CN104547403B - 一种祛黄褐斑的组合物、其制备方法、其应用及祛黄褐斑的保健品 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种祛黄褐斑的组合物及其制备方法，该组合物由以下重量份的原料制得：丹参2～5重量份、当归2～5重量份、香附1～5重量份、木贼1～5重量份和葡萄籽提取物0.01～1重量份。本发明提供的组合物包括丹参、当归、香附、木贼和葡萄籽提取物，各组分缺一不可，它们互相配伍，能够有效地降低酪氨酸酶的活性、对黑色素瘤细胞的增殖及黑色素的合成有一定的抑制作用，使得该保健品组合物的祛黄褐斑效果显著。本发明提供了一种祛黄褐斑的保健品，由上述组合物和药学上可接受的辅料制成。本发明还提供了一种组合物在制备祛黄褐斑的保健品中的应用。

Description

一种祛黄褐斑的组合物、其制备方法、其应用及祛黄褐斑的保 健品

技术领域

本发明属于祛斑技术领域，尤其涉及一种祛黄褐斑的组合物、其制备方法、其应用及祛黄褐斑的保健品。

背景技术

黄褐斑属中医黧黑斑，是一种颜面部出现局限性淡褐色或褐色色素沉着的皮肤病，皮损为黄褐色或深褐色斑片，常对称分布于面颧部颊部，呈蝴形，或累及前额鼻口周和颏部呈不规则形状，好发于中青年女性。

中医学认为黄褐斑实质上五脏六腑功能紊乱，气血不和，肝郁气滞，气滞血瘀、气血津液流通不畅及内分泌失调在面部的反映，此类疾病与机体的整体功能状态密切相关；以疏肝理气、养血活血、益肾健脾、清热消斑为治则。黄褐斑的发生与内分泌紊乱有关，且有研究证明雌激素可刺激黑色素细胞分泌黑色素颗粒，孕激素能促进黑色素体的转运和增加黑色素量，最终导致色素沉着。黄褐斑的病因除了和内分泌紊乱有关外，日光照射也是一重要因素。过度光线照射后黄褐斑会加重，长期紫外线照射尤其是中波紫外线(UVB)能使黑色素细胞增值，黑色素量增加，因此避免日晒可使黄褐斑减轻乃至消退。

随着社会的发展，人们物质生活水平的提高，对美容的要求也越来越迫切，因此，开发一种祛黄褐斑的保健品具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种祛黄褐斑的组合物、其制备方法、其应用及祛黄褐斑的保健品，本发明提供的组合物能够祛黄褐斑。

本发明提供了一种祛黄褐斑的组合物，由以下重量份的原料制得：

丹参2～5重量份、当归2～5重量份、香附1～5重量份、木贼1～5重量份和葡萄籽提取物0.01～1重量份。

优选地，丹参2～4重量份。

优选地，当归2～4重量份。

优选地，香附1～3重量份。

优选地，木贼1～3重量份。

优选地，葡萄籽提取物0.1～0.5重量份。

本发明提供了一种祛黄褐斑的保健品，由上述技术方案所述的保健品组合物及药学上可接受的辅料制成。

本发明提供了一种祛黄褐斑的组合物的制备方法，包括以下步骤：

将2～5重量份丹参和乙醇混合，依次进行提取、浓缩和干燥，得到中间产物A；

将2～5重量份当归、1～5重量份香附、1～5重量份木贼和水混合，依次进行提取、浓缩和干燥，得到中间产物B；

将所述中间产物A、中间产物B和0.01～1重量份葡萄籽提取物混合，得到祛黄褐斑的组合物。

优选地，所述丹参和乙醇的质量比为1:10～15；

所述当归、香附和木贼的总质量与所述水的质量比为1:8～10。

本发明提供了一种如上述技术方案所述的组合物在制备祛黄褐斑的保健品中的应用。

本发明提供了一种祛黄褐斑的组合物，由以下重量份的原料制得：丹参2～5重量份、当归2～5重量份、香附1～5重量份、木贼1～5重量份和葡萄籽提取物0.01～1重量份。本发明提供的组合物包括丹参、当归、香附、木贼和葡萄籽提取物，各组分缺一不可，它们互相配伍，能够有效地降低酪氨酸酶的活性、对黑色素瘤细胞的增殖及黑色素的合成有一定的抑制作用，使得该组合物的祛黄褐斑效果显著。

