CN104540529A - 具有磁功能性的化合物、得自其的植入物或凝胶以及二者用于测量酶的酶活性的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种包含至少一种具有磁功能性的化合物的植入物或凝胶，所述化合物进而包含参与再生细胞外基质的至少一种酶的底物和多个磁性粒子。本发明还涉及具有磁功能性的化合物，所述化合物包含参与再生细胞外基质的至少一种酶的底物和多个磁性粒子，优选地不具有涂层或表面修饰，或者用羧基基团官能化，所述化合物用于制备监测参与再生细胞外基质的酶活性的植入物或凝胶。所述底物优选地选白包括胶原、硫酸软骨素和透明质酸的组，并且所述磁性粒子是超顺磁性粒子。

Description

具有磁功能性的化合物、得自其的植入物或凝胶以及二者用于测量酶的酶活性的用途

发明领域

本发明一般涉及包含至少一种具有磁功能性的化合物的植入物或凝胶。这些植入物或凝胶可以用于通过测量至少一种具有磁功能性的化合物的磁性质、一种或多种其降解产物的磁性质或二者上的变化，从而测量与细胞基质再生相关的酶活性。

另外，本发明还涉及具有磁功能性的新化合物，其包含至少一种酶的底物，优选胶原、硫酸软骨素或透明质酸，和不具有涂层或表面修饰、或用羧酸基团官能化的多个磁性粒子。

发明背景

酶是催化化学反应的蛋白质。在酶反应中，将酶在其上起作用的分子称为底物，并且所述分子由酶转化为称为代谢物的不同分子。酶通常对其所催化的反应和底物非常有特异性。

酶的重要性体现为这样的事实：由体内存在的上千种类型的酶中的单一类型的酶的功能失调可能引起致命的疾病。

一些临床病症，如组织再生中的不稳定的斑块、转移或变异，与酶的紊乱有关。

大部分生物材料是抗磁性的；换言之，其具有负的磁化率。与生物来源的大分子结合的磁性粒子可以产生与所述生物来源的大分子不同的磁性特征。该磁性特征基于所述粒子的组成、尺寸和形状。给定材料的磁化强度定义为其每体积单位的平均磁矩，并且由该材料的内部结构和组成决定。磁性粒子的实例包括顺磁性、超顺磁性和铁磁性粒子，其通常以单个粒子、微包封在基质中或与其他分子结合的形式作为造影剂使用。这些磁性造影剂设计为在整个检测过程中保持其磁性质恒定，并且依据其在机体中的不同组织和区室中的浓度和分布产生成像作用。磁性粒子的分布中的一些因素，如在表面的聚集或涂布，可以影响其所产生的造影效应。

目前，可能与紊乱或疾病相关的酶过程的检测和/或追踪通常通过组织活检、提取或间接法(如酶和代谢物水平估测)进行。目前，对于开发允许在原位追踪酶活性、不需要从所研究的机体取样、使用使得机体不被触及的非侵入性检测方法的产品存在需要。

在本专利申请中，“具有磁功能性的化合物”定义为具有赋予导致其磁性质、一种或多种其降解产物的磁性质或二者的可检测的变化的构象或结构变化的能力的化合物。

专利申请US 2011/0182815 A1(Daich，J.)记述了使用经修饰具有磁功能性的底物的诊断方法。这些底物由其与磁性粒子的组合获得，使得因为所述底物具有磁功能性并且由所感兴趣的酶消化，在磁性粒子的分布中出现可检测到的变化。然而，专利申请US 2011/0182815 A1仅提及药物制剂，其包括静脉内和包封方法作为修饰以具有磁功能性的这些底物的递送形式，其不能有效地到达一些类型的结缔组织，如各种关节软骨。该专利申请的实施例仅提及使用一些蛋白质作为底物用于获得具有磁功能性的化合物，未提及参与并且实现如水合、挠性和促进细胞外基质的再生的功能的其他成分，如糖胺聚糖的使用。这些功能对于细胞外基质是特别重要的，并且对于结缔组织也是特别重要的。用于修饰底物以获得该申请的化合物的方法限于在前者中羧基基团的存在，由此排除了大量不具有所述可用于修饰的羧基基团的底物。后者包括上文所讨论的糖胺聚糖。

另一方面，专利申请US 2011/0182815 A1中记述的具有磁功能性的化合物和用于获得其的方法是基于具有表面修饰的磁性粒子的使用，所述表面修饰增强所述磁性粒子对所感兴趣的底物的锚定性。所述表面修饰用抗磁性材料进行，导致这些具有表面修饰的粒子在其设置中产生的磁场的强度和范围上的减小。因此，当将所述表面修饰加入至磁性粒子时，不同粒子的磁矩之间的相互作用可能减小，并且这些事件对于如在前文提及的美国专利申请中提出的检测方法如磁共振成像中所用的测量类型是不利的。

专利申请WO 2011/075476 A1(Bennet K.，2011)记述了使用磁共振成像(MRI)技术评估生物相容的水凝胶的分子结构的方法。为了该目的，其记述了包含生物相容性氢和磁性造影剂的凝胶。该凝胶可以植入体内，从而可以通过MRI测量作为所述水凝胶与细胞外基质细胞的相互作用或酶作用的结果的造影剂中所包含的磁性粒子的崩解。具体地，该文献公开使用阳离子化的铁蛋白作为造影剂。该化合物通过在前文提及的水凝胶的结构中存在的阴离子基团结合至水凝胶。在该申请中，与本申请不同，反复使用术语“聚集”来定义粒子在凝胶中的固定或固着，其不涉及按原样形成粒子聚集物。

此外，记述了向凝胶中加入酶前体以延长凝胶分解速度。然而，由于该分解是活化预先植入的酶前体的级联反应的结果而不是目标酶的结果，该方法失去了强度的精确性和研究的酶活性对象的持久性。

发明简述

本发明涉及包含至少一种具有磁功能性的化合物的植入物或凝胶，所述化合物进而包含参与细胞外基质再生的至少一种酶的底物和多个磁性粒子。

在专利申请US 2011/0182815 A1中，没有提及或暗示使用修饰的底物制造植入物或凝胶，并且也没有在监测结缔组织中的酶活性中提及或暗示使用所述植入物。与该美国专利申请中包含的公开内容不同，植入物或凝胶的使用允许在相同的植入物或凝胶中发生酶反应，即，以局部的预先确定的基础发生。

目前存在一些类型的结缔组织植入物。这些植入物通常包括生物相容性材料，并且甚至可以是来自活体的组织提取物或通过培养技术产生。这些植入物的治疗用途是高度多样性的，包括，例如，在关节或正牙术中的结缔组织再生中的替代。这些植入物的主要治疗作用是支持、替换或引起接受体组织的再生。目前还没有用于由通过接受体产生的成分原位追踪内部植入物的整合或其组成成分的再生的非侵入性方法。

另一方面，该专利申请中所述的包含至少一种具有磁功能性的化合物的凝胶足以用于体外分析，并且可以另外包括与植入物相同的生物相容性材料。所述凝胶通常用于模拟细胞外基质环境，并且在研究和诊断中具有多种应用。

在另一方面，本发明涉及一种具有磁功能性的化合物，其包含参与细胞外基质再生的至少一种酶的底物和多个用于制造植入物或凝胶的磁性粒子，所述植入物或凝胶用于监测在人类或另外的活体中参与细胞外基质再生的酶活性。

另外，本发明还涉及所述具有磁功能性的化合物在制造用于监测在人类或另外的活体中参与细胞外基质再生的酶活性的植入物或凝胶的用途。在放置本发明中所述的植入物后，其中所包含的具有磁功能性的化合物可以与参与细胞外基质再生的至少一种酶反应，引起其磁性质中、一种或多种其降解产物的磁性质中或二者中的可测量的变化。因此，本发明提供允许监测所述植入物中的细胞外基质再生而无需进行组织活检的植入物。

本发明还涉及具有磁功能性的化合物，其包含至少一种酶的底物和多个磁性粒子，所述化合物特征在于：

i)所述磁性粒子不具有任何涂层或表面修饰，

或

ii)所述磁性粒子用羧基基团官能化。

在施用本发明的具有磁功能性的化合物后，该化合物可以与至少一种酶反应，引起其磁功能性的可测量的变化。因此，本发明具有磁功能性的化合物可以用于酶活性，特别是参与细胞外基质再生的酶活性的检测。

