CN104546723A

CN104546723A - 一种培美曲塞脂质体及其制备方法

Info

Publication number: CN104546723A
Application number: CN201510072663.9A
Authority: CN
Inventors: 刘艳; 陈婷; 尹又; 高洁; 陈霁晖
Original assignee: XinHua Hospital Affiliated To Shanghai JiaoTong University School of Medicine
Current assignee: XinHua Hospital Affiliated To Shanghai JiaoTong University School of Medicine
Priority date: 2015-02-11
Filing date: 2015-02-11
Publication date: 2015-04-29
Anticipated expiration: 2035-02-11
Also published as: CN104546723B

Abstract

本发明提供了一种培美曲塞脂质体，其特征在于：由培美曲塞和脂质体混合物制造而成，其中，所述培美曲塞和脂质体混合物的质量比为1：0.1-10；发明制造的培美曲塞脂质体能使药物耐药性降低为非脂质体培美曲塞的60％以上。经稳定性测试可知，该脂质体稳定性良好。经临床试验可知，该脂质体较普通制剂提高疗效率为80％以上，在体内的存留时间能提高65％以上，靶向作用明显。

Description

一种培美曲塞脂质体及其制备方法

技术领域

本发明属于制剂领域，具体地，涉及一种培美曲塞脂质体及其制备方法。

背景技术

培美曲塞是一种结构上含有核心为吡咯嘧啶基团的抗叶酸制剂，通过破坏细胞内叶酸依赖性的正常代谢过程，抑制细胞复制，从而抑制肿瘤的生长。体外研究显示，培美曲塞能够抑制胸苷酸合成酶、二氢叶酸还原酶和甘氨酰胺核苷酸甲酰转移酶的活性，这些酶都是合成叶酸所必需的酶，参与胸腺嘧啶核苷酸和嘌吟核苷酸的生物再合成过程，培美曲塞通过运载叶酸的载体和细胞膜上的叶酸结合蛋白运输系统进入细胞内。

一旦培美曲塞进入细胞内，它就在叶酰多谷氨酸合成酶的作用下转化为多谷氨酸的形式。多谷氨酸存留于细胞内成为胸苷酸合成酶和甘氨酰胺核苷酸甲酰转移酶的抑制剂，多谷氨酸化在肿瘤细胞内呈现时间-浓度依赖性过程，而在正常组织内浓度很低。多谷氨酸化代谢物在肿瘤细胞内的半衰期延长，从而也就延长了药物在肿瘤细胞内的作用时间。临床前研究显示培美曲塞体外可抑制间皮瘤细胞系(MSTO-211H，NCI-H2052)的生长。间皮瘤细胞系MSTO-211H的研究显示出培美曲塞与顺铂联合有协同作用。

但是，现有的培美曲塞制剂存在体内吸收不佳、肝脏代谢损失和生殖毒性等问题，如何降低其毒性，提高其治疗效果成为目前研究的主要方向。

此外，培美曲塞还存在稳定性较差的问题，在高温、氧化的条件下易发生降解，还产生可能引发毒副作用的杂质，在运输和贮藏的过程中，也常因为温度控制不严格而导致培美曲塞制剂中的杂质含量明显增加等问题。

发明内容

本发明旨在克服上述缺陷，提供一种稳定性好、毒性低、包封率适当的培美曲塞脂质体及其制备方法。

本发明提供了一种培美曲塞脂质体，其特征在于：由培美曲塞和脂质体混合物制造而成，其中，所述培美曲塞和脂质体混合物的质量比为1：0.1-10；

所述脂质体混合物由磷脂类化合物、固醇类化合物及脂溶性衍生物组成。

其中，上述磷脂类化合物、固醇类化合物及脂溶性衍生物的质量比为40-50：40-50：5-15。

此外，本发明提供的培美曲塞脂质体中，磷脂类化合物选自天然或合成的卵磷脂及其衍生物、大豆磷脂及其衍生物、脑磷脂及其衍生物、心磷脂及其衍生物、磷脂酰肌醇及其衍生物、磷脂酰丝氨酸及其衍生物、磷脂酰甘油及其衍生物、磷脂酸及其衍生物、磷脂酰乙醇胺及其衍生物、磷脂酰胆碱及其衍生物、磷脂酰肌醇及其衍生物、神经鞘磷脂及其衍生物、磷脂及其衍生物、及上述物质的氢化产物中的一种或几种的混合物；最优选为氢化大豆磷脂。