具体实施方式

本发明提供了一种祛黄褐斑的组合物，由以下重量份的原料制得：

丹参2～5重量份、当归2～5重量份、香附1～5重量份、木贼1～5重量份和葡萄籽提取物0.01～1重量份。

在本发明中，制得所述祛黄褐斑的组合物的原料包括丹参2～5重量份，优选为2～4重量份。本发明对所述丹参的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的丹参即可，如可以采用其市售商品。在本发明中，丹参活血养血、祛淤生新，调节组织修复和再生，改善面部微循环，使气血运行通畅，上荣于面部，使面部毛细血管得已充养，斑点逐渐消退。

在本发明中，制得所述祛黄褐斑的组合物的原料包括当归2～5重量份，优选为2～4重量份。本发明对所述当归的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的当归即可，如可以采用其市售商品。在本发明中，所述当归具有调节垂体-卵巢内分泌的功能，可以改善血液流变学及微循环；能够抑制酪氨酸酶活性的作用，从而延缓衰老体征的出现，给人以青春常驻之感。

在本发明中，制得所述祛黄褐斑的组合物的原料包括香附1～5重量份，优选为1～3重量份。本发明对所述香附的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的香附即可，如可以采用其市售商品。在本发明中，所述香附味辛、微苦、微甘，平；用于肝郁气滞，胸、胁、脘腹胀痛。

在本发明中，制得所述祛黄褐斑的组合物的原料包括木贼1～5重量份，优选为1～3重量份。本发明对所述木贼的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的木贼即可，如可以采用其市售商品。在本发明中，所述木贼有收敛、消炎、止血，防治高血脂和利尿等作用功效，经常用于沙眼、感冒、咳嗽、牛皮癣等症。

在本发明中，制得所述祛黄褐斑的组合物的原料包括葡萄籽提取物0.01～1重量份，优选为0.1～0.5重量份。本发明对所述葡萄籽提取物的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的葡萄籽提取物即可，如可以采用其市售商品；在本发明的具体实施例中，所述葡萄籽提取物购买于宣城市百草植物工贸有限公司。皮肤属于结缔组织，葡萄籽提取物中所含有的胶原蛋白和弹性蛋白对皮肤的整个结构起重要的作用，胶原蛋白的适度交联，可以维持皮肤的完整性，而体内自由基氧化可使其过度交联、在皮肤上表现为皱纹和囊泡，葡萄籽提取物可促使胶原蛋白的适度交联，有效清除自由基，从而保持皮肤柔顺、光滑。另外，弹性蛋白可使皮肤具有弹性，缺乏弹性蛋白的皮肤松弛无力，使人显得老态龙钟，弹性蛋白可被自由基或弹性蛋白酶所降解，葡萄籽提取物具有清除自由基，阻断弹性蛋白酶的产生并抑制其活性，从而改善皮肤健康状况。

在本发明的某些实施例中，本发明提供的祛黄褐斑的组合物由以下重量份的原料制得：

丹参2重量份，当归3重量份、香附3重量份、木贼2重量份、葡萄籽提取物0.5重量份。

在本发明的某些实施例中，本发明提供的祛黄褐斑的组合物由以下重量份的原料制得：

丹参3重量份，当归2重量份、香附2重量份、木贼2重量份、葡萄籽提取物0.1重量份。

在本发明的某些实施例中，本发明提供的祛黄褐斑的组合物由以下重量份的原料制得：

丹参3重量份，当归3重量份、香附2重量份、木贼2重量份、葡萄籽提取物0.2重量份。

在本发明的某些实施例中，本发明提供的祛黄褐斑的组合物由以下重量份的原料制得：

丹参5重量份，当归5重量份、香附5重量份、木贼5重量份、葡萄籽提取物1重量份。

本发明提供了一种祛黄褐斑的保健品，由上述技术方案所述的组合物及药学上可接受的辅料制成。在本发明中，所述辅料优选包括微晶纤维素、预胶化淀粉、硬脂酸镁、甘露醇、山梨醇、甜菊糖苷、玉米淀粉和小麦淀粉中的一种或多种。本发明对所述辅料的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的上述辅料即可，如可以采用其市售商品。

本发明将上述技术方案所述保健品制成颗粒剂、片剂或胶囊剂，优选为胶囊剂。在本发明中，所述保健品为口服产品。

本发明还提供了一种祛黄褐斑的组合物的制备方法，包括以下步骤：

将2～5重量份丹参和乙醇混合，依次进行提取、浓缩和干燥，得到中间产物A；

将2～5重量份当归、1～5重量份香附、1～5重量份木贼和水混合，依次进行提取、浓缩和干燥，得到中间产物B；

将所述中间产物A、中间产物B和0.01～1重量份葡萄籽提取物混合，得到祛黄褐斑的组合物。

本发明将2～5重量份丹参和乙醇混合，依次进行提取、浓缩和干燥，得到中间产物A。在本发明中，所述丹参的来源和作用与上述技术方案所述丹参的来源与作用一致，在此不再赘述。