本发明的另一个目的是还提供一种用于获得具有磁功能性的化合物的有利方法，在所述化合物中磁性粒子不具有任何涂层或表面修饰，该方法包括：

a)修饰至少一种酶的底物，和

b)在阶段a)中获得的修饰的化合物中固定多个磁性粒子，所述磁性粒子不具有任何涂层或表面修饰。

与本领域中已知的磁性粒子被涂覆或具有一些表面修饰的其他方法不同，本发明用于获得具有磁功能性的化合物的方法允许酶的底物与几乎完全是磁核的磁性粒子结合。

在本发明的优选的实施方案中，所述磁性粒子是超顺磁性粒子。

在本发明的其他优选的实施方案中，所述底物可以选自由下述组成的组：蛋白质、修饰的蛋白质、多肽、修饰的多肽、糖蛋白、糖胺聚糖以及它们的混合物，更优选地所述底物选自由胶原、硫酸软骨素和透明质酸组成的组。

另外，本发明还涉及具有磁功能性的化合物，所述化合物包含至少一种酶的底物和多个不具有涂层或表面修饰的磁性粒子，其中所述具有磁功能性的化合物是通过本申请所述的方法获得的。优选地，所述磁性粒子是磁铁矿的纳米粒子，并且所述底物可以选自由胶原、硫酸软骨素和透明质酸组成的组。

本发明还涉及包含至少一种具有磁功能性的化合物的产品，所述化合物还包含至少一种酶的底物和多个磁性粒子，其中

i)所述磁性粒子不具有任何涂层或表面修饰，或

ii)如本专利申请所述，所述磁性粒子用羧基基团官能化，其中所述产品选自由下述组成的组：植入物、凝胶、药物组合物和造影剂。

优选地，本发明涉及选自由植入物和凝胶组成的组的产品，并且其包含至少一种具有磁功能性的化合物，所述化合物进而包含具有参与细胞再生过程的至少一种酶的底物和多个磁性粒子，其中i)所述磁性粒子不具有任何涂层或表面修饰，或ii)如本专利申请所述，所述磁性粒子用羧基基团官能化。在再更优选的实施方案中，所述底物选自由下述组成的组：胶原、硫酸软骨素和透明质酸，并且所述磁性粒子是不具有涂层或表面修饰的磁铁矿纳米粒子。

本发明还涉及所述具有磁功能性进而包含至少一种酶的底物和多个磁性粒子的化合物在制备本专利申请中所述的确定一种或多种酶的酶活性的产品中的用途，其中i)所述磁性粒子不具有任何涂层或表面修饰，或ii)如本专利申请所述，所述磁性粒子用羧基基团官能化。优选地，用于检测与至少一种酶的酶活性相关的疾病或紊乱。

另外，本发明还涉及具有磁功能性进而包含至少一种酶的底物和多个磁性粒子的化合物在制备本专利申请中所述的检测参与人类或另一种活体中的细胞外基质再生的酶活性的植入物或凝胶中的用途，其中i)所述磁性粒子不具有任何涂层或表面修饰，或ii)如本专利申请所述，所述磁性粒子用羧基基团官能化。

发明详述

在其他原理中，本发明利用这样的事实：磁性材料的性质来源于其成分的分布和形状。如果这两种特征中的任一种能够通过酶活性改变，则其可以基于磁性质的测量进行检测。进行这种检测的形式是激发作为酶活性的结果的颗粒聚集。为了首先理解磁性粒子聚集的作用，给出了可以形成它们的不同类型的磁性材料的性质的一般描述。

铁磁性材料通常含有过渡金属，如铁(Fe)、镁(Mg)、锰(Mn)、钴(Co)、镍(Ni)、锌(Zn)和铜(Cu)。铁磁性材料的特征还在于，它们由称为磁畴的约10¹⁷至10²¹个原子的组形成，所述组都具有指向相同方向的磁矩(或自旋布居)。在未被磁化的材料中，磁畴的磁矩随机指向，并且在磁化的材料中，磁畴指向优选的方向。与在类似情形中失去其优选的磁化方向的顺磁性、超顺磁性和抗磁性材料相比，铁磁性材料当移除外部磁场时继续被磁化的能力是一种特有的因素。

如果其处在低于所谓的居里温度，即低于该温度自旋以顺着磁场或逆着磁场的稳定方式排列的过渡温度，在移除磁场之后，一些顺磁性材料可以表现出永久的、稳定的磁化。这些材料称为反铁磁性的，并且，由于两种自旋取向没有抵消，显示出所得到的磁化作用。当高于居里温度时，由于当将外部磁场移除时自旋相互作用减弱，热运动足以使自旋获得随机的取向，并且因此消除了永久的磁化。所有基于磁铁矿形成的铁粒子在生理温度(铁粒子的过渡温度接近850Kelvin)具有亚铁磁性或铁磁性的性质。

超顺磁性材料可以由大批量(in bulk)具有铁磁性性质的材料的单个磁畴形成。它们的磁化率，即材料响应磁场的磁化程度，在铁磁性材料与顺磁性材料的磁化率之间。超顺磁性材料在外部磁场的作用下表现为铁磁性材料，但其在不存在外部磁场时具有顺磁性特征。这些超顺磁性材料通常由纳米结晶粒子形成，并且宏观上具有铁磁性质或纳米复合磁体的性质。

各向异性概念对于理解超顺磁性是重要的。很多按序排列的顺磁性离子的自旋相互作用，以致当置于外场中时，所得到的磁化作用是朝向所有方向的，即，是各向同性的。当自旋耦合相对于外部磁场以任意方向排列时，那么认为磁化作用是各向异性的。例如，对于磁铁矿晶体，存在六个取向轴。因此，在磁场作用下，结果将是六个取向，每个具有不同的能量值。当取向与外场平行时，出现最小的能量，当取向是反向平行的时，具有最大的能量。

温度对超顺磁性材料的磁性具有不稳定化作用。热能避免超顺磁性粒子中存在的磁矩的对齐。在移除所施加的磁场后，超顺磁性材料的磁矩仍然存在，但是由温度诱导的快速运动使其不重合。在生物系统的温度和在磁共振成像(MRI)过程中施加的磁场中，超顺磁性材料较其铁磁性同系物更不易被磁化。

一些磁性质，例如，亚铁或铁磁性，宏观尺度上由磁畴的协同行为产生，并且它们不是形成所述材料的分子或离子所固有的。这些性质是分子或离子之间的相互作用的结果，并且因此，预测、控制和调节固态结构的方法与理解和管理该行为有关。

一些纳米材料，如胶状悬浮液中的磁铁矿纳米粒子，在宏观尺度，无论是大块的还是单个粒子，表现出与其固态所不同的性质。对于由直径大于15nm的大晶体形成的材料，自旋是对齐的，并且细分为称为外斯磁畴的小磁畴。不同自旋的方向倾向于以沿着各向异性轴的相同方向对齐排列；这导致达到各向异性能的最低值，并且系统可以被认为是各向同性的。这解释了为获得永久磁性的目的，铁磁性晶体，例如，磁铁矿，必须通过将其放置在外场中而磁化的原因。如果磁性材料的晶体小于外斯磁畴，则可以观察到超顺磁性。为使自旋从一个各向异性轴进入另一个各向异性轴，需要等于所需要的跃迁的能量输入。各向异性能已知为KV，其中K是各向异性常数，V是晶体体积。数个结晶粒子之间的距离影响KV值，因为彼此非常接近的晶体能够允许引起KV增加的自旋之间的相互作用。自旋的方向沿着所施加的外场的轴的转动定义为Néel弛豫时间，并且是晶体的热扰动的结果。Néel弛豫(TN)可以如下表述：

${\mathrm{\τ}}_N={\mathrm{\τ}}_0{e}^{\frac{\mathrm{KV}}{\mathrm{kT}}}$

其中k是波尔兹曼常数，T是介质的恒定温度，并且T₀是常数。对于大的晶体，Néel弛豫时间非常长，并且可以认为磁矩封闭在各向异性易磁化轴处。对于直径小于6nm的晶体，传播是快速的，以纳秒级别传播。对于在液体介质中的小的铁磁性晶体，不仅Néel弛豫时间调节波动，而且晶体的运动也调节。系统的Brownian或平均旋转时间等于：

${\mathrm{\τ}}_r=\frac{4\mathrm{\π\α}3\mathrm{\η}}{3\mathrm{kT}}$

其中α是粒子的半径，η是液体的粘度。对于顺磁性晶体的系统，所得到的磁化强度由以下关系给出：

$M=M_{\mathrm{sat}}\·L\left(\mathrm{\α}\right),L\left(\mathrm{\α}\right)=\coth \left(\mathrm{\α}\right)-\frac{1}{\mathrm{\α}},\mathrm{\α}=\mathrm{\μ}\frac{B_0}{\mathrm{kT}}$

