した。ジクロロメタンを硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、濃縮した。粗生成物を、シリカゲルクロマトグラフィー: 10%〜50%の酢酸エチル/石油エーテルで精製して、黄色の油を得た(171mg、94%)。
1H NMR、270MHz(CDCl3): 8.30(d、1H、J=5.5Hz)、7.81(app. d、2H)、7.53(dd、1H、J=0.5および1.9Hz)、7.35〜7.31(m、3H)、5.10(s、2H)、2.43(s、3H)。
13C NMR、67.5MHz(CDCl3): 155.4、150.0、145.4、133.9、130.1、128.2、126.8、125.2、70.9、21.8。
ESI-MS: C13H12Br1N1O3S1の予測値=340.9721および342.9701。測定値M+H=341.9790および343.9770。
(4-ブロモピリジン-2-イル)メチル4-メチルベンゼンスルホネート(170mg、0.50mmol)を無水DMF(10ml)中に溶解した。炭酸セシウム(2等量、325.7mg、1.00mmol)およびメチルチオグリコレート(5等量、2.50mmol、v=0.23ml)を加え、反応物を急速に窒素下で3時間室温で攪拌した。その後、反応物を濃縮し、ジクロロメタン中に再懸濁した。これを水とブラインで抽出した。ジクロロメタンを硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、濃縮した。粗生成物を、シリカゲルクロマトグラフィー: 10%〜50%の酢酸エチル/石油エーテルで精製して、黄色の油を得た(99.4mg、72%)。
1H NMR、270MHz(CDCl3): 8.35(d、1H、J=5.2Hz)、7.54(d、1H、J=2.0Hz)、7.34(dd、1H、J=1.9および5.2Hz)、3.90(s、2H)、3.70(s、3H)、3.22(s、2H)。
13C NMR、67.5MHz(CDCl3): 170.6、159.4、150.3、133.5、126.6、125.7、52.6、37.9、32.8。
ESI-MS: C9H10Br1N1O2S1の予測値=274.9616および276.9595。測定値M+H=275.9691および277.9667。
メチル2-((4-ブロモピリジン-2-イル)メチルチオ)アセテート(0.62g、2.25mmol)を、脱酸素した無水トルエンに溶解した。パラジウムテトラキス(10mol%、259.6mg、0.22mmol)およびトリブチル(ビニル)スズ(1.8等量、v=1.18ml)を加え、反応物を窒素下で2時間還流した。反応物を冷却し、その後シリカゲルクロマトグラフィー(10%w/wのフッ化カリウムを含む): 10%〜50%の酢酸エチル/石油エーテルで精製して、黄色の油を得た(416mg、83%)。
1H NMR、270MHz(CDCl3): 8.47(d、1H、J=5.3Hz)、7.31(s、1H)、7.15(dd、1H、J=1.6および5.3Hz)、6.63(dd、1H、J=10.7および17.6Hz)、5.96(d、1H、J=17.6Hz)、5.48(d、1H、J=10.7Hz)、3.92(s、2H)、3.69(s、3H)、3.21(s、2H)。
ESI-MS: C11H13N1O2S1の予測値=223.0667。測定値M+H=224.0720。
化合物1(59mg、0.32mmol)、トリブチル(ビニル)スズ(0.187mL、0.64mmol)およびパラジウムテトラキス(37mg、0.032mmol)の無水トルエン中の攪拌溶液を、室温におけるアルゴン下で脱酸素化した。その後、混合物をアルゴン下で2時間還流した後、室温に冷却した。混合物をセライトを通して濾過し、真空中で濃縮した後、フラッシュクロマトグラフィー(50%w/w EtOAc/Petエーテルから100%EtOAc)を介した精製により、透明な油として37mgの生成物を得た(85%の収率)。
1H NMR、270MHz(CDCl3): 8.46(d、1H、J=4.5Hz)、7.19(dd、2H、J=4.5および16.6Hz)、6.65(dd、1H、J=10.7および17.6Hz)、5.96(d、1H、J=17.6Hz)、5.48(d、1H、J=10.7Hz)、4.74(s、2H)。
ESI-MS: C8H9O1N1の予測値=135.0684。測定値M+H=136.0760。