在本发明中，所述乙醇的质量分数优选为60％～80％，更优选为70％；所述丹参和乙醇的质量比优选为1:10～15，更优选为1:10。

在本发明中，丹参和乙醇混合后进行提取的温度优选为50℃～80℃，更优选为65℃～80℃；所述提取的次数优选为1次～3次，更优选为2次；每次提取的时间优选为0.5小时～2小时，更优选为90min。本发明将丹参和乙醇的混合物进行提取，过滤得到滤液，将滤液进行浓缩；浓缩的温度优选为45℃～75℃，更优选为50℃～70℃；浓缩的真空度优选为-0.08MPa～-0.1MPa；滤液优选浓缩至密度为1.1g/ml～1.2g/ml。在本发明中，干燥的方式优选为喷雾干燥；所述喷雾干燥的进风温度优选为150℃～190℃，更优选为160℃～180℃；所述喷雾干燥的出风温度优选为80℃～120℃，更优选为90℃～110℃。

本发明将2～5重量份当归、1～5重量份香附、1～5重量份木贼和水混合，依次进行提取、浓缩和干燥，得到中间产物B。在本发明中，所述当归、香附、木贼的来源和作用与上述技术方案所述当归、香附和木贼的来源和作用一致，在此不再赘述。在本发明中，所述当归、香附和木贼的总质量与所述水的质量比优选为1:8～10，更优选为1:8。

在本发明中，当归、香附、木贼和水混合后进行提取的温度优选为80℃～100℃，更优选为90℃～100℃；所述提取的次数优选为1次～3次，更优选为2次；每次提取的时间优选为0.5小时～2小时，更优选为2小时。本发明将当归、香附、木贼和水的混合物进行提取，过滤得到滤液，将滤液进行浓缩，浓缩的温度优选为45℃～75℃，更优选为50℃～70℃；浓缩的真空度优选为-0.08MPa～-0.1MPa；滤液优选浓缩至密度为1.1g/mL～1.2g/mL。在本发明中，当归、香附、木贼和水的浓缩滤液的干燥的方式优选为喷雾干燥；所述喷雾干燥的进风温度优选为150℃～190℃，更优选为160℃～180℃；所述喷雾干燥的出风温度优选为80℃～120℃，更优选为90℃～110℃。

本发明将所述中间产物A、中间产物B和0.01～1重量份葡萄籽提取物混合，得到祛黄褐斑的组合物。在本发明中，所述葡萄籽提取物的来源和作用与上述技术方案所述葡萄籽提取物的来源和作用一致，在此不再赘述。在本发明中，所述丹参和葡萄籽提取物的质量比优选为(2～5):(0.01～1)，优选为(2～4):(0.1～0.5)。

本发明优选将所述中间产物A、中间产物B和0.01～1重量份葡萄籽提取物混合后，再加入药学上可接受的辅料，得到祛黄斑的保健品。在本发明中，所述辅料的种类和来源与上述技术方案所述辅料的种类和来源一致，在此不再赘述。

本发明还提供了一种上述技术方案所述的组合物在制备祛黄褐斑的保健品中的应用。

本发明提供了一种祛黄褐斑的组合物，由以下重量份的原料制得：丹参2～5重量份、当归2～5重量份、香附1～5重量份、木贼1～5重量份和葡萄籽提取物0.01～1重量份。本发明提供的组合物包括丹参、当归、香附、木贼和葡萄籽提取物，各组分缺一不可，它们互相配伍，能够有效地降低酪氨酸酶的活性、对黑色素瘤细胞的增殖及黑色素的合成有一定的抑制作用，使得该组合物的祛黄褐斑效果显著。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种祛黄褐斑的组合物、其制备方法、其应用及祛黄褐斑的保健品进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

在以下实施例中，B16黑色素瘤细胞株，由华神集团提供；

RPMI-1640购买于GIBCO公司；

胎牛血清购买于HyClone公司；

小牛血清购买于HyClone公司；

胰蛋白酶购买于上海华美生物公司产品；

MTT购买于Sigma公司；

谷氨酰胺，青霉素，庆大霉素，NaCI及其它国产分析纯试剂；

Bio-Rad 550酶标仪由北京伯乐生命科学发展有限公司生产；

CK32倒置相差显微镜由日本OLYMPUS生产；

二氧化碳细胞培养箱的型号和生产厂家分别为BNA-311，ESPEC；

JA1003A型电子天平(精度1mg)由上海精天电子仪器有限公司生产；

80-2离心沉淀器由上海手术器械厂生产；

移液器购自芬兰雷勃Finnpipette；

石英紫外线杀菌灯购自扬州通达卫生器械有限公司。

实施例1

取丹参3g和质量分数为70％的乙醇30g混合，75℃提取2次，每次90min，过滤，将滤液浓缩至密度1.2g/mL；然后喷雾干燥，进风温度为180℃，出风温度为100℃，得到中间产物A；