其中B₀是外部磁场，μ是晶体的总磁性动量，M_sat定义沿低能量轴的磁化强度或饱和的闭合场。超顺磁性粒子具有比与形成晶体的离子相关的单个磁矩高得多的磁矩，原因在于这样的事实：不存在外场时，归因于晶体的Néel弛豫的平均值和粒子旋转，粒子的平均磁矩为0。

本发明是基于这样的事实，即，磁性纳米粒子的磁性行为依赖于它们之间的距离，并且差异在实验上是可测量的。固定在基质中或大分子中的这些磁性纳米粒子之间距离依赖于该支撑体的完整性。如果该完整性受水解作用的影响，例如，并且通过由于所述作用，磁性粒子将会聚集，这将产生与由存在于基质中或未改变的分子中的粒子所获得的磁信号所不同的磁信号。

本发明涉及包含至少一种具有磁功能性的化合物的植入物或凝胶，所述化合物还包含参与细胞外基质再生的至少一种酶的底物和多个磁性粒子，条件在于，当所述植入物或凝胶包含多于一种具有磁功能性的化合物时，这些化合物位于不同的区域。

优选地，如本专利申请所述，当所述植入物或凝胶包含多于一种具有磁功能性的化合物时，这些化合物排列在所述植入物或凝胶的分开的区域中。使用包含多于一种各自包含不同的底物的具有磁功能性的化合物的植入物或凝胶可以允许不同酶的同时追踪。

为了本发明的目的，“多个磁性粒子”定义为多于一种非抗磁性粒子，还将“粒子”定义为微米或更小尺寸的分子或离子的组合，优选如晶体一样有序，优选地具有直径低于100nm的尺寸。

另一方面，在本发明中，“具有磁功能性的化合物”定义为具有引起导致其磁性质、一种或多种其降解产物的磁性质或二者上的可测量的变化的构象或结构变化的能力的化合物。

具有磁功能性的化合物在凝胶的制备或暴露于生理条件的过程中必须保留它们的功能性质。这可以在所述具有磁功能性的化合物的制备过程中通过磁性粒子、更优选是磁性纳米粒子与底物通过共价键的结合实现。在本发明的一些优选的实施方案中，其中所述磁性粒子倾向于聚集，通过共价键制备具有磁功能性的化合物是特别有利的。

在优选的实施方案中，本发明的植入物或凝胶包含具有磁功能性的化合物，所述化合物还包含多个与参与细胞外基质再生的至少一种酶的底物通过共价键结合的磁性粒子。

在另一个优选的实施方案中，本发明涉及包含具有磁功能性的化合物的植入物或凝胶，所述化合物进而包含参与细胞外基质再生的至少一种酶的底物和多个磁性粒子，如本专利申请所述。

在另一个优选的实施方案中，本发明涉及包含至少一种具有磁功能性的化合物的植入物或凝胶，所述化合物进而包含参与细胞外基质再生的至少一种酶的底物和多个磁性粒子，如本专利申请所述，其中所述磁性粒子是超顺磁性粒子。优选地，所述超顺磁性粒子可以是铁氧体的纳米粒子，例如，磁铁矿，磁赤铁矿，钴铁氧体，银或镁的纳米粒子。

这些优选的磁性粒子允许与底物的共价键合。另外，它们可以在生理pH下聚集。

在甚至更优选的实施方案中，超顺磁性粒子是磁铁矿纳米粒子，并且特别优选的是所述磁铁矿纳米粒子具有小于15nm的直径。

在另一个优选的实施方案中，本发明涉及包含至少一种具有磁功能性的化合物的植入物或凝胶，所述化合物进而包含参与细胞外基质再生的至少一种酶的底物和多个磁性粒子，如本专利申请所述，其中所述底物可以选自由下述组成的组：蛋白质、修饰的蛋白质、多肽、修饰的多肽、糖蛋白、糖胺聚糖以及它们的组合。

优选地，该底物与至少一种金属依赖性的酶反应。在更优选的实施方案中，该酶选自由蛋白酶、氧化酶和硫酸酯酶组成的组。甚至更优选地，该酶选自由透明质酸酶和金属蛋白酶组成的组。

在特别优选的实施方案中，包含在本专利申请所述的具有磁功能性的化合物中的底物与作为基质金属蛋白酶(MMP)的至少一种酶反应，并且特别优选的是所述酶选自由胶原酶和明胶酶组成的组。

在甚至更优选的实施方案中，本发明涉及包含至少一种具有磁功能性的化合物的植入物或凝胶，所述化合物还包含参与细胞外基质再生的至少一种酶的底物和多个磁性粒子，如本专利申请所述，其中所述底物可以选自由下述组成的组：胶原、肌原纤蛋白、弹性蛋白、层粘连蛋白、骨钙素、硫酸软骨素、透明质酸、骨结合素、骨桥蛋白、明胶以及它们的组合。优选地，所述底物可以选自由胶原、硫酸软骨素和透明质酸组成的组。

在特别优选的实施方案中，所述植入物或凝胶包含具有磁功能性的化合物，所述磁性粒子是超顺磁性粒子，优选磁铁矿纳米粒子，并且所述底物可以选自由胶原、硫酸软骨素和透明质酸组成的组。甚至更优选地，磁铁矿纳米粒子通过共价键与所述底物结合。

本发明还涉及具有磁功能性的化合物，所述化合物包含参与细胞外基质再生的至少一种酶的底物和多个磁性粒子，所述化合物用于制造监测参与细胞外基质再生的酶活性的植入物或凝胶。当所制造的产品是植入物时，这可以用于监测人类或另一种活体中参与细胞外基质再生的酶活性。另一方面，当所制造的产品是凝胶时，这可以用于在体外监测参与细胞外基质再生的酶活性。

优选地，所述磁性粒子可以是超顺磁性粒子，并且更优选地是磁铁矿纳米粒子。

在优选的实施方案中，用于制造所述的植入物或凝胶的所述具有磁功能性的化合物还包含与参与细胞外基质再生的至少一种酶的底物通过共价键结合的多个磁性粒子。

在另一个优选的实施方案中，如上段中所述的包含在用于制造前段所述的植入物或凝胶的具有磁功能性的化合物中的底物可以选自由下述组成的组：蛋白质、修饰的蛋白质、多肽、修饰的多肽、糖蛋白、糖胺聚糖以及它们的组合。

在甚至更优选的实施方案中，本发明涉及具有磁功能性的化合物，如本专利申请所述，所述化合物包含参与细胞外基质再生的至少一种酶的底物和多个磁性粒子，其中所述底物可以选自由下述组成的组：胶原、肌原纤蛋白、弹性蛋白、层粘连蛋白、骨钙素、硫酸软骨素、透明质酸、骨结合素、骨桥蛋白、明胶以及它们的组合。优选地，所述底物可以选自由胶原、硫酸软骨素和透明质酸组成的组。

在特别优选的实施方案中，所述磁性粒子是超顺磁性粒子，优选磁铁矿纳米粒子，并且所述底物可以选自由胶原、硫酸软骨素和透明质酸组成的组。甚至更优选地，磁铁矿纳米粒子通过共价键与所述底物结合。

胶原具有复杂的结构。其前体蛋白(单体)被称为原胶原，并且长度为约300纳米，直径为1.4nm。原胶原由三条称为α链的多肽链形成，所述三条多肽链进而交联形成三螺旋结构。每条α链是由全部包含甘氨酸氨基酸的三联体重复形成的多肽，并且非常富含脯氨酸和羟脯氨酸。羟脯氨酸占胶原残基总组成的10-12％，该百分数取决于胶原的类型。每条链具有大约100,000Da的分子量。

存在由其α链组成的差异决定的不同类型的胶原：

I型胶原：大量存在于真皮、骨骼、腱和角膜中。其以直径为20至100nm的带条纹的纤丝存在，组合在一起形成更大的胶原纤维。其较大的亚基由两种类型的α链形成，它们在其氨基酸组合和在它们的序列上略有不同。它们中的一种称为α1链，并且另一种称为α2链。其由成纤维细胞、成软骨细胞和成骨细胞合成。其主要功能是抗拉伸性。

II型胶原：特别位于软骨中，但也存在于胚胎角膜中和在脊索中，髓核中和眼睛的玻璃体液中。在软骨中，其形成10至20纳米的细纤丝，但是在其他微环境中，其可以形成较大的纤丝，该较大的纤丝在形态上不能与I型胶原区分开来。这些由三条单一类型的α2链形成。其由成软骨细胞合成。其主要功能是对间断性压力的抗耐性。

III型胶原：大量存在于疏松结缔组织中，在血管壁、皮肤真皮和一些腺体的间质中。其表现为传统上称为网状纤维的50纳米的纤维的主要成分。其由单一种类的α3链形成。其由平滑肌细胞、成纤维细胞、神经胶质合成。其功能是支撑扩张的器官。