20mgのグルタチオン(還元形態)を2mlの水中に溶解した。2-ビニルピリジン(1.2等量、6.3μl)を加えた。反応物を1分間超音波処理し、その後放置して室温で2時間攪拌した。濁った溶液が、最終的には透明になった。反応物を濃縮して乾燥し、MeOH(10ml)中で再懸濁し、シリカゲルに乾燥充填した。これを精製のためにシリカゲルカラムにかけ; 100% EtOAcから50%(10% NH3/MeOH)/EtOAc、白色のパウダーとして生成物を得た(23mg、86%の収率)。
1H NMR、400MHz(D2O): 8.29(dd、1H、H-18、J=0.8および5.1Hz)、7.66(ddd、H-20、J=2.0、7.8および15.7Hz)、7.23(d、1H、H-21、J=7.8Hz)、7.18(ddd、1H、H-19、J=0.8、5.1および7.8Hz)、4.37(dd、1H、H-7、J=4.7および9.0Hz)、3.60(m、3H、H-2およびH-10)、2.87(m、5-H、H-12A、H-14AおよびH-14B、H-15AおよびH-15B)、2.65(dd、1H、H-12B、J=9.0および14.1Hz)、2.34(m、2H、H-4AおよびH-B)、1.92(m、2H、H-3AおよびH-3B)。
13C NMR、100MHz(D2O): 176.29、174.96、174.20、172.01、159.09、148.36、138.23、124.26、122.48、54.21、53.10、43.43、36.57、32.98、31.50、31.48、26.40。
ESI-MS 分子イオンC17H24N4O6Sの予測値=412.1417。測定値M+H=413.1447。
20mgのグルタチオン(還元形態)を2mlの水中に溶解した。2-ビニルピリジン(1.2等量、6.3μl)を加えた。反応物を1分間超音波処理し、その後放置して室温で2時間攪拌した。濁った溶液が、最終的には透明になった。反応物を濃縮して乾燥し、MeOH(10ml)中で再懸濁し、シリカゲルに乾燥充填した。これを精製のためにシリカゲルカラムにかけ; 100% EtOAcから50%(10% NH3/MeOH)/EtOAc、白色のパウダーとして生成物を得た(21mg、78%の収率)。
1H NMR、400MHz(D2O): 7.65(dd、2H、H-18およびH-20、J=1.6および5.1Hz)、6.63(d、2H、H-17およびH-21、J=6.3Hz)、3.74(dd、1H、H-7、J=4.7および9.0Hz)、2.94(m、3H、H-2、H-10AおよびH-10B)、2.29〜2.01(m、6H、H-12A、H-12B、H-14AおよびH-14B、H-15AおよびH-15B)、1.69(t、2H、H-4AおよびH-4B)、1.32(q、2H、H-3AおよびH-3B)。
13C NMR、100MHz(D2O): 175.67、174.35、173.44、171.39、152.15、146.75、124.62、53.56、52.47、42.81、33.69、32.35、30.88、25.70。
ESI-MS 分子イオンC17H24N4O6Sの予測値=412.1417。測定値M+H=413.1495。
結果: 他に記載されていない限り、全ての反応をpH7.5におけるTRISベースのバッファー中で行った。
エチルエステル(43.2mg)を、還元されたグルタチオン(15mg)およびTCEP(10mM)の脱酸素化した水(2ml)中の溶液に加えた。反応物を放置してN2下で48時間攪拌した。反応物を濃縮し、シリカに乾燥充填し、シリカゲルカラムにかけた。生成物を1:4(10% NH3/MeOH)/EtOAcで精製した(16mg、68%の収率)。
1H NMR、400MHz(D2O): 9.00(d、1H、H-18、J=2.0Hz)、8.45(dd、1H、H-20、J=2.0および8.2Hz)、7.60(d、1H、H-21、J=8.2Hz)、4.43(dd、1H、H-7、J=5.1および8.6Hz)、4.35(q、2H、H-24A、H-24B、J=7.0Hz)、3.78(s、2H、H-10)、3.67(app. t、1H、H-2、J=6.7Hz)、3.16(m、2H、H-15AおよびH-15B)、2.93(m、3H、H-12A、H-14AおよびH-14B)、2.75(dd、1H、H-12B、J=8.6および13.6Hz)、2.40(app. t、2H、H-4)、2.03(m、2H、H-3)、1.30(t、3H、H-25、J=7.0Hz)。
13C NMR、100MHz(D2O): 174.76、174.41、173.74、172.28、165.94、162.25、147.21、141.02、125.74、125.22、62.88、53.91、52.95、42.13、35.57、32.77、31.24、30.66、26.05、13.28。
ESI-MS 分子イオンC20H28N4O8Sの予測値=484.1628。測定値M+H=483.2047。