取当归3g、香附2g、木贼2g和56g水混合，100℃提取2次，每次2小时，过滤，将滤液浓缩至密度为1.2g/mL；然后喷雾干燥，进风温度为190℃，出风温度为110℃，得到中间产物B；

将中间产物A、中间产物B和0.2g葡萄籽提取物混合，得到祛黄褐斑的组合物。

实施例2

取丹参2g和质量分数为70％的乙醇20g混合，65℃提取2次，每次90min，过滤，将滤液浓缩至密度1.2g/mL；然后喷雾干燥，进风温度为180℃，出风温度为100℃，得到中间产物A；

取当归3g、香附3g、木贼2g和56g水混合，90℃提取3次，每次2小时，过滤，将滤液浓缩至密度为1.1g/mL；然后喷雾干燥，进风温度为190℃，出风温度为110℃，得到中间产物B；

将中间产物A、中间产物B和0.5g葡萄籽提取物混合，得到祛黄褐斑的保健品组合物。

实施例3

取丹参3g和质量分数为70％的乙醇35g混合，80℃提取3次，每次100min，过滤，将滤液浓缩至密度1.1g/mL；然后喷雾干燥，进风温度为170℃，出风温度为90℃，得到中间产物A；

取当归2g、香附2g、木贼2g和50g水混合，80℃提取2次，每次2小时，过滤，将滤液浓缩至密度为1.2g/mL；然后喷雾干燥，进风温度为190℃，出风温度为110℃，得到中间产物B；

将中间产物A、中间产物B和0.1g葡萄籽提取物混合，得到祛黄褐斑的组合物。

实施例4

取丹参5g和质量分数为70％的乙醇50g混合，75℃提取2次，每次100min，过滤，将滤液浓缩至密度1.1g/mL；然后喷雾干燥，进风温度为170℃，出风温度为90℃，得到中间产物A；

取当归5g、香附5g、木贼5g和120g水混合，100℃提取2次，每次2小时，过滤，将滤液浓缩至密度为1.2g/mL；然后喷雾干燥，进风温度为190℃，出风温度为110℃，得到中间产物B；

将中间产物A、中间产物B和1g葡萄籽提取物混合，得到祛黄褐斑的组合物。

对比例1拆方祛黄褐斑的组合物的制备

取当归3g、香附2g、木贼2g和50g水混合，100℃提取2次，每次2小时，过滤，将滤液浓缩至密度为1.2g/mL；然后喷雾干燥，进风温度为190℃，出风温度为110℃，得到中间产物B；

将中间产物B和0.2g葡萄籽提取物混合，得到祛黄褐斑的组合物。

对比例2拆方祛黄褐斑的组合物的制备

取丹参3g和质量分数为70％的乙醇30g混合，75℃提取2次，每次90min，过滤，将滤液浓缩至密度1.2g/mL；然后喷雾干燥，进风温度为180℃，出风温度为100℃，得到中间产物A；

取香附2g、木贼2g和32g水混合，100℃提取2次，每次2小时，过滤，将滤液浓缩至密度为1.2g/mL；然后喷雾干燥，进风温度为190℃，出风温度为110℃，得到中间产物B；

将中间产物A、中间产物B和0.2g葡萄籽提取物混合，得到祛黄褐斑的组合物。

对比例3拆方祛黄褐斑的组合物的制备

取丹参3g和质量分数为70％的乙醇30g混合，75℃提取2次，每次90min，过滤，将滤液浓缩至密度1.2g/mL；然后喷雾干燥，进风温度为180℃，出风温度为100℃，得到中间产物A；

取当归3g、木贼2g和40g水混合，100℃提取2次，每次2小时，过滤，将滤液浓缩至密度为1.2g/mL；然后喷雾干燥，进风温度为190℃，出风温度为110℃，得到中间产物B；

将中间产物A、中间产物B和0.2g葡萄籽提取物混合，得到祛黄褐斑的组合物。

对比例4拆方祛黄褐斑的组合物的制备

取丹参3g和质量分数为70％的乙醇30g混合，75℃提取2次，每次90min，过滤，将滤液浓缩至密度1.2g/mL；然后喷雾干燥，进风温度为180℃，出风温度为100℃，得到中间产物A；