固醇类化合物选自胆固醇、二氢胆固醇、麦角固醇、豆固醇、谷固醇、菌固醇中的一种或几种的混合物；最优选为胆固醇。

脂溶性衍生物选自聚乙二醇酯衍生物中的一种或几种的混合物；最优选为天然水溶性VE。

另外，本发明还提供了上述培美曲塞脂质体的制备方法，其特征在于：采用薄膜分散法与pH梯度法相结合的方式进行培美曲塞脂质体的制备；

其中，上述pH梯度法优选采用醋酸钙梯度法实现。

具体工艺步骤如下所示：

步骤一、将脂质体混合物置于容器内，用溶剂溶解；

在该步骤一中，上述脂质体混合物与溶剂的质量比为1：50-80；优选为1：50-60；最优选为1：50。

上述容器可以为ep管、离心管、烧瓶等容器。

上述溶剂选自氯仿、二氯甲烷、四氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯、乙酸甲酯、甲醇、乙醇、丙酮等中的一种或几种的组合物；优选为氯仿、二氯甲烷、四氯甲烷、乙醇；最优选为氯仿。

步骤二、于30℃以内的温度下减压蒸除溶剂，获得薄膜。

步骤三、加入醋酸钙水溶液水化薄膜；

在该步骤三中，上述醋酸钙水溶液的质量浓度为10％-90％不等，优选pH为7.3左右的溶液，添加量任意，优选为溶剂体积量的10倍。

步骤四、于30℃以内的温度下减压蒸馏20-60分钟。

步骤五、于4℃以内的温度下超声1-20分钟，形成混合溶液。

步骤六、透析4-10小时，形成醋酸钙梯度；

步骤六中，上述透析过程优选在截留分子量为1000的透析袋中完成；

该透析过程采用的透析液为生理盐水，透析后的混合溶液pH为4.5-5.5；透析液的用量可根据需要进行调整，一般选用1L的透析液，进行2-5个周期的透析。

步骤七、于上述透析后的混合溶液中，加入培美曲塞水溶液，于40-80℃的温度下载药20-60分钟；

在步骤七中，上述培美曲塞水溶液与所述透析后的混合溶液的体积比为1：1-4；优选的，将所述培美曲塞水溶液加入所述透析后的混合溶液后，其浓度变为初始浓度的1/5-1/2；

上述培美曲塞水溶液的质量浓度为1-10mg/ml，上述培美曲塞水溶液优选为用MilliQ水溶解的培美曲塞溶液；

此外，在该载药过程中应当注意避光。

步骤八、透析4-10小时后保存备用。

将上述过程获得的混合物，加入到透析袋中透析，该过程优选在截留分子量为1000的透析袋中完成；

该透析过程采用的透析液为PBS溶液；透析液的用量可根据需要进行调整，一般选用1L的透析液，进行2-5个周期的透析。

在本发明的方案中，上述脂质体混合物最优选由HSPC、chol、TPGS组成；

其中，上述HSPC、chol、TPGS的质量比为44-50：40-45：5-15；

最优选的HSPC、chol、TPGS质量比为47.4：42.6：10。

另外，本发明提供的上述脂质体的制备方法，还可以用于水溶性弱酸性靶向药物、抗肿瘤药物的脂质体的制备。

本发明的作用和效果：

在本发明的方案中，旨在提供一种培美曲塞脂质体。且该脂质体稳定性好、工艺简便、药物耐药性低。

本发明通过对工艺方案的研究，最终采用薄膜分散法与pH梯度法相结合的方式进行培美曲塞脂质体的制备，在该方法的组合中，薄膜分散法旨在制备一种分散度适中、粒子大小适当的空白薄膜，特别是在最优选的方案中，选用氢化大豆磷脂、胆固醇和天然水溶性VE作为脂质体膜的材料，其最佳质量比为47.4：42.6：10，经实验表明，采用该配比和组分获得的脂质体膜，更为稳定，更适用于培美曲塞脂质体的制造。