IV型胶原：其是形成上皮之下的基膜的胶原。其是纤丝中未聚合，而是形成随机取向的分子的过滤器的胶原，与蛋白聚糖和结构蛋白质层粘连蛋白和纤连蛋白缔合。其由上皮和内皮细胞合成。其主要功能是支撑和过滤。

V型胶原：存在于大部分间质组织中。其与I型缔合。

VI型胶原：存在于大部分间质组织中。其是细胞在其环境中的锚定地。其与I型缔合。

VII型胶原：位于基膜中。

VIII型胶原：存在于一些内皮细胞中。

IX型胶原：位于成熟的关节软骨中。其与II型相互作用。

X型胶原：存在于肥大的和矿化的软骨中。

XI型胶原：位于软骨中。其与II和IX型相互作用。

XII型胶原：存在于承受高压的组织中，诸如腱和韧带中。其与I和III型相互作用。

XIII型胶原：广泛作为与细胞膜缔合的蛋白质存在。其与I和III型相互作用。

XIV型胶原：非纤丝化，并且与XII型非常相似，其存在于胎儿表皮和腱中。

胶原，事实上，是基质金属蛋白酶(MMP)家族的一些酶的底物，所述酶实现组织构建和再生中的一些主要的功能。因此，在体内确定所述酶(通常称为胶原酶)的溶胶原活性具有极大的临床和科学意义。一些MMP的溶胶原活性部分来源于其依赖于钙和锌的三级结构。它们比原胶原小，并且具有三个不同的区域。称为前肽的一个具有与胶原链结合的能力。称为催化剂的另一个增强三股胶原螺旋的展开。第三个区域是末端羧基端，并且包括四个β层，其像螺旋桨一样工作，在α螺旋中的三条链解体的过程中推进所述酶。所释放出的α链易于由其他酶，如胃蛋白酶和胰蛋白酶消化。

用于检测这些所感兴趣的酶，即具有溶胶原活性的酶的活性的目的，需要也有必要使得用作底物的胶原在将磁性粒子固定在残留的表面上的过程中、以及在包含所述具有磁功能性的化合物的植入物或凝胶的制造过程中保持其三螺旋三级结构。

硫酸软骨素和透明质酸二者都是存在于结缔组织中的糖胺聚糖，并且其分解代谢是结缔组织再生的信号。硫酸软骨素或软骨素硫酸酯由一条N-乙酰半乳糖胺和N-葡糖醛酸交替的二糖链形成。这通常与形成具有高分子量的称为蛋白聚糖的聚集物的蛋白缔合。软骨素链可以由多于100个单个的糖形成，每个糖可以在不同的位置以不同的数目硫酸化。硫酸软骨素给软骨提供其机械和弹性性质，并且给该组织提供其抗压缩性中的很多。其被一组称为硫酸酯酶的酶消化。

透明质酸表现出如同硫酸软骨素的结构功能。具有粘性构造，其存在于多种生物体的滑膜、玻璃体液和结缔组织中，并且是关节内稳态中重要的糖蛋白。在人类中，其主要集中在关节、软骨和皮肤中。在体重70kg的常人中，在体内可能存在总量为15g的透明质酸，并且其中每天分解并且合成三分之一。其由复杂的碳水化合物链形成，具体地为每分子约50，000个N-乙酰葡糖胺和葡糖醛酸的二糖，并且来源于氨基糖和糖醛酸的结合。该链排列形成具有200至400万的平均分子量的螺旋。在溶解时其表现出保持大量的水并且采用延伸形式的性质，因此它们可用于缓冲或润滑。这些性质归因于该分子的大量的羟基和负电荷获得，其通过建立排斥力而允许碳水化合物链彼此保持相对分离。

透明质酸酶是水解细胞外基质中的透明质酸的酶。

本发明还涉及本专利申请所述的具有磁功能性的化合物在制造用于监测参与细胞外基质再生的酶活性的植入物或凝胶中的用途。优选地，用于监测作为结缔组织、骨骼或器官组织的一部分的细胞外基质的再生。

在另一个优选的实施方案中，所述具有磁功能性的化合物可以用于制造监测植入物在人类或另一种活体中的生物整合作用的植入物或凝胶。如果所述具有磁功能性的化合物包含在本专利申请中所述的凝胶中，这可以用来监测植入物的生物整合作用。另一方面，如果所述具有磁功能性的化合物被包含在本专利申请所述的植入物中，这优选地可以用于监测所述植入物的生物整合作用。

另外，本发明还涉及包含至少一种具有磁功能性的化合物的植入物，所述化合物还包含参与细胞外基质再生的至少一种酶的底物和多个磁性粒子，如本专利申请所述，所述植入物用于监测结缔组织的再生和/或植入物的生物整合作用。优选地，所述底物选自由胶原、硫酸软骨素和透明质酸组成的组，并且磁性粒子是超顺磁性粒子。甚至更优选地，磁铁矿纳米粒子通过共价键结合至所述底物。

此外，本发明还涉及包含至少一种具有磁功能性的化合物的凝胶，所述化合物进而包含参与细胞外基质再生的至少一种酶的底物和多个磁性粒子，如本专利申请所述，所述凝胶用于监测结缔组织的再生。优选地，所述底物选自由胶原、硫酸软骨素和透明质酸组成的组，并且所述磁性粒子是超顺磁性粒子。甚至更优选地，磁铁矿纳米粒子通过共价键结合至所述底物。

使用本专利申请所述的包含至少一种具有磁功能性的化合物的植入物不仅可用于评估结缔组织的再生，而且用于追踪治疗性植入物，其中预测细胞外基质从头重新出现。

本发明适于用于监测结缔组织再生的植入物对象可以是用于注射的凝胶、放置在要再生的组织表面的贴片或敷料或作为移植物。存在几种类型的结缔组织植入物，其常规用在临床上或者在研发过程中。这些植入物通常包含永久生物相容性的和生物可降解性的材料的组合。这些生物可降解的材料通常包括通过培养、遗传重组或提取技术产生的细胞外基质的成分。由接受体产生的内源物质对所述植入物的成分的分解、整合和相关的替代通常与间充质细胞和成纤维细胞的侵入有关。

如上文提及，本发明的凝胶对象足以用于在体外监测结缔组织再生，并且可以包含在前述段落中关于所述植入物所提及的相同的材料。

所述生物相容性、生物可降解性的材料的实例是聚乳酸、聚乙交酯、聚已酸内酯、聚酸酐、聚酰胺、聚氨酯、聚酯酰胺、聚原酸酯、聚二烷酮、聚缩醛、聚缩醛、聚碳酸酯、聚原碳酸酯、聚膦腈、聚羟基丁酸酯、聚羟基戊酸酯、聚烯基草酸酯、聚烯基琥珀酸酯、聚(苹果酸)、聚(氨基酸)、聚(乙烯基甲基醚)、聚(马来酸酐)、壳多糖、壳聚糖，以及它们的共聚物、三元共聚物或更高级聚单体的聚合物或它们的组合或它们的混合物。

可以包含在本发明的植入物或凝胶中的其他聚合物可以包含选自下述的一个或多个重复单元：线性(硅氧烷基)烷基甲基丙烯酸酯、支链的(硅氧烷基)烷基(甲基)丙烯酸酯、环(硅氧烷基)烷基(甲基)丙烯酸酯、含有硅酮的(甲基)丙烯酸酯、含有氟化物的(甲基)丙烯酸酯、含有羟基的(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸、N-(甲基)丙烯酰吡咯烷酮、(甲基)丙烯酰胺、氨基烷基(甲基)丙烯酸酯、含有烷氧基的(甲基)丙烯酸酯、含有芳香基的(甲基)丙烯酸酯、缩水甘油基(甲基)丙烯酸酯、四氢糠基(甲基)丙烯酸酯、含有硅酮的苯乙烯衍生物、含有氟化物的苯乙烯衍生物、苯乙烯衍生物和乙烯基单体。

生物相容性材料的优选实例包括下述各项，但不排除其他材料：纤维蛋白胶、聚乙醇酸、聚乳酸、聚氧化乙烯凝胶、海藻酸盐或海藻酸钙凝胶、聚-(甲基丙烯酸2-羟乙基酯)、聚-原酸酯、聚酸酐、壳聚糖、明胶、琼脂糖和其他生物可吸收和生物相容性材料。在其他形式的实施方案中、所述植入物或凝胶可以包含琼脂、琼脂糖、结冷胶(gellan gum)、阿拉伯胶、黄原胶、角叉胶、海藻酸盐、膨润土、蔗聚糖、普卢兰尼克多元醇(Pluronicpolyols)、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙二醇、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基壳聚糖聚-2-羟乙基-甲基丙烯酸酯、聚乳酸、聚乙醇酸、明胶、塑料或它们的任意组合。聚(甲基丙烯酸2-羟乙基酯)(pHEMA)的水凝胶是本领域技术人员已知的，并且已经用作生物相容性的凝胶。多糖是一类通式为(CH₂O)_n的大分子，其也可在用作本发明中的植入物或凝胶的材料。多糖包括一些天然来源的化合物，例如，琼脂糖、海藻酸盐和壳聚糖。琼脂糖是一种由多糖形成的透明的热可逆性的水凝胶，所述多糖主要是1，4连接的和3，6-无水，α-L-半乳糖和1，3连接的β-D-半乳糖的交替共聚物。