取当归3g、香附2g和40g水混合，100℃提取2次，每次2小时，过滤，将滤液浓缩至密度为1.2g/mL；然后喷雾干燥，进风温度为190℃，出风温度为110℃，得到中间产物B；

将中间产物A、中间产物B和0.2g葡萄籽提取物混合，得到祛黄褐斑的组合物。

对比例5拆方祛黄褐斑的组合物的制备

取丹参3g和质量分数为70％的乙醇30g混合，75℃提取2次，每次90min，过滤，将滤液浓缩至密度1.2g/mL；然后喷雾干燥，进风温度为180℃，出风温度为100℃，得到中间产物A；

取当归3g、香附2g、木贼2g和56g水混合，100℃提取2次，每次2小时，过滤，将滤液浓缩至密度为1.2g/mL；然后喷雾干燥，进风温度为190℃，出风温度为110℃，得到中间产物B；

将中间产物A和中间产物B混合，得到祛黄褐斑的组合物。

对比例6拆方祛黄褐斑的组合物的制备

取香附2g、木贼2g和32g水混合，100℃提取2次，每次2小时，过滤，将滤液浓缩至密度为1.2g/mL；然后喷雾干燥，进风温度为190℃，出风温度为110℃，得到中间产物B；

将中间产物B和0.2g葡萄籽提取物混合，得到祛黄褐斑的组合物。

对比例7拆方祛黄褐斑的组合物的制备

取木贼2g和16g水混合，100℃提取2次，每次2小时，过滤，将滤液浓缩至密度为1.2g/mL；然后喷雾干燥，进风温度为190℃，出风温度为110℃，得到中间产物B；

将中间产物B和0.2g葡萄籽提取物混合，得到祛黄褐斑的组合物。

对比例8拆方祛黄褐斑的组合物的制备

取丹参3g和质量分数为70％的乙醇30g混合，75℃提取2次，每次90min，过滤，将滤液浓缩至密度1.2g/mL；然后喷雾干燥，进风温度为180℃，出风温度为100℃，得到中间产物A；

取木贼2g和16g水混合，100℃提取2次，每次2小时，过滤，将滤液浓缩至密度为1.2g/mL；然后喷雾干燥，进风温度为190℃，出风温度为110℃，得到中间产物B；

将中间产物A、中间产物B和0.2g葡萄籽提取物混合，得到祛黄褐斑的组合物。

实施例5

取实施例1～4任意一个实施例制备的祛黄褐斑的组合物，与辅料混合制粒后，得到祛黄褐斑的保健品。

实施例6

取实施例1～4任意一个实施例制备的祛黄褐斑的组合物，与小麦淀粉混合制粒后，充胶囊，得到祛黄褐斑的保健品。

实施例7

取实施例1～4任意一个实施例制备的祛黄褐斑的组合物，与微晶纤维素混合制粒后，充胶囊，得到祛黄褐斑的保健品。

实施例8

取实施例1～4任意一个实施例制备的祛黄褐斑的组合物，与玉米淀粉混合制粒后，充胶囊，得到祛黄褐斑的保健品。

实施例9

取本发明实施例1～4和对比例1～8制得的祛黄褐斑的组合物，检测对B16黑色素瘤细胞增殖的抑制作用，实验设不添加组合物的空白对照。实验方法为:

1.1培养液、消化液和缓冲液的配制：

1.1.1培养液的配制：

(1)RPMI-1640培养液(1000ml)：将RPMI-1640干粉溶于300mL三蒸水中，用水洗包装袋2次，倒入合并、搅拌，加三蒸水至近1000mL处：加NaHCO₃2g，补充谷氨酰胺至终浓度为3mmol/L，加入酚红(终浓度为5.3mg/L)；加入抗生素a青霉素(100U/mL)、b庆大霉素(50U/mL)；定容至1000mL；以NaOH或HCL调节PH至7.2。过滤除菌，4℃保存。吸取配制好的RPMI-1640培养液2mL入25mL的玻璃细胞培养瓶中，在37℃、5％CO₂和完全湿度条件下培养过夜，倒置显微镜下观察有否染菌。未染菌的培养液方可进行实验。

(2)10％小牛血清的RMPI-1640培养液(100mL)：取配好的RPMI-1640培养液90mL，加入10mL小牛血清，以NaOH或HCI调节pH至7.2。过滤除菌，4℃保存。吸取配制好的含10％小牛血清的RPMI-1640培养液2mL入25mL的玻璃细胞培养瓶中，在37℃、5％CO₂和完全湿度条件下培养过夜，倒置显微镜下观察有否染菌。未染菌的培养液方可进行实验。