グルコースペンタ-アセテート(1g)を無水CH2Cl2(10ml)中に溶解した。HBr[(酢酸中の33%)、5ml]をゆっくりと加えた。反応物をCaCl2の乾燥チューブに取り付け、放置して室温で3時間攪拌した。反応をTLCでモニターした。一度完了すると、反応物を100mlの冷たいCH2Cl2で希釈し、冷たい、1) 水(100ml)、2) 飽和NaHCO3溶液、および3) 飽和NaCl溶液で洗浄した。有機層をMgSO4上で乾燥し、濾過し、濃縮して、定量的収率で白色の発泡体として純粋な生成物が残った。α-ブロミド(100mg)を無水CH2Cl2(5ml)中に溶解し、N2ガス下で保った。これに、2-ビニル-5-ヒドロキシメチルピリジン(49.2mg、1.5等量)、AgOTf(93.5mg、1.5等量)、および4Åモレキュラーシーブを加えた。反応物を放置して、終夜窒素下で暗所で攪拌した。反応物を100mlのCH2Cl2で希釈し、セライトを通して濾過し、その後、1) 飽和NaHCO3溶液、および2) 飽和NaCl溶液で洗浄した。有機層をMgSO4上で乾燥し、濾過し、濃縮した。粗物質をシリカゲルクロマトグラフィー(10% EtOAc/Petエーテルから100% EtOAc)で精製して、オルトエステルを得た(82mg、73%)。オルトエステル(73mg)を5mlの無水CH2Cl2中に溶解し、N2ガス下に保ちながら-20℃に冷却した。TMSOTf(5.7μl、0.2等量)をゆっくりと加え、反応物をTLC分析で1時間にわたって注意深くモニターした。完了すると、反応を2滴のEt3Nを加えることによって停止した。反応物を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、複合糖質を得た(23mg、32%の収率)。
ESI-MS: 分子イオンC22H27NO10の予測値=465.1635。測定値M+H=466.1718。
アセチル化複合糖質(20mg)を、N2ガス下で4mlの無水メタノールに加えた。ナトリウム金属の新鮮な削りくずを加え、反応物を放置して室温で1時間攪拌した。完了はTLC分析で確認した。反応物をAmberlite IR 120+を加えることによって中性化し、続けて濾過および濃縮した。粗生成物をシリカゲルに乾燥充填し、シリカゲルクロマトグラフィー(10% MeOH/EtOAc)で精製して、透明な固体を得た(7mg、55%の収率)。
ESI-MS: 分子イオンC14H19NO6の予測値=297.1212。測定値M+H=298.1277。
複合糖質(2mg)を、10mMのTCEPを含む180μlの脱酸素した水に溶解した。グルタチオン(還元形態、3.1mg、1.2等量)を加え、反応物を放置して室温で終夜攪拌した。質量分析により、生成物の存在を確認した。
ESI-MS: 分子イオンC24H36N4O12Sの予測値=604.2050。測定値M-H=603.1955。
この実施例は、本発明の化合物および方法を用いて、ポリペプチドをグリカン群に共有結合することを確認する。また、この実施例は、反応がグルタチオン内に存在するチオール基に特異的であり、アミンおよびカルボン酸などの他の官能基で副反応が起きないことを示す。
上のアリールハライド(0.5g)を12mlのDME中に溶解し、テトラキス-(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)(10mol%、0.41g)で処理した。溶液を放置して室温で20分間攪拌した。K2CO3(1.5等量、0.73g)を、水(3ml)および2,4,6-トリビニルシクロトリボロキサン-ピリジン錯体(1.5等量、1.27g)と一緒に加えた。反応物を24時間還流した。反応物を室温に冷却し、その後セライトを通して濾過した。反応混合物を濃縮し、その後200mlのEtOAc中で再懸濁した。これを水で洗浄した(2×100ml)。水の洗浄をためて、5mlまで濃縮した。濃縮物をC-18逆相カラムにかけ、1/10のMeOH/H2Oで溶出した。関連画分をため、凍結乾燥して、白色の固体として生成物を得た(188mg、40%の収率)。
ESI-MS: 分子イオンC8H10N2の予測値=134.0844。測定値M+H=135.0922。
mPEG-5K-COOH(100mg)を無水トルエンと共蒸発(co-evaporate)し(3×25ml)、その後高真空ポンプで2時間乾燥した。続けて、PEGを、不活性条件下で5mlの無水DMF中に溶解した。芳香族アミン(13.4mg、5等量)、PyBOP(52.1mg、5等量)およびDIPEA(0.05ml)を加えた。反応物を放置して、N2ガス下で30℃で終夜攪拌した。その後、反応物を濃縮し、トルエンと共蒸発した(4×25ml)。粗物質を温かいエタノール中に懸濁し、その後-20℃の冷凍庫内に1時間放置し、これはPEG-結合体の沈殿をもたらした。混合物を濾過し、冷たいエタノールで洗浄した。白色のろう状の生成物(31mg)を放置して、高真空ポンプで2時間乾燥した。