制备所述植入物或凝胶的一种优选的形式是通过细胞外基质的成分的糖化或交联。在本发明的优选的实施方案中，使用I型、II型胶原或二者的组合，以1％至5％范围内的浓度溶解在乙酸中，与核糖或葡萄糖混合，在pH 7.4稳定化，并在4℃在磷酸盐溶液中温育，并且在37℃胶凝。在胶凝之前，可以在任意阶段的过程中加入本专利申请中所述的具有磁功能性的化合物的稳定的悬浮液。在本发明的再更优选的实施方案中，在胶凝阶段之前，加入在1％至5％的浓度范围内的硫酸软骨素或透明质酸，并且透明质酸可以预先通过交联稳定化。

在本发明的具体的实施方案中，所述凝胶还可以包含生物或合成的水凝胶，包括海藻酸盐、交联的海藻酸盐、纤维蛋白胶、纤维蛋白凝块、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、琼脂糖、壳多糖、壳聚糖、纤维素、多糖、聚(氧化烯)、聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)的共聚物、聚(乙烯醇)、聚丙烯酸酯、富含血小板的血浆(PRP)凝块、缺乏血小板血浆(PPP)凝块或它们的混合物。

此外，本发明还涉及具有磁功能性的化合物，所述化合物包含参与细胞外基质再生的至少一种酶的底物和多个磁性粒子，其用于制造本专利申请所述的植入物，所述植入物用于监测人类或另一种活体中在所述植入物中参与细胞外基质再生的酶活性。优选地，用于监测结缔组织的再生和/或植入物的生物整合。

在优选的实施方案中，本发明涉及具有磁功能性的化合物，所述化合物包含选自由胶原、硫酸软骨素和透明质酸组成的组的底物和多个磁性粒子，所述化合物用于监测人类或另一种活体中在所述植入物中参与细胞外基质再生的酶活性。优选地，用于监测结缔组织的再生和/或植入物的生物整合。

本发明还涉及监测细胞外基质再生、优选监测结缔组织再生的方法，所述方法包括使用如本专利申请所述的包含至少一种具有磁功能性的化合物的植入物或凝胶，所述化合物还包含参与细胞外基质再生的至少一种酶的底物和多个磁性粒子。优选地，所述磁性粒子通过共价键与所述底物结合。

在优选的实施方案中，本发明涉及监测细胞外基质再生、优选监测结缔组织再生的方法，所述方法包括使用如本专利申请所述的包含至少一种具有磁功能性的化合物的植入物或凝胶，所述化合物进而包含选自由胶原、硫酸软骨素和透明质酸组成的组的底物和多个超顺磁性粒子。

本发明还涉及监测植入物在人类或另一种活体中的生物整合的方法，如本专利申请所述，所述方法包括使用具有磁功能性的化合物，所述化合物还包含参与细胞外基质再生的至少一种酶的底物和多个磁性粒子，如本专利申请所述。优选地，所述磁性粒子通过共价键结合至所述底物。

另外，本发明还涉及具有磁功能性的化合物，所述化合物包含至少一种酶的底物和多个磁性粒子，其特征在于：

i)所述磁性粒子不具有任何涂层或表面修饰，

或

ii)所述磁性粒子用羧基基团官能化。

本发明的具有磁功能性的化合物允许确定一种或多种酶的酶活性，原因在于这种活性引起其磁性质中、其一种或多种分解产物的磁性质中或二者中的可测量的改变。

优选地，如i)或ii)所述的磁性粒子通过共价键结合至所述底物。

在优选的实施方案中，本发明涉及具有磁功能性的化合物，所述化合物包含至少一种酶的底物和多个磁性粒子，如本专利申请所述，其中所述磁性粒子是超顺磁性粒子。优选地，所述超顺磁性粒子可以是铁氧体纳米粒子，例如，磁铁矿，磁赤铁矿，钴铁氧体，银或镁。

在甚至更优选的实施方案中，所述超顺磁性粒子是磁铁矿纳米粒子，并且特别优选地所述磁铁矿纳米粒子具有小于15nm的直径。

如本专利申请所述的包含用羧基基团官能化的多个磁性粒子、优选超顺磁性粒子，以及至少一种酶的底物的具有磁功能性的化合物促使磁性粒子与所述至少一种酶的底物上存在的氨基基团结合。当所述底物包含显著量的氨基基团时，如作为本发明中两种具有包含氨基基团的单体的优选的底物的硫酸软骨素和透明质酸时，该具有磁功能性的化合物是特别感兴趣的。

在另一个优选的实施方案中，本发明涉及具有磁功能性的化合物，其包含至少一种酶的底物和多个磁性粒子，其中所述磁性粒子不具有任何涂层或表面修饰。

所述涂层或表面修饰降低一些磁性粒子如铁氧体粒子对横向(T2)和纵向(T1)弛豫时间的作用，其中所述测量是目前在医学应用中所使用的磁共振的基础。在粒子的聚集过程中，存在对弛豫时间有影响的两种原因。一种是不同粒子的磁畴之间的磁矩的耦合，并且另一种是水分子对磁性粒子之间的空间的冲洗(irrigation)。这种对磁性粒子的聚集体的冲洗显然是依赖于其水合作用，并且由在该磁性粒子附近的水分子的扩散和摄入所控制。这两个事件都对T2有影响，但是只有磁畴之间的耦合对T1有影响。存在表面修饰通常通过与聚集体内水分子的摄入和扩散相同的机制缩短T1，该机制进而防止由聚集引起的对T1的缩短的作用。在本发明的研发过程中，终于看到，与具有表面涂层的官能化的粒子比较，当使用不具有表面修饰的粒子时，在体外用胶原酶处理之前和之后在被修饰而具有磁功能性的胶原中观察到的T2的差别可以高至30％以上。在两种情形中，都使用10nm的磁铁矿粒子。由表面修饰和其聚集导致的对分离的磁性粒子的性质的作用的更具体的描述分别在下述中给出：Coating thicknessof magnetic iron oxide nanoparticles affects R2relaxivity(磁性氧化铁纳米粒子的涂层厚度影响R2弛豫性)，LaConte LE，Nitin N，Zurkiya O，CaruntuD，O’Connor CJ，Hu X，Bao G.；J MagnReson Imaging.2007Dec；26(6)：1634-41和Water magnetic relaxation in superparamagnetic colloidsuspensions：The effect of agglomeration(超顺磁性胶体悬浮液中的水磁性弛豫性：聚集的影响)，A.Roch，F.Monky，R.N.Muller，P.Gillis；MagneticResonance in Colloids an Interface Science(界面科学中的胶体磁共振)，J.Fraissard，O.Lapina，第383-92页。在本专利申请中所述的具有磁功能性的化合物中所包含的磁性粒子不具有任何的涂层或表面修饰的事实允许获得作为酶消化的结果的在具有磁功能性的化合物的消化之前和磁性粒子的聚集之后测量的弛豫时间上更大的差别。

在另一个优选的实施方案中，本发明涉及具有磁功能性的化合物，所述化合物包含至少一种酶的底物和多个磁性粒子，其中i)所述磁性粒子不具有任何涂层或表面修饰，或iii)所述磁性粒子用羧基基团官能化，如本专利申请所述，其中所述底物可以选自由下述组成的组：蛋白质、修饰的蛋白质、多肽、修饰的多肽、糖蛋白、糖胺聚糖以及它们的组合。优选地，所述底物可以选自由下述组成的组：胶原、肌原纤蛋白、弹性蛋白、层粘连蛋白、骨钙素、硫酸软骨素、透明质酸、骨结合素、骨桥蛋白、明胶以及它们的组合。

在甚至更优选的实施方案中，本发明涉及具有磁功能性的化合物，所述化合物包含至少一种酶的底物和多个磁性粒子，优选超顺磁性粒子，其中i)所述磁性粒子不具有任何涂层或表面修饰，或iii)所述磁性粒子用羧基基团官能化，如本专利申请所述，其中所述底物可以选自由胶原、硫酸软骨素和透明质酸组成的组。