(3)10％胎牛血清的RMPI-1640培养液(100mL)：取配好的RPMI-1640培养液80mL，加入10mL胎牛血清和10mL Heper(终浓渡为5mM)；加入2-巯基乙醇(2-Me)至终浓度为50μmol/L以NaOH或HCI调节PH至7.2。过滤除菌，4℃保存。吸取配制好的含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液2mL入25mL的玻璃细胞培养瓶中，在37℃、5％CO₂和完全湿度条件下培养过夜，倒置显微镜下观察是否染菌。未染菌的培养液方可进行实验。

1.1.2消化液的配制：

(1)母液配制：用无钙镁Hanks液配制0.25％的胰蛋白酶溶液。过滤除菌，4℃保存。用PBS配制0.04％的EDTA，10磅高压灭菌15分钟，4℃保存。

(2)应用液配制：取0.4mL 0.04％的EDTA，0.4mL 0.25％胰蛋白酶，加入无菌PBS到2mL，4℃保存。

1.1.3无机盐缓冲液的配制：

(1)PBS溶液(1000mL)：8g NaCI(137mmol/L)，0.2g KCI(2.7mmol/L)，1.15gNa₂HPO₄·7H₂O(4.3mmol/L)，0.2g KH₂PO₄(1.4mmol/L)溶于1L双蒸水中，调节pH值到7.2，高压灭菌，4℃保存备用。

(2)0.83％Tris-NH₄Cl溶液(500ml)：3.0275g Tris(0.05mol/L)溶于250mL双蒸水中；4.15g nNH₄Cl(0.83％)溶于250mL双蒸水中。两种溶液混合，加双蒸水中定容至500mL，高压灭菌，4℃保存备用。

1.2空白组、实验组和对照组对B16黑色素瘤细胞增殖抑制的影响：

取对数生长期的B16细胞，0.25％胰蛋白酶消化，RMPI-1640培养液收集消化后细胞，1000rpm离心3～5min，弃去上层清液。以10％小牛血清的RMPI-1640培养液吹散细胞，将其稀释为5×10⁴个/mL。取0.1mL细胞悬液加入96孔细胞培养板，放在37℃、5％CO₂二氧化碳培养箱中培养。

本发明组合物(不同浓度)对B-16增殖抑制的影响：将本发明药物组合物用生理盐水配置成2000μg/mL的母液，121℃灭菌20min。将母液用10％小牛血清的RMPI-1640培养液稀释为终浓度：0、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、750、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000μg/mL(共21个梯度)加入贴壁生长4h的细胞培养体系中，每孔终体积为200μL，每个浓度设4个复孔，取平均值。在37℃、5％CO₂二氧化碳培养箱中培养72小时。于细胞培养结束前5小时每孔弃去培养上清100μL，加入浓度为5mg/mL的MTT 10μL(用生理盐水配制，过滤除菌)。培养结束后，每孔加105SDS(用0.01M的HCI配置)100μL振荡混匀，37℃下4小时，用酶标仪在570nm处读取OD值；作出B16细胞受本发明提供的祛黄褐斑的组合物抑制与本发明提供的组合物浓度之间的曲线，判断本发明提供的组合物的有效抑制浓度。

将不同对比例按上述对B16细胞增殖抑制的影响的方法处理，得出不同对照组对B16黑色素瘤细胞增殖抑制的影响。

本发明采用MTT法测定本发明实施例1提供的祛黄褐斑的组合物对B16黑色素瘤细胞增殖的影响，测试结果如表1所示，表1为本发明不同浓度的祛黄褐斑的组合物对B16黑色素瘤细胞增殖抑制的影响。

表1本发明不同浓度的组合物对B16黑色素瘤细胞增殖抑制的影响

由表1可见，用MTT法测定本发明组合物对B-16黑色素瘤细胞增殖的影响。在极低浓度时，本发明组合物可刺激B16细胞的增殖；但当其浓度大于100μg/mL时，随浓度增高，则呈现出抑制作用，最佳抑制浓度为400μg/mL～500μg/mL之间，当本发明组合物浓度大于500μg/mL时，对B-16黑色素瘤细胞增殖的抑制作用不会再随着浓度增大而增加，其抑制效果达到最大。本发明实施例2～4制得的祛黄褐斑的组合物的检测结果与此相似。

其中，固定浓度为400μg/mL比较实施例1和对比例1～8提供的祛黄褐斑的组合物对B16黑色素瘤细胞增殖抑制的影响，实验设空白对照，空白对照组不添加药液。测试结果见表2所示，表2为空白组、实施例1和对比例1～8对B16黑色素瘤细胞增殖抑制的影响结果。