mPEG-2K-NH2(100mg)を無水トルエンと共蒸発し(3×25ml)、その後高真空ポンプで2時間乾燥した。続けて、PEGを、不活性条件下で5mlの無水DMF中に溶解した。芳香族アミン(37.3mg、5等量)、PyBOP(130.1mg、5等量)およびDIPEA(0.05ml)を加えた。反応物を放置して、N2ガス下で30℃で終夜攪拌した。その後、反応物を濃縮し、トルエンと共蒸発した(4×25ml)。粗物質をCH2Cl2中に懸濁し、シリカゲルクロマトグラフィー(100% CH2Cl2から15% MeOH/CH2Cl2)で精製した。関連画分をため、濃縮して、透明な固体として生成物を得た(52mg)。
これらの実施例は、本発明の化合物および方法を用いて、特異的な方法でポリペプチドをPEG分子に共有結合することを確認する。
(広い範囲のリンカーの、グルタチオンとの反応の相対速度)
200μlの重水素化されたDMSO中のビニルピリジンまたはビニルピリミジン(1.2等量)の溶液を、NMRチューブ中にpH7.0で、D2O(800μl)中の還元されたグルタチオン(6〜10mg)の溶液に加えた。一度混合されると、チューブを素早くNMR分光計に移動した。ロックおよびシムを再調整した(1〜2分)。スペクトルを、Varian Mercury(400MHz) Spectrometerで、データ点ごとに指定された反応時間(16〜32)のスキャンを連続的に取得した。相対反応速度を、経時で、ビニルのプロトン(δ 6.6〜6.9ppm)からの信号の強度の損失を測定することによって決定した。
(マレイミド-PEGに対するビニルピリジン-PEG誘導体を有するヒト組み換えIFN-ベータの標識)
反応を行って、本発明によるPEG-ピリジン結合体およびPEGと先行技術の架橋剤のマレイミドを使用するポリペプチドインターフェロンベータの標識を比較した。組み換えインターフェロンベータ(C17S、D80N)は、PEG-ピリジンまたはPEGマレイミドと反応した。ヒトインターフェロンベータ-1、繊維芽細胞(Origene Technologies)は、部位特異的変異誘発(Stragene Quickchange)によって、C17Sで変異して内因性遊離システインを除去し、D80Cで変異して内因性グリコシル化部位を置換した。組み換えインターフェロンベータは、0.1mMのTECPで12時間還元され、続けてpH7.5、37℃において図で特定された時点で、PEG/ピリジンまたはPEG/マレイミドと反応した。タンパク質を、SDS-PAGEを使用して分解し、ニトロセルロース膜に移動した。膜を、未反応かつペグ化されたIFNbのための抗インターフェロンb抗体で調べた。第二の抗体反応を、ECL検出システム(Amershan、GE Healthcare)を使用して検出した。
両方の場合において、PEG分子は5kDの分子量を有した。結果を図2に示し、本発明の結合体の使用が、反応時間にわたって増加する、約20kDから25kDまで増加する分子量を有するインターフェロンベータに、平均で1つのPEG-結合体を結合することを示した。対照的に、マレイミドとの反応は、あまり特異的ではなく、インターフェロンベータへの複数のPEG分子の結合を導いた。
(ビニルピリジン-5k-PEGを有するBSAの標識の速度へのpHの影響)
5kDのPEG/ピリジンで官能基化されたウシ血清アルブミン(Sigma)のpH依存性を調べた。BSAを、4℃で12時間1mMのDTTで還元し、続けて室温で所定の時間、5kDのPEG/ピリジンと反応させた。タンパク質をSDS-PAGEで分解し、可視化のためにクマシーブルー(Commassie blue)で染色した。
図3における結果がpH5.5および7.5で得られ、結合反応は両方のpHで進行するが、pH7.5においてより速いことを示す。これは、タンパク質生化学と関連する生理学的なpHの範囲を含む、広い範囲のpHにわたって反応を使用することができる、他の実験においても確認された。また、結果は、pHを使用して結合反応の速度を制御し得ることを示す。
(組み替えIFNベータ(C17S、N80C)との5kDのPEG/ピリジンの反応の温度依存性)
IFNベータ変異体を、pH7において、所定の温度で5mMの5kDaのPEGビニルピリジン試薬で処理した。一定分量を所定の時間に採取し、DTTを加えることによって反応を停止した。タンパク質を、SDS-PAGEを使用して分解し、ニトロセルロース膜へ移動した。膜を、未反応かつペグ化されたIFN-ベータのための抗インターフェロンベータ抗体で調べた。第二の抗体反応を、ECL検出システム(Amershan、GE Healthcare)を使用して検出した。結果を図4に示す。