在特别优选的实施方案中，本发明涉及具有磁功能性的化合物，所述化合物包含至少一种酶的底物和多个不具有任何涂层或表面修饰的磁铁矿纳米粒子，并且其中所述底物可以选自由胶原、硫酸软骨素和透明质酸组成的组。更优选地，磁铁矿纳米粒子通过共价键结合至所述底物。

在另一个优选的实施方案中，本发明涉及具有磁功能性的化合物，所述化合物包含磁性粒子，优选超顺磁性的粒子，其用羧基基团官能化，其中所述磁性粒子通常在生理pH下聚集。

在另一个优选的实施方案中，本发明涉及具有磁功能性的化合物，所述化合物包含磁性粒子，优选超顺磁性的粒子，其用羧基基团官能化，其中所述磁性基团仅在其部分表面上具有修饰。

在另一个优选的实施方案中，本发明涉及具有磁功能性的化合物，所述化合物包含多个固定化在至少一种酶的底物中的磁性粒子，其中所述磁性粒子不具有任何涂层或表面修饰，并且所述化合物通过本专利申请下文所述的方法获得。

本发明还涉及用于获得具有磁功能性的化合物的方法，所述化合物包含至少一种酶的底物和多个不具有涂层或表面修饰的磁性粒子，如本专利申请所述，所述方法的特征在于其包括：

a)修饰所述至少一种酶的底物，和

b)将多个不具有任何涂层或表面修饰的磁性粒子固定化在阶段a)中所获得的修饰的化合物中。

优选地，所述磁性粒子通过共价键结合至所述底物。

在底物修饰的阶段a)中，使用随后能够结合至所述磁性粒子表面的物质。这种结合反应通常由在这些粒子表面中的水的离子解离促进，并且用于修饰所述底物的物质在水性介质中是高度反应性的。

因此，所述底物的修饰优选在无水条件下并且在有机介质中进行，这允许最小化或防止用于修饰底物的物质与水的反应。

不同于其中所述磁性粒子被包覆或具有表面修饰的本领域已知的其他方法，这种方法允许所述酶的底物与几乎完全是磁核的磁性粒子结合，由此获得对于酶活性的确定灵敏得多的具有磁功能性的化合物。

优选地，本发明涉及用于获得具有磁功能性的化合物的方法，所述方法包括将多个不具有涂层或表面修饰的磁性粒子、更优选超顺磁性粒子固定在如本专利申请中所述的至少一种酶的底物中，其中在阶段a)中，所述底物优选与选自由下述组成的组的化合物优选地在有机介质中反应：氨基硅烷、芳香重氮盐、聚合物、聚电解质和二齿配合物，。

用于获得如本专利申请所述的具有磁功能性的化合物的方法的阶段a)可以使用选自由下述组成的组的聚合物进行：聚胺，聚乙烯，聚酰胺和聚苯乙烯。在底物修饰的该阶段1)中还可以使用选自由卟啉和嘧啶组成的组的二齿配合物。另外，在所述方法的该阶段中，还可以使用在水性介质中与琥珀酸结合的多巴胺。

在本发明的甚至更优选的实施方案中，所述方法的阶段a)可以在具有2％、优选多至1％的最大含水量的有机介质中用氨基硅烷进行，其允许防止或最小化氨基硅烷与水的接触，由此避免硅烷化反应或氨基硅烷分子之间的交联。

氨基硅烷属于烷氧基硅烷组。诸如云母、玻璃或表面氧化物的化合物可以被硅烷化，因为它们包含能够被硅烷的烷氧基基团替换的羟基基团，导致-Si-O-Si共价键的形成。氨基硅烷的使用允许有机成分与无机成分结合。烷基硅烷分成三组：其具有仲氨或叔氨基团的氨基硅烷；具有环氧化物的环氧丙氧基硅烷(glycidoxysilanes)；和具有硫醇的巯基硅烷。

在甚至更优选的实施方案中，在用于获得本专利申请所述的具有磁功能性的化合物的方法的阶段a)中所用的烷基硅烷可以选自由下述组成的组：(3-氨基丙基)-三乙氧基硅烷(APTES)、(3-氨基丙基)-二乙氧基-甲基硅烷(APDEMS)、(3-氨基丙基)-二甲基-乙氧基硅烷(APDMES)和(3-氨基丙基)-三甲氧基硅烷(APTMS)。

在特别优选的实施方案中，在本发明的方法的阶段a)中所用的氨基硅烷是在有机介质中的(3-氨基丙基)-三乙氧基硅烷(APTES)。

氨基硅烷，优选APTES与所述底物反应的阶段a)在无水有机溶剂中在足以保持所述底物(优选蛋白质)的结构完整型并且增强其扩散的条件下进行。所述条件可以依据所述底物的结构而改变，并且通常是溶剂的极性和原生性(proticity)的函数。对于胶原，优选的是所述溶剂是极性的，以保持脯氨酸与羟基脯氨酸之间的键。在本发明的一个优选的实施方案中，用于该阶段的溶剂是乙腈。在本发明的一些实施方案中，可以仅通过实验技术，如光谱法、色谱法或圆二色性来确定底物的结构完整性。

在本发明的方法的阶段a)中获得的官能化的化合物可以固定化氧化铁或其他铁氧体的粒子，所述粒子不具有涂层或表面修饰，悬浮在具有一定量的溶解的水的有机介质中，其增加-OH离子在所述粒子表面的出现。

在另一个甚至更优选的实施方案中，本发明用于获得具有磁功能性的化合物的方法在阶段a)之前包括另一个阶段，即，在最大含水量为2％，优选多至1％的有机碱中，用酸酐和有机碱活化氨基硅烷的氨基基团，优选地所述氨基硅烷是APTES。因此，在本发明所述的方法的阶段a)中，作为酸酐的活化的氨基硅烷的氨基基团可以与所述底物中存在的氨基基团反应。

优选地，氨基硅烷的氨基基团的活化可以在戊二酸酐和N，N-二异丙基乙胺的存在下在有机介质如氯仿、乙腈、戊烷、环戊烷、己烷、环己烷、苯、甲苯、1，4-二烷、二乙醚、二氯甲烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、丙酮、二甲基甲酰胺或二甲基亚砜中进行。

在另一个甚至更优选的实施方案中，本发明用于获得具有磁功能性的化合物的方法在阶段a)之前包括另一个阶段，即，在具有2％、优选多至1％的最大含水量的有机介质中用醛活化氨基硅烷的氨基基团，优选地氨基硅烷为APTES。因此，也实现氨基硅烷的氨基基团的活化，这促进其在本发明的方法的阶段a)中与在所述底物中存在的羧基基团的反应。

另外，本发明还涉及用于获得这样的具有磁功能性的化合物的方法，所述化合物包含多个用羧基基团官能化的磁性粒子、优选超顺磁性粒子和至少一种酶的底物，如本专利申请所述，其中所述方法包括用羧基基团官能化的磁性粒子与所述底物通过醛和/或碳二亚胺的反应。类似地，所述底物的氨基基团可以被修饰，优选地用蛋白质修饰，以将其固定在在其表面用羧基基团官能化的所述粒子中，诸如利用使用二巯基琥珀酸进行。

一些用羧基基团修饰磁性粒子的方法记述在Preparation andcharacterization of carboxyl functionalization of magnetite nanoparticles foroligonucleotide immobilization(用于寡核苷酸固定化的磁铁矿纳米粒子的羧基官能化的制备和表征)，Min-Jung Kim，Dae-Hwan Jang，Yong-HoChoae；PhysicaScripta T，2010，第139卷，第14024页中。该方法以两个阶段进行：a1)3-硫代酚乙酸(3-thiophenoacetic acid)与磁性粒子(优选磁铁矿纳米粒子)之间的连接在80℃在作为溶剂的乙腈中通过在氧化铁表面中与高锰酸钾相互作用进行；b1；在该第一次修饰后，将所述粒子放置在具有固定在其表面上的内消旋-2，3-二巯基琥珀酸(meso-2，3-diercaptosuccinic acid)的溶液(dissolution)中。

在进行本发明的优选的方法中，官能化的磁性粒子可以通过在一个包括两个阶段的方法中用预先用醛活化的氨基硅烷修饰其表面用羧基基团获得：

a2)用醛活化氨基硅烷的氨基基团；和

b2)通过硅烷基团与氧化铁表面中的羟基基团之间的相互作用将步骤a2)中用醛活化的氨基硅烷连接至磁性粒子。

然后，这些用羧基基团官能化的粒子可以通过共价键与底物连接，特别是与所述底物中存在的氨基基团连接。

优选地，氨基硅烷的氨基基团的活化可以在戊二酸和N，N-二异丙基乙胺的存在下在有机介质如氯仿、乙腈、戊烷、环戊烷、己烷、环己烷、苯、甲苯、1，4-二烷、二乙醚、二氯甲烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、丙酮、二甲基甲酰胺或二甲基亚砜中进行。在另一个甚至更优选的实施方案中，在最大含水量为2％、优选最大为1％的有机介质中用醛活化氨基硅烷的氨基基团，优选地，所述氨基硅烷是APTES。