表2空白组、实施例1和对比例1～8制备的祛黄褐斑的组合物对B16黑色素瘤细胞增殖抑制的影响结果(n-4,x±S)

由表2可以看出：与空白组相比，实施例1及不同的对比例制备的祛黄褐斑的组合物对B16黑色素瘤细胞增殖均有抑制作用。与实施例1相比，所有的对比例的抑制作用明显降低。另外，比较不同对照组的结果发现缺不同的药味对B16黑色素瘤细胞增殖抑制存在显著差异。

实施例10保健品组合物对酪氨酸酶活性的影响

取本发明实施例1～4和对比例1～8制得的祛黄褐斑的组合物检测对酪氨酸酶活性的抑制作用，实验设不添加祛黄褐斑的组合物的空白对照。培养液、消化液、无机盐缓冲液、母液的配制方法与实施例9相同，实验方法为：

取对数生长期的B16细胞，0.25％胰蛋白酶消化，RMPI-1640培养液收集消化后细胞，1000r/min离心3～5min。弃去上层清液。以10％小牛血清的RMPI-1640培养液吹散细胞，将其稀释为8×10⁴个/mL。取0.1mL细胞悬液加入96孔细胞培养板。放在37℃、5％CO₂饱和水汽二氧化碳培养箱中培养。

本发明提供的祛黄褐斑的组合物(不同浓度)对酪氨酸酶活性影响：将母液用10％小牛血清的RMPI-1640培养液稀释为终浓度：0μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL、250μg/mL、300μg/mL、350μg/mL、400μg/mL、450μg/mL(共12个梯度)加入贴壁生长4h的细胞培养体系中，每孔终体积为200μL，每个浓度设4个复孔。在37℃、5％CO₂二氧化碳培养箱中培养48小时。弃去上层清液，用pH值为7.4的PBS洗涤细胞2次，每孔加入50μL、1％TritonX-100。将96孔细胞培养板迅速放入-30℃冰箱，30min后取出，室温下自然解冻从而破坏细胞。37℃预温后加入1％L-多巴溶液(10μL/孔)，37℃反应2h，测定490nm吸收度值。

将不同对比例按上述对酪氨酸酶活性影响的方法处理，得出不同对比例对酪氨酸酶活性的影响。

本发明采用分光光度法测定本发明实施例1提供的祛黄褐斑的组合物对酪氨酸酶活性的影响，测试结果见表3所示，表3为本发明不同浓度的祛黄褐斑的组合物对酪氨酸酶活性的影响。

表3本发明不同浓度的祛黄褐斑的组合物对酪氨酸酶活性的影响

由表3可以看出，小鼠B16黑色素瘤细胞在经本发明提供的祛黄褐斑的组合物作用48小时后，低浓度(＜100μg/mL)的保健品组合物对酪氨酸酶活性有一定促进作用，但随浓度增高，则对酪氨酸酶活性有明显的抑制作用。本发明提供的保健品组合物浓度在150μg/mL～450μg/mL的范围内，能有效抑制B16黑色素瘤细胞株的酪氨酸酶活性。本发明实施例2～4制得的祛黄褐斑的组合物的检测结果与此相似。

将400μg/mL作为空白组、实施例1和对比例1～8的试验浓度，观察空白组、实施例1和对比例1～8对酪氨酸酶活性的影响，测试结果如表4所示，表4为空白组、实施例1和对比例1～8对酪氨酸酶活性的影响结果。

表4空白组、实施例1和对比例1～8对酪氨酸酶活性的影响结果(n-4,x±S)

由表4可以看出：与空白组相比，实施例1及不同的对比例对于酪氨酸酶活性均有抑制作用。与实施例1相比，所有对比例的抑制作用明显降低。另外，比较不同对比例的结果发现缺不同的药味对酪氨酸酶活性的影响存在显著差异。

实施例11祛黄褐斑的组合物对黑色素合成的影响：

取本发明实施例1～4和对比例1～8制得的祛黄褐斑的组合物检测对黑色素生成的抑制作用，实验设不添加祛黄褐斑的组合物的空白对照。培养液、消化液、无机盐缓冲液、母液的配制方法与实施例9相同，实验方法为：

取对数生长期的B16细胞，0.25％胰蛋白酶消化，RMPI-1640培养液收集消化后细胞，1000rpm离心3～5min，弃去上层清液。以10％小牛血清的RMPI-1640培养液吹散细胞，将其稀释为1×10⁵个/mL。取1mL细胞悬液加入24孔细胞培养板。在37℃、5％CO₂二氧化碳培养箱中培养。