(タンパク質の官能基化反応)
反応条件
タンパク質を、脱酸素した反応バッファー(NaC2H3O、20mM、pH5.5)で希釈し(5mg/ml)、窒素下で3時間、トリス-(カルボキシエチル)-ホスフィン塩酸塩(TCEP、5mM)またはβ-メルカプトエチルアミン(BMEA、5mM)のどちらかで還元した。過剰量の還元剤を、3回の限外濾過(Milipore centricons 10kDa cut-off)または2回の透析(酢酸セルロース膜、6〜8kDa cut-off)のどちらかによって、続けて除去した。反応バッファー中のPEGの10倍の溶液を調製し、タンパク質溶液に加えて、所望のPEGの1.5から5モル等量を加えたタンパク質(1mg/ml)を含む反応混合物を得た。混合物を、終夜密閉されたチューブ中で培養した(37℃)。
FPLC
反応混合物を、10mMのNaC2H3O、pH4.5で5から10倍に希釈した。サンプルを、結合バッファー(10mMのNaC2H3O、pH4.5)の3つのカラム体積であらかじめ平衡化されたSP-セファロースカチオン交換カラムにかけた。洗浄して結合されていない画分(結合バッファーの3つのカラム体積)を除去した後、タンパク質を、直線的な塩の勾配(50〜200mMのNaCl、10mMのNaC2H3O、pH4.5)で希釈し、1.5mLの画分を収集した。タンパク質を含む画分を、ゲル電気泳動で分析した。
SDS PAGE分析
タンパク質のPEG化の程度を、ゲル電気泳動で評価した。典型的には、タンパク質のサンプル(1〜10μg)を、1mMのジチオトレイトール(DTT)を含むローディングダイ(loading dye)で希釈し、NUPAGE BisTrisの4〜12%ゲル(Invitrogen)にかける前に3分間沸騰して修飾した。クマシー染色を使用して、タンパク質(青色)を検出し、Dragendorff(ヨードビスムタート)でポリエチレングリコール(オレンジ-茶色)を可視化した。
(PermaLinkによるモデルタンパク質の官能基化)
モデルタンパク質、Bacillus circulans xylanase(S22C)変異体(BcxS22C)を選択して、ポリペプチドを、Permalink官能基化試薬を使用して、本発明によってグリカンまたはPEG分子で官能基化する方法を例示した。実験の詳細を図5に示し、これは以下を示す: (A) PL-LK-07の構造、(B) 脱酸素した酢酸ナトリウムバッファー(20mM、pH5.5)中のBcxS22C(5mg/ml)の溶液を、3時間トリス-(カルボキシエチル)-ホスフィン塩酸塩(TCEP、5mM)で還元した。過剰量の還元剤を、3回の限外濾過(Milipore centricons 10kDa cut-off)によって、続けて除去した。PEG(1.5等量)をタンパク質溶液(1mg/ml)に加え、終夜培養した(37℃)。PEG化されたタンパク質を、セファロースSPカチオン交換カラムを使用して、液体クロマトグラフィーを介して反応混合物から回収した。サンプルを5倍に希釈し、結合バッファー(10mMの酢酸ナトリウム、pH4.5)中であらかじめ平衡化されたカラムにかけた。生成物を、直線的な塩の勾配(結合バインダー中の50〜200mMのNaCl)で溶出し、1.5mlの画分を収集した。(C) 280nmにおけるUV吸収によって表現されたタンパク質を含む画分を、SDS PAGEで分析した。これは、ビニルピリジン化合物が、タンパク質のシステイン残基へのポリエチレングリコール(PEG)の結合のための有効な試薬であることを示し、このような反応の生成物を、高純度で得ることができることを示す。
(システイン残基のチオール基のための官能基化試薬の特異性)
マレイミドベースのリンカーケミストリー(linker chamistry)の欠点の1つとして、反応特異性の欠如があり、本発明の官能基化試薬を、システイン残基へのその特異性を定めるために試験し、結果を図6に報告する。システイン残基へのリンカーの特異性を評価するために、システインが存在しない野生型Bcxのサンプルを使用した。このタンパク質は、最初に酢酸ナトリウムバッファー(20mM、pH5.5)中のトリス-(カルボキシエチル)-ホスフィン塩酸塩(TCEP、5mM)で3時間還元された。この後、全ての残った還元剤を、3回の限外濾過(Milipore centricons 10kDa cut-off)によって除去した。得られた濃縮されたタンパク質溶液を、関連するバッファー(50mM、シトレートバッファー pH3、アセテートバッファー pH6、トリスバッファー pH9)中で1.2mg/mlに希釈した。PEG(5等量)の溶液をタンパク質に加えて、1mg/mlの最終タンパク質濃度を得た。反応物を終夜培養した(16時間、37℃)。PEG化された生成物の量を、4〜12%のSDS PAGEに反応物サンプルをかけることで計算した。これは、ビニルピリジン試薬が、マレイミド試薬と比較して、他のアミノ酸を超えてシステイン残基のスルフヒドリル基へのより大きな特異性を示すことを示す。