磁性粒子表面的修饰优选地通过将所述磁性纳米粒子混合在具有0.1％至1％的活化的氨基硅烷和最终0％至5％的NH3溶液的乙醇或甲醇溶液中10％至50％而进行。在该过程之后，预计在24小时的时间内获得纳米粒子表面的完全覆盖，并且在较短的时间可以获得部分覆盖。

在另一个优选的实施方案中，所述磁性粒子仅部分用羧基基团官能化。这增强了所述粒子在生理pH的聚集。

在本发明的优选的实施方案中，步骤a1)在短于30分钟的时间或在低于80℃的温度进行。在本发明的甚至更优选的实施方案中，该时间在1分钟至15分钟的范围内。在本发明的另一个优选的实施方案中，该时间短于5分钟。在本发明的另一个优选的实施方案中，温度在10℃至60℃的范围内。

在本发明的另一个优选的实施方案中，步骤a2)在短于24小时的时间内进行。在本发明的另一个甚至更优选的实施方案中，该时间少于12小时。在本发明的另一个优选的实施方案中，该时间在1小时至5小时的范围内。

在本发明的另一个优选的实施方案中，步骤a2)用小于10％的体积浓度的NH3进行。

另外，本发明还涉及包含至少一种具有磁功能性的化合物的产品，所述化合物还包含至少一种酶的底物和多个磁性粒子，其中i)所述磁性粒子不具有任何涂层或表面修饰，或者ii)所述磁性粒子用羧基基团官能化，如本专利申请所述，其中所述产品选自由植入物、凝胶、药物组合物和造影剂组成的组。

在优选的实施方案中，包含本专利申请所述的具有磁功能性的化合物的产品可以是药物组合物，并且还包含至少一种药用赋形剂。

不排除其他可能的给药方法，本专利申请所述的具有磁功能性的化合物的优选的给药途径是静脉内给药，优选局部给药。

John M.Walker.Macromolecular drug delivery：methods and protocols(大分子药物递送：方法和流程)，第480卷，Methods in molecular biology(分子生物学方法)，Springer protocols给出了给药得自本发明的可能制剂的可能方法的详细列表。

在甚至更优选的实施方案中，本发明涉及包含本专利申请所述的具有磁功能性的化合物和至少一种药用赋形剂的包封的药物组合物，并且该赋形剂足以允许所述具有磁功能性的化合物在所述修饰的底物和与其反应的至少一种酶之间的反应所发生的部位释放。

在另一个甚至更优选的实施方案中，本发明涉及包含活性成分、本专利申请所述的具有磁功能性的化合物和至少一种药用赋形剂的封装的组合物。因此，该封装的组合物可以用于评估给药所述活性成分的功效。

特别优选地，本发明涉及可以包含具有磁功能性的化合物的药物组合物，所述化合物还包含多个磁铁矿纳米粒子，其优选不具有涂层或表面修饰，被固定化在选自由胶原、硫酸软骨素和透明质酸组成的组的底物中。更优选地，所述磁铁矿纳米粒子通过共价键连接至所述底物。

在另一个优选的实施方案中，本发明涉及包含至少一种具有磁功能性的化合物的植入物或凝胶，所述化合物进而包含至少一种酶的底物和多个磁性粒子，其中i)所述磁性粒子不具有任何涂层或表面修饰，或ii)所述磁性粒子用羧基基团官能化，如本专利申请所述。

优选地，所述植入物或凝胶包含具有磁功能性的化合物，所述化合物还包含如本专利申请上文所述的参与细胞外基质再生的底物和如本专利申请所述的多个不具有任意涂层或表面修饰的磁性粒子。

在甚至更优选的实施方案中，本发明涉及包含所述具有磁功能性的化合物的植入物或凝胶，所述化合物还包含选自由胶原、硫酸软骨素和透明质酸组成的组的底物和如本专利申请所述的多个不具有任何涂层或表面修饰的磁性粒子，优选磁铁矿纳米粒子。更优选地，所述磁铁矿纳米粒子通过共价键连接至所述底物。

在另一个甚至更优选的实施方案中，所述植入物或凝胶包含所述具有磁功能性的化合物，所说化合物进而包含本专利申请上文所述的参与细胞外基质的底物和多个不具有任何涂层或表面修饰的磁性粒子，并且所述具有磁功能性的化合物通过本专利申请所述的方法获得。

另外，本发明还涉及所述具有磁功能性的化合物在制造本专利申请中所述的用于确定或区分一种或多种酶的活性的产品中的用途，所述化合物还包含至少一种酶的底物和多个磁性粒子，其中i)所述磁性粒子不具有任何涂层或表面修饰，或者ii)所述磁性粒子用羧基基团官能化，如本专利申请所述。

在优选的实施方案中，本发明涉及所述具有磁功能性的化合物在制备本专利申请所述的用于检测与至少一种酶的酶活性相关的疾病或紊乱的产品的用途，所述化合物还包含至少一种酶的底物和多个磁性粒子，如本专利申请所述。

优选地，所述疾病或紊乱可以选自由下述组成的组：风湿性疾病(rheumatic diseases)、关节炎(arthritis)、损伤(lesion)、与结缔组织相关的疾病(disease related to the connective tissue)、迪皮特朗病(Dupuytrendisease)、阴茎纤维性海绵体炎(Peyronie disease)、与胶原相关的疾病(disease related to collagen)、脂肪变性(steatosis)、纤维化(fibrosis)、肝硬化(cirrhosis)、转移(metastasis)、组织再生(tissue regeneration)、癌症(cancer)、冠状动脉疾病(coronary disease)、肝病(liver disease)、代谢病(metabolic disease)、感染(infection)和炎性疾病(inflammatorydisease)。

MMP的活性在诸如下述的疾病中起作用：关节炎、风湿性疾病、与结缔组织生长相关的病况以及迪皮特朗病或阴茎纤维性海绵体炎、导致肝纤维化、硬化或心血管疾病的病况、不稳定性心绞痛梗阻(obstructions ofangina of unstable type)。关于这些疾病的酶活性功能的更完整的描述由Woessner JF Jr.，在Matrix metalloproteinases and their inhibitors inconnective tissue remodelling(在结缔组织重塑中的基质金属蛋白酶与其抑制剂)，FASEB J.1991年5月；5(8)：2145-54中并且由Somers KD，DawsonDM，在Fibrin deposition in Peyronie’s disease plaque(在阴茎纤维性海绵体炎斑块中的纤维蛋白沉积)J.Urol.1997Jan；157(1)：311-5中给出。

此外，本发明还涉及所述具有磁功能性的化合物在制造上文所述的用于检测与至少一种酶的酶活性相关的疾病或紊乱的药物组合物中的用途，所述化合物还包含至少一种酶的底物和多个磁性粒子，其中i)所述磁性粒子不具有任何涂层或表面修饰，或ii)所述磁性粒子用羧酸基团官能化，如本专利申请所述。优选地，其中所述疾病或紊乱选自上文所包括的列表。

在与不稳定的冠状动脉疾病相关的细胞外基质的分解代谢过程中，MPs的活性的追踪值得特别的关注。

细胞外基质和厚的纤维层为粥样硬化斑块提供稳定性。通常，不稳定的斑块具有薄的纤维层、高数目的炎性细胞、大的脂质核，并且可以诱导血栓形成。平滑肌细胞的胶原合成由生长因子刺激，如由β-转化生长因子(β-TGF)刺激。斑块中的炎症，随着巨噬细胞和T细胞的聚集，引起MMP的释放，所述MMP消化胶原并且使得纤维层变薄。坏死的脂质核作为脂质在细胞外基质中的积聚、负载有脂质的巨噬细胞的死亡以及可能的在血管滋养管的斑块内出血之后的红细胞膜的积聚的结果生长。

氧自由基由多种来源产生，包括NADPH氧化酶和炎性细胞，其氧化低密度脂蛋白(LDL)并且引起细胞坏死。在临床上可能不表现的(silent)反复的斑块破裂和自愈循环产生斑块中的多层。与位于称为溶酶体的细胞器官中的细胞内蛋白水解酶不同，MMP在细胞外空间中并且在生理pH起作用。基质金属蛋白酶超家族包括MMPl或间质胶原酶，其是一种专门在纤维性胶原酶的初始分裂中起作用的酶，其通常耐受给予粥样斑的纤维层耐受性的蛋白酶。基质金属蛋白酶家族的其他成员，如明胶酶，可以催化胶原片段的再分。溶基质蛋白酶可以活化MMP家族的其他成员，并且可以分解宽范围的基质成分，包括蛋白聚糖分子的蛋白质的干线网(trunknetworks)。溶基质蛋白酶和一种明胶酶(明胶酶B或92kDa的明胶酶)也可以分解弹性蛋白，弹性蛋白是细胞外血管基质结构上重要的另外的成分。