本发明组合物(不同浓度)对黑色素生成影响：将将母液用10％小牛血清的RMPI-1640培养液稀释为终浓度0～300μg/mL(共5个梯度，分别为：0、25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL、250μg/mL、300μg/mL)加入贴壁生长4小时的细胞培养体系中，每孔终体积为200μL，每个浓度设4个复孔，在37℃、5％CO₂二氧化碳培养箱中培养96小时，0.25％胰蛋白酶消化细胞，每孔取1×10⁵个细胞离心弃去上层清液，加入1mL 1mol/L的NaOH，震荡5分钟。置酶标仪测A值，波长为490nm。

本发明的不同对比例制备的祛黄褐斑的组合物对黑色素生成影响：将不同对比例按上述对黑色素生成影响的方法处理，得出不同对照组对黑色素生成的影响；

本发明提供的祛黄褐斑的组合物对黑色素生成的影响结果如表5所示，表5为本发明不同浓度的祛黄褐斑的组合物对黑色素生成的影响结果。

表5本发明不同浓度的祛黄褐斑的组合物对黑色素生成的影响结果(n-4,x±S)

由表5可以看出：本发明提供的祛黄褐斑的组合物对小鼠B16黑色素瘤细胞作用4d后，测定黑色素含量，在100μg/mL以下，随浓度增加，黑色素含量不断增加；大于100μg/mL浓度时，随浓度增高，本发明提供的保健品组合物可明显抑制黑色素的生成，当保健品组合物浓度为100μg/mL时，其对黑色素生成的抑制达到最大；在100μg/mL～300μg/mL浓度之间时，对色素的抑制趋于平稳，说明继续增加本发明提供的祛黄褐斑的组合物浓度对黑色素合成的影响不大。本发明实施例2～4制得的祛黄褐斑的组合物的检测结果与此相似。

黄褐斑的形成与酪氨酸酶的活性、黑色素瘤细胞的增殖、黑色素的生成密切相关，本发明组合物浓度适当时能够有效的降低酪氨酸酶的活性，并且对黑色素瘤细胞的增殖及黑色素的合成有一定的抑制作用。黑色素细胞内黑素体中的酪氨酸经酪氨酸酶催化形成多巴醌，进而氧化成多巴素，形成黑色素，黑色素颗粒使皮肤变黑，导致黄褐斑的形成。本发明组合物浓度适当时能够有效的降低酪氨酸酶的活性，并且对细胞的增殖及黑色素的合成有一定的抑制作用。在本发明拆方组实验的过程中，发现不同的拆方组的试验结果存在显著差异，说明不同的药味祛斑效果存在显著差异。综合以上结果，说明本发明提供的祛黄褐斑的组合物可作为美白祛斑及辅助治疗黄褐斑的保健品使用。

由以上实施例可知，本发明提供了一种祛黄褐斑的组合物，由以下重量份的原料制得：丹参2～5重量份、当归2～5重量份、香附1～5重量份、木贼1～5重量份和葡萄籽提取物0.01～1重量份。本发明提供的组合物包括丹参、当归、香附、木贼和葡萄籽提取物，各组分缺一不可，它们互相配伍，能够有效地降低酪氨酸酶的活性、对黑色素瘤细胞的增殖及黑色素的合成有一定的抑制作用，使得该组合物的祛黄褐斑效果显著。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种祛黄褐斑的保健品，由以下重量份的原料及药学上可接受的辅料制得：

丹参2~5重量份、当归2~5重量份、香附1~5重量份、木贼1~5重量份和葡萄籽提取物0.01~1重量份。

2.根据权利要求1所述的保健品，其特征在于，丹参2~4重量份。

3.根据权利要求1所述的保健品，其特征在于，当归2~4重量份。

4.根据权利要求1所述的保健品，其特征在于，香附1~3重量份。

5.根据权利要求1所述的保健品，其特征在于，木贼1~3重量份。

6.根据权利要求1所述的保健品，其特征在于，葡萄籽提取物0.1~0.5重量份。

7.一种祛黄褐斑的保健品的制备方法，包括以下步骤：

将2~5重量份丹参和乙醇混合，依次进行提取、浓缩和干燥，得到中间产物A；

将2~5重量份当归、1~5重量份香附、1~5重量份木贼和水混合，依次进行提取、浓缩和干燥，得到中间产物B；

将所述中间产物A、中间产物B和0.01~1重量份葡萄籽提取物混合后，再加入药学上可接受的辅料，得到祛黄褐斑的保健品。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述丹参和乙醇的质量比为1:10~15；

所述当归、香附和木贼的总质量与所述水的质量比为1:8~10。

9.如权利要求1~5任意一项所述的保健品在制备祛黄褐斑的保健品中的应用。