此外，在本发明的工艺方法中可以看出，在载药阶段采用了pH梯度法进行，最优选的采用了醋酸钙梯度法将药物包裹入膜体中，经试验表明，针对培美曲塞这类水溶性的药物，由于其本身的物理化学特性，更适合于采用如本发明所设计的脂质体的制造方法。

此外，本发明制造培美曲塞脂质体经MCF-7ADR细胞株耐药性试验可知，本发明制造的培美曲塞脂质体能使药物耐药性降低为非脂质体培美曲塞的60％以上。经稳定性测试可知，该脂质体稳定性良好。经临床试验可知，该脂质体较普通制剂提高疗效率为80％以上，在体内的存留时间能提高65％以上，靶向作用明显。

说明书附图

附图1为MTA空白制剂与MTA脂质体1#对抗MCF-7ADR细胞株耐药性测试结果。

具体实施方式

实施例一、MTA脂质体1#

将37mg的脂质体混合物(HSPC/chol/TPGS质量比为47.4/42.6/10)置于ep管中加0.5ml氯仿溶解；混合物置于旋转蒸发仪中，室温，减压蒸发出去有机形成薄膜；加入5ml醋酸钙水溶液水化，旋蒸30min，去除残余的有机溶剂；将形成的脂质体冰浴超声5min；取上述脂质体溶液加入到截留分子量为1000的透析袋中，透析液(NS溶液)的体积为1L，透析时间为6-8小时，换两次液体(1L*2)，形成醋酸钙梯度，增加对pH的监控(pH＝4.5-5.5)。

取透析后脂质体溶液，加入预先配好的5mg/ml培美曲塞溶液(MilliQ水溶解)，终浓度1mg/ml，载药过程溶液60℃水浴30min(避光)。取脂质体溶液加入到截留分子量为1000的透析袋中，透析液(PBS溶液磷酸盐缓冲溶液)的体积为1L，透析时间为6-8小时，换两次液体(1L*2)。

实施例二、MTA脂质体2#

将30mg的脂质体混合物(HSPC/chol/TPGS质量比为50/45/5)置于ep管中加0.5ml氯仿溶解；混合物置于旋转蒸发仪中，室温，减压蒸发出去有机形成薄膜；加入5ml醋酸钙水溶液水化，旋蒸20min，去除残余的有机溶剂；将形成的脂质体冰浴超声10min；取上述脂质体溶液加入到截留分子量为1000的透析袋中，透析液(NS溶液)的体积为1L，透析时间为6-8小时，换两次液体(1L*2)，形成醋酸钙梯度，增加对pH的监控(pH＝4.5-5.5)。

取透析后脂质体溶液，加入预先配好的10mg/ml培美曲塞溶液(MilliQ水溶解)，终浓度2mg/ml，载药过程溶液60℃水浴30min(避光)。取脂质体溶液加入到截留分子量为1000的透析袋中，透析液(PBS溶液磷酸盐缓冲溶液)的体积为1L，透析时间为6-8小时，换两次液体(1L*2)。

实施例三、MTA脂质体3#

将40mg的脂质体混合物(HSPC/chol/TPGS质量比为44.7/40.3/15)置于ep管中加1ml氯仿溶解；混合物置于旋转蒸发仪中，室温，减压蒸发出去有机形成薄膜；加入10ml醋酸钙水溶液水化，旋蒸60min，去除残余的有机溶剂；将形成的脂质体冰浴超声10min；取上述脂质体溶液加入到截留分子量为1000的透析袋中，透析液(NS溶液)的体积为1L，透析时间为6-8小时，换两次液体(1L*2)，形成醋酸钙梯度，增加对pH的监控(pH＝4.5-5.5)。

取透析后脂质体溶液，加入预先配好的4mg/ml培美曲塞溶液(MilliQ水溶解)，终浓度2mg/ml，载药过程溶液40℃水浴60min(避光)。取脂质体溶液加入到截留分子量为1000的透析袋中，透析液(PBS溶液磷酸盐缓冲溶液)的体积为1L，透析时间为6-8小时，换两次液体(1L*2)。