情報開示陳述書の部分として届け出た参照を含む、本明細書において引用した、または本出願と一緒に出願された全ての文献、登録特許および特許出願を、その全体において、参照により援用する。

Claims (20)

  1. 少なくとも1つの反応性チオール基を有するポリペプチドを修飾する方法であって、前記方法は、ポリペプチドの少なくとも1つのチオール基と反応することができるビニル置換基を有する、窒素を含む複素環式芳香環を含む官能基化試薬と、ポリペプチドとを接触させる工程を含み、前記官能基化試薬は、グリカン群と共有結合しており、前記官能基化試薬のビニル置換基がポリペプチドのチオール基と反応し、これによりグリカン群をポリペプチドに共有結合させる方法であって、
    前記のビニル基を有する、窒素を含む複素環式芳香環を含む官能基化試薬が、一般式:
    (ここで、
    少なくともR1、又はR1及びR2は、グリカン群が共有結合されており、
    さらに、R1及びR2は、独立に、
    -(CH2)n-Z-(CH2)o-C(O)-R(ここで、ZはO、SまたはNHであり、nは0から10であり、oは0から10であり、Rは水素、ポリ(アルキレングリコール)分子またはグリカン群である); あるいは
    -(CH2)n-Z-(CH2)o-R(ここで、ZはO、SまたはNHであり、nは0から10であり、oは0から10であり、Rは水素、ポリ(アルキレングリコール)分子またはグリカン群である); あるいは
    -C(O)-Z-(CH2)o-R(ここで、ZはO、SまたはNHであり、oは0から10であり、Rは水素、ポリ(アルキレングリコール)分子またはグリカン群である); あるいは
    -(CH2)n-Z-C(O)-(CH2)o-R(ここで、ZはO、SまたはNHであり、nは0から10であり、oは0から10であり、Rは水素、ポリ(アルキレングリコール)分子またはグリカン群である);あるいは
    -Y-(CH2)n-Z-C(O)-(CH2)o-R(ここで、Yはアリール基、O、SまたはNHであり、ZはOまたはNHであり、nは0から10であり、oは0から10であり、Rは水素、ポリ(アルキレングリコール)分子またはグリカン群である); あるいは
    -Y-R(ここで、YはOまたはSであり、Rは水素、グリカン群、ポリ(アルキレングリコール)分子、アリールまたはC1〜10アルキルである);
    から選択され、
    ただし、R2がポリ(アルキレングリコール)分子またはグリカン群に結合されていない場合、R 2 は、水素または電子吸引性基、アルキルまたはフェニルからさらに選択される。）
    又は一般式：
    (ここで、
    少なくともR1、又はR1及びR2は、グリカン群が共有結合されており、
    さらに、R1及びR2は、独立に、
    -(CH2)n-Z-(CH2)o-C(O)-R(ここで、ZはSまたはNHであり、nは0から10であり、oは0から10であり、Rは水素、ポリ(アルキレングリコール)分子またはグリカン群である); あるいは
    -(CH2)n-Z-(CH2)o-R(ここで、ZはSまたはNHであり、nは0から10であり、oは0から10であり、Rは水素、ポリ(アルキレングリコール)分子またはグリカン群である); あるいは
    -C(O)-Z-(CH2)o-R(ここで、ZはSまたはNHであり、oは0から10であり、Rは水素、ポリ(アルキレングリコール)分子またはグリカン群である); あるいは
    -(CH2)n-Z-C(O)-(CH2)o-R(ここで、ZはSまたはNHであり、nは0から10であり、oは0から10であり、Rは水素、ポリ(アルキレングリコール)分子またはグリカン群である);あるいは
    -Y-(CH2)n-Z-C(O)-(CH2)o-R(ここで、Yはアリール基、SまたはNHであり、ZはOまたはNHであり、nは0から10であり、oは0から10であり、Rは水素、ポリ(アルキレングリコール)分子またはグリカン群である); あるいは
    -Y-R(ここで、YはSであり、Rは水素、グリカン群、ポリ(アルキレングリコール)分子、アリールまたはC1〜10アルキルである);
    から選択され、