实施例四、MTA脂质体4#

将40mg的脂质体混合物(心磷脂/谷固醇/TPGS质量比为40/50/15)置于ep管中加1ml乙醇溶解；混合物置于旋转蒸发仪中，室温，减压蒸发出去有机形成薄膜；加入5ml醋酸钙水溶液水化，旋蒸20min，去除残余的有机溶剂；将形成的脂质体冰浴超声8min；取上述脂质体溶液加入到截留分子量为1000的透析袋中，透析液(NS溶液)的体积为1L，透析时间为6-8小时，换两次液体(1L*2)，形成醋酸钙梯度，增加对pH的监控(pH＝4.5-5.5)。

取透析后脂质体溶液，加入预先配好的2mg/ml培美曲塞溶液(MilliQ水溶解)，终浓度1mg/ml，载药过程溶液80℃水浴20min(避光)。取脂质体溶液加入到截留分子量为1000的透析袋中，透析液(PBS溶液磷酸盐缓冲溶液)的体积为1L，透析时间为6-8小时，换两次液体(1L*2)。

实施例五、MTA脂质体5#

将40mg的脂质体混合物(氢化磷脂酰肌醇/二氢胆固醇/TPGS质量比为45/45/10)置于ep管中加1ml乙醇溶解；混合物置于旋转蒸发仪中，室温，减压蒸发出去有机形成薄膜；加入5ml醋酸钙水溶液水化，旋蒸20min，去除残余的有机溶剂；将形成的脂质体冰浴超声8min；取上述脂质体溶液加入到截留分子量为1000的透析袋中，透析液(NS溶液)的体积为1L，透析时间为6-8小时，换两次液体(1L*2)，形成醋酸钙梯度，增加对pH的监控(pH＝4.5-5.5)。

取透析后脂质体溶液，加入预先配好的5mg/ml培美曲塞溶液(MilliQ水溶解)，终浓度1.5mg/ml，载药过程溶液40℃水浴30min(避光)。取脂质体溶液加入到截留分子量为1000的透析袋中，透析液(PBS溶液磷酸盐缓冲溶液)的体积为1L，透析时间为6-8小时，换两次液体(1L*2)。

实施例的作用和效果：

一、包封率试验：

取MTA脂质体，利用HPLC方法测定脂质体的包封率。

仪器：安捷伦1260

色谱柱：C18柱((150mm×4.6mm，5um)

流动相：0.02mol/L磷酸二氢钠水溶液(磷酸调pH3.4)-乙腈(85:15,v/v)为流动相

波长：226nm

流速：1ml/min

每组别测试三次，平均包封率结果如下表所示：

组别	1#	2#	3#	4#	5#
						包封率％	88	54	57	41	32

二、稳定性试验

方案A、取MTA脂质体适量，密封，于冰箱4℃放置，于0、2、4、8、12月取样，对包封率、渗漏率、含量等指标进行测定，评价MTA脂质体冻干品的稳定性。

结果如下表所示：

包封率％	初始	2个月	4个月	6个月	8个月	12个月
							MTA脂质体1#	88.4	88.4	88.4	88.3	87.9	87.8

MTA脂质体2#	54.2	54.2	54.1	54.0	53.9	53.9
							MTA脂质体3#	56.9	56.8	56.9	56.4	56.4	56.4
MTA脂质体4#	41.3	41.3	41.3	41.3	41.1	40.8
							MTA脂质体5#	32.3	32.3	32.3	32.3	32.3	32.3

上述结果表明，MTA脂质体制剂在冰箱4℃放置12个月，其包封率、含量等质量指标基本不变，表明MTA脂质体制剂稳定性好。

方案B、取MTA脂质体适量溶于MilliQ水中，制成1mg/ml的溶液，在4℃，25℃和35℃放置六周，于7、14、21、28、35和42天高速离心收集沉淀，用HPLC法测定MTA包封率。

结果如下表所示：

上述结果表明，4℃放置六周基本无渗漏；25℃存放四周基本无渗漏；在环境温度不高于35℃的情况下，该脂质体能保持两周以上的稳定性，表明MTA脂质体稳定性好。

三、耐药性试验：

方案：MTA脂质体可对抗MCF-7ADR细胞株耐药(对比普通制剂)

具体试验方法：

将细胞稀释到一定浓度后，往96孔板每孔加100ul的细胞,培养箱培养24小时；加入培美曲塞脂质体或对照药物，直接孵育5天；向每孔加入10μLCCK8溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数)；将培养板在培养箱内孵育1-4小时；用酶标仪测定在450nm处的吸光度；计算IC50值，其结果如下表所示。