    ただし、R2がポリ(アルキレングリコール)分子またはグリカン群に結合されていない場合、R 2 は、水素または電子吸引性基、アルキルまたはフェニルからさらに選択される。）
    で表される、方法。
  2. (a) ビニル置換基を有する、窒素を含む複素環式芳香環を含む前駆体官能基化試薬を、前記グリカン群と反応させて、前記官能基化試薬を生成する初期工程; および/または
    (b) 前記ポリペプチド内の反応性チオール基の位置を決める工程、およびそのうちのいくつかを保護するか又はいずれも保護しないでおく工程; および/または
    (c) 化学反応によって、または部位特異的変異導入によって、元のポリペプチドを修飾して、前記ポリペプチドの1つ以上の所望の位置にチオール基を含むバリアントポリペプチドを生成する初期工程
    をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記チオール基がシステイン残基に存在する、請求項１または２に記載の方法。
  4. (a) R1またはR2のうちの1つがグリカン群を含む、あるいは、R1またはR2のうちの1つがグリカン群を含み且つR1とR2のうちのもう1つがポリ(アルキレングリコール)分子を含む、あるいは、R1とR2の両方がグリカン群を含む; および/または
    (b) 前記窒素を含む複素環式芳香環への前記ポリ(アルキレングリコール)分子および/または前記グリカン群の結合のための前記R1および/またはR2基が、独立に、-(CH2)n-Z-(CH2)o-Rまたは-C(O)-Z-(CH2)o-Rから選択される; または
    (c) 前記R1およびR2基において、oが0であり、前記基が-(CH2)n-Z-Rまたは-C(O)-Z-Rとして表される、請求項１に記載の方法。
  5. 前記電子吸引性基が、ハロゲン(F、Cl、もしくはBr)、-NO2、-CO2H、-CO2R4、COR4、-CHO、-CN、-CF3、及び-SO2NR4R5（R 4 およびR 5 は、独立に、水素またはC 1〜10 アルキルから選択される）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  6. 前記グリカン群が、ポリペプチドをグリコシル化するための炭水化物基である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記グリカン群が、ポリペプチドをグリコシル化するための炭水化物基であり、かつ前記炭水化物基が、天然に存在する、または合成の単糖類、オリゴ糖類もしくは多糖類である、請求項６に記載の方法。
  8. 前記グリカン群が、N-結合したまたはO-結合した糖類である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記ポリ(アルキレングリコール)分子が、1kDaから50kDaの間の分子量を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  10. グリカン群、又はポリ(アルキレングリコール)分子及びグリカン群が前記ポリペプチドに結合して、ポリペプチドの薬理学的特性を改変させる、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記ポリペプチドの前記薬理学的特性が、前記ポリペプチドの、安定性、生物学的半減期、水溶性および/または免疫学的特徴である、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記ポリペプチドが、エリスロポエチン、インターフェロン、インターロイキン、ケモカイン、リンホカイン、サイトカイン、インスリン、モノクローナル抗体またはそのフラグメント、組み換え抗体またはそのフラグメント、血液凝固因子、コロニー刺激因子、成長ホルモン、プラスミノゲン活性化因子、ウイルス由来ペプチド、生殖ホルモン、治療用酵素または共役ワクチンのための担体タンパク質である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記ポリペプチドが共役ワクチンのための担体タンバク質であり、１つ以上の前記グリカン群が抗原多糖類である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法によって共役ワクチンを製造する方法。
  14. 以下の一般式:
    (ここで、
    少なくともR1、又はR1及びR2は、グリカン群が共有結合されており、
    さらに、R1及びR2は、独立に、
    -(CH2)n-Z-(CH2)o-C(O)-R(ここで、ZはO、SまたはNHであり、nは0から10であり、oは0から10であり、Rは水素、ポリ(アルキレングリコール)分子またはグリカン群である); あるいは
    -(CH2)n-Z-(CH2)o-R(ここで、ZはO、SまたはNHであり、nは0から10であり、oは0から10であり、Rは水素、ポリ(アルキレングリコール)分子またはグリカン群である); あるいは
    -C(O)-Z-(CH2)o-R(ここで、ZはO、SまたはNHであり、oは0から10であり、Rは水素、ポリ(アルキレングリコール)分子またはグリカン群である); あるいは
    -(CH2)n-Z-C(O)-(CH2)o-R(ここで、ZはO、SまたはNHであり、nは0から10であり、oは0から10であり、Rは水素、ポリ(アルキレングリコール)分子またはグリカン群である);あるいは
    -Y-(CH2)n-Z-C(O)-(CH2)o-R(ここで、Yはアリール基、O、SまたはNHであり、ZはOまたはNHであり、nは0から10であり、oは0から10であり、Rは水素、ポリ(アルキレングリコール)分子またはグリカン群である); あるいは
    -Y-R(ここで、YはOまたはSであり、Rは水素、グリカン群、ポリ(アルキレングリコール)分子、アリールまたはC1〜10アルキルである);
    から選択され、
    ただし、R2がポリ(アルキレングリコール)分子またはグリカン群に結合されていない場合、それは、水素または電子吸引性基、アルキルまたはフェニルからさらに選択される。）
    又は一般式：
    (ここで、
    少なくともR1、又はR1及びR2は、グリカン群が共有結合されており、
    さらに、R1及びR2は、独立に、
    -(CH2)n-Z-(CH2)o-C(O)-R(ここで、ZはSまたはNHであり、nは0から10であり、oは0から10であり、Rは水素、ポリ(アルキレングリコール)分子またはグリカン群である); あるいは
    -(CH2)n-Z-(CH2)o-R(ここで、ZはSまたはNHであり、nは0から10であり、oは0から10であり、Rは水素、ポリ(アルキレングリコール)分子またはグリカン群である); あるいは
    -C(O)-Z-(CH2)o-R(ここで、ZはSまたはNHであり、oは0から10であり、Rは水素、ポリ(アルキレングリコール)分子またはグリカン群である); あるいは
    -(CH2)n-Z-C(O)-(CH2)o-R(ここで、ZはSまたはNHであり、nは0から10であり、oは0から10であり、Rは水素、ポリ(アルキレングリコール)分子またはグリカン群である);あるいは
    -Y-(CH2)n-Z-C(O)-(CH2)o-R(ここで、Yはアリール基、SまたはNHであり、ZはOまたはNHであり、nは0から10であり、oは0から10であり、Rは水素、ポリ(アルキレングリコール)分子またはグリカン群である); あるいは
    -Y-R(ここで、YはSであり、Rは水素、グリカン群、ポリ(アルキレングリコール)分子、アリールまたはC1〜10アルキルである);
    から選択され、
    ただし、R2がポリ(アルキレングリコール)分子またはグリカン群に結合されていない場合、R 2 は、水素または電子吸引性基、アルキルまたはフェニルからさらに選択される。）
    のうちの1つで表される、グリカン群でポリペプチドを官能基化するための化合物。
  15. 前記電子吸引性基が、ハロゲン(F、Cl、もしくはBr)、-NO2、-CO2H、-CO2R4、COR4、-CHO、-CN、-CF3、及び-SO2NR4R5 （R 4 およびR 5 は、独立に、水素またはC 1〜10 アルキルから選択される）からなる群から選択される、請求項１４に記載の化合物。
  16. 請求項１４又は１５に記載の化合物と、ポリペプチドの1つ以上のチオール基との反応によって形成された結合体。
  17. 医療処置の方法における使用のための、請求項１４又は１５に記載の化合物と、ポリペプチドの1つ以上のチオール基との反応によって形成された結合体。
  18. 前記処置が治療または診断である、請求項１７に記載の処置の方法における使用のための結合体。
  19. 前記結合体が共役ワクチンである、請求項１７に記載の処置の方法における使用のための結合体。
  20. 医療処置の方法に使用するための、請求項１４又は１５に記載の化合物と、ポリペプチドの1つ以上のチオール基との反応によって形成された結合体であって、前記化合物のグリカン群が抗原多糖類であり、前記ポリペプチドが担体タンパク質であり、形成された結合体が共役ワクチンである、結合体。
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