	IC50(mg/ml)
		MTA空白制剂	1.079
MTA脂质体1#	0.6443
		MTA脂质体2#	0.7651
MTA脂质体3#	0.7120
		MTA脂质体4#	0.8967
MTA脂质体5#	0.8411

具体如图1所示，培美曲塞脂质体的IC50明显减小，说明药物耐药性降低。

Claims

1.一种培美曲塞脂质体，其特征在于：由培美曲塞和脂质体混合物制造而成，其中，所述培美曲塞和脂质体混合物的质量比为1：0.1-10；

2.如权利要求1所述的一种培美曲塞脂质体，其特征在于：

所述磷脂类化合物、固醇类化合物及脂溶性衍生物的质量比为40-50：40-50：5-15。

3.如权利要求1所述的一种培美曲塞脂质体，其特征在于：

所述磷脂类化合物选自天然或合成的卵磷脂及其衍生物、大豆磷脂及其衍生物、脑磷脂及其衍生物、心磷脂及其衍生物、磷脂酰肌醇及其衍生物、磷脂酰丝氨酸及其衍生物、磷脂酰甘油及其衍生物、磷脂酸及其衍生物、磷脂酰乙醇胺及其衍生物、磷脂酰胆碱及其衍生物、磷脂酰肌醇及其衍生物、神经鞘磷脂及其衍生物、磷脂及其衍生物、及上述物质的氢化产物中的一种或几种的混合物；

所述固醇类化合物选自胆固醇、二氢胆固醇、麦角固醇、豆固醇、谷固醇、菌固醇中的一种或几种的混合物；

所述脂溶性衍生物选自聚乙二醇酯衍生物中的一种或几种的混合物。

4.如权利要求1-3任一所述的一种培美曲塞脂质体的制备方法，其特征在于：

采用薄膜分散法与pH梯度法相结合的方式进行培美曲塞脂质体的制备。

5.如权利要求4所述的一种培美曲塞脂质体的制备方法，其特征在于，包括如下工艺步骤：

步骤一、将脂质体混合物置于容器内，用溶剂溶解；

步骤二、于30℃以内的温度下减压蒸除溶剂，获得薄膜；

步骤三、加入醋酸钙水溶液水化薄膜；

步骤四、于30℃以内的温度下减压蒸馏20-60分钟；

步骤五、于4℃以内的温度下超声1-20分钟，形成混合溶液；

步骤六、透析4-10小时，形成醋酸钙梯度；

步骤八、透析4-10小时后保存备用。

6.如权利要求5所述的一种培美曲塞脂质体的制备方法，其特征在于：

在步骤一中，所述脂质体混合物与溶剂的质量比为1：50-80；

所述溶剂选自氯仿、二氯甲烷、四氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯、乙酸甲酯、甲醇、乙醇、丙酮中的一种或几种的组合物。

7.如权利要求5所述的一种培美曲塞脂质体的制备方法，其特征在于：

所述透析过程在截留分子量为1000的透析袋中完成；

步骤六中的透析过程采用的透析液为生理盐水，透析后的混合溶液pH为4.5-5.5；

步骤八中的透析过程采用的透析液为PBS溶液。

8.如权利要求5所述的一种培美曲塞脂质体的制备方法，其特征在于：

在步骤七中，所述培美曲塞水溶液与所述透析后的混合溶液的体积比为1：1-4；

优选的，在步骤七中，将所述培美曲塞水溶液加入所述透析后的混合溶液后，其浓度变为初始浓度的1/5-1/2；

优选的，所述培美曲塞水溶液的质量浓度为1-10mg/ml。

9.如权利要求5所述的一种培美曲塞脂质体的制备方法，其特征在于：

所述脂质体混合物由HSPC、chol、TPGS组成；

其中，所述HSPC、chol、TPGS的质量比为44-50：40-45：5-15；

优选为HSPC、chol、TPGS的质量比为47.4：42.6：10。

10.如权利要求5所述的一种培美曲塞脂质体的制备方法，其特征在于：

所述制备方法还可应用于水溶性的弱酸性靶向药物、抗肿瘤药物的脂质体的制备。