由分子建模支持的临床证据表明，冠状动脉疾病中的重要事件的风险，诸如梗阻、中风或急性心肌梗死，是由由于前文提及的LDL胆固醇的免疫分泌诱导的MMP导致的斑块分解而引起，而不是由梗阻的尺寸引起。

在另一个优选的实施方案中，本发明涉及所述具有磁功能性的化合物在制造用于确定冠状血管斑块中的MMP的酶活性的造影剂中的用途，所述化合物还包含至少一种酶的底物和多个磁性粒子，其中i)所述磁性粒子不具有任何涂层或表面修饰，或ii)所述磁性粒子用羧基基团官能化，如本专利申请所述。优选地，所述底物可以是蛋白质，并且这可以选自由胶原、肌原纤蛋白和弹性蛋白组成的组。

MMP还与一些肝病紧密相关。肝纤维化涉及多个导致过量细胞外基质蛋白质的沉积并且导致正常的肝结构变形的细胞和分子事件。病因学包括慢性病毒性肝炎(chronic viral hepatitis)、由于酒精滥用导致的脂肪肝(fat liver due to alcohol abuse)、非酒精脂肪变性(non-alcoholic steatosis)和药物相关的毒性(drug-related toxicity)。MMP的过量表达是能够区分由纤维化或肝硬化导致的肝脂肪变性的分子标记之一。另外，一种类型的胶原酶(MMP-13)和其他的MMP在肝纤维化的第一阶段具有暂时增加的活性并且在晚期纤维化中具有减小的活性。

在纤维化的发展过程中已经观察到I型和III型胶原的净进展性沉积。除了MMP-1、MMP-8和MMP-13之外，MMP通常不分解I型胶原。MMP-2、MMP-3和MMP-9可以消化IV型胶原，并且这些MMP的酶活性随着纤维化的出现逐渐降低。对于这些酶(包括具有溶胶原活性的那些酶)的mRNA的表达的分子研究已经表明，它们在肝中表达，甚至在肝硬化中表达，但是其活性很大程度上保持在抑制剂，即金属蛋白酶(TIMP)1和2的组织抑制剂的控制之下。存在基质分解的潜在可能，甚至在晚期肝硬化中也存在，但是其由TIMP的分泌所包含。

相信肝纤维化的消退由TIMP表达的减少调控，并且除了间质胶原酶之外，通过包括MMP-1和明胶酶A的组合的纤维胶原的降解。肝巨噬细胞(Kupffer cells)和lypocytes在MMP和TIMP的合成中起关键作用。纳米粒子和微米颗粒通常被肝脏中的肝巨噬细胞显著地保留。

如本专利申请所述被修饰具有磁功能性的胶原的施用可用于通过测量肝中MMP的溶胶原活性而评估一些肝状况。这种修饰的胶原引起由关于靠近锚定至修饰的胶原上的磁性粒子的水质子与其远距离对应体的不同的弛豫时间导致的对比效应。如果磁性粒子作为酶降解的结果而聚集，则对弛豫的这种作用甚至更大。这种区别在所述磁性粒子不具有表秒修饰时甚至更显著。

因此，所述作用，即在磁共振成像中更大的对比的程度是MMP表达的信号。磁共振信号的对比效应中的这种增加可以通过在磁共振成像的测量中用作信号强度、T1或T2加权图像、扩散参数的计算、饱和度或它们的组合的不同的参数随时间进行测量，不排除本申请中没有列出的其他MRI参数。下文给出了关于这些参数中的一些的简短的描述。MRI参数及其原理的更完整的描述由Mitchell等提供在“MRI Principles(MRI原理)”一书中。

当将通过如上文所述的磁性粒子的固定化而被修饰具有磁功能性的胶原施用至肝时，与正常的肝比较，在脂肪变性或肝脂肪变性的最后阶段和纤维化原理中，通过分析技术，诸如磁共振，可以观察到较大的对比效应。然而，在纤维化或硬化之后的阶段中，这种对比效应相对中等。

MMP的表达在具有肝转移的患者中也是显著更高的。在癌症中，MMP的产生和活化与TIMP对其的抑制之间的平衡是侵入和转移中的关键因素。MMP在组织中合成，并且由血流滤过。这已经在结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌和膀胱癌中观察到，大部分患有严重疾病的患者已经增加他们的明胶酶B血浆水平。

具体地，在患有晚期结直肠癌的患者中，已经观察到与较短的存活相关的高水平的明胶酶B或复合TIMP之间的关系。因此，使用具有磁功能性的化合物作为底物用来评估表达和/或酶活性以及它们在癌症中的结果和通常地评估器官、组织或其他机体区室中的MMP和其他酶的活性在本发明的范围内。

在另一个优选的实施方案中，本发明涉及所述具有磁功能性的化合物在制造用于监测参与细胞外基质再生、优选参与软骨再生的酶活性的植入物或凝胶的用途，所述化合物还包含至少一种酶的底物和多个磁性粒子，其中i)所述磁性粒子不具有任何涂层或表面修饰，或ii)所述磁性粒子用羧基基团官能化，如本专利申请所述。

在另一个甚至更优选的实施方案中，本发明涉及所述具有磁功能性的化合物在制造用于监测植入物在人类或另一种活体中的生物整合的植入物的用途，所述化合物还包含至少一种酶的底物和多个磁性粒子，其中i)所述磁性粒子不具有任何涂层或表面修饰，或ii)所述磁性粒子用羧基基团官能化，如本专利申请所述。

优选地，将本专利申请所述的包含用羧基基团官能化的磁铁矿纳米粒子并且固定在硫酸软骨素上的具有磁功能性的化合物加入至水性混合物，所述水性混合物包含足以制造软骨植入物的额外量的硫酸软骨素或另外的糖胺聚糖或糖蛋白。因此，获得这样的凝胶，其可以加入至软骨植入物中，并且作用为在软骨再生中起作用的硫酸软骨素或硫酸酯酶的水解酶活性的报道子。另外，这种凝胶还可以在体外用作硫酸软骨素或硫酸酯酶的水解酶活性的报道子。

类似地，并且作为硫酸软骨素的备选物，在本发明的另一个实施方案中，还可以使用透明质酸。

当将如本专利申请所述的包含多个固定在至少一种酶的底物中的磁性粒子的具有磁功能性的化合物施用给活体、优选人类时，该化合物允许确定一种或多种酶与所述底物反应的酶活性。这种确定通过测量至少一种反应产物或二者的组合的与所述具有磁功能性的化合物的磁性质相关的参数中由该酶反应引起的变化而进行。

在另一个优选的实施方案中，本发明涉及下述用途：

-还包含参与细胞再生方法的至少一种酶的底物和多个磁性粒子的具有磁功能性的化合物在制造如本专利申请所述的植入物或凝胶中的用途；或

-还包含至少一种酶的底物和多个磁性粒子的具有磁功能性的化合物，其中i)所述磁性粒子不具有任何涂层或表面修饰，或ii)所述磁性粒子用羧基基团官能化，如本专利申请所述；

其中酶反应引起至少部分由超顺磁性至顺磁性的变化。

存在一些分析技术可以用来使用本专利申请所述的具有磁功能性的化合物来确定酶活性的作用。因此，在另一个优选的实施方案中，本发明涉及本专利申请所述的具有磁功能性的化合物在通过选自由以下各项组成的组的技术确定由酶反应引起的磁性性质上的变化中的用途：磁共振成像(MRI)、电子顺磁共振(EPR)、包括振动磁力测定(MVS)的磁力测定，以及超导量子干涉装置(SQUID)、穆斯堡尔光谱法(spectrometry)、X射线磁圆二色谱(XMCD)、铁磁共振(FMR)、磁光克尔效应(magneticoptic Kerr effect、MOKE)、布里渊光散射(BLS)、电磁感应、原子力显微镜检查、磁弛豫计(magnetorelaxometry)以及它们的组合。

这些技术中的一些可以用于在体外或离体确定酶活性的存在，通过建立预先干燥或冷冻干燥的包含被修饰具有磁功能性的底物的样品的光谱和曲线，并且观察在暴露于生物试剂之前和之后的基于在被修饰具有磁功能性的底物中存在的磁性粒子的聚集状态的光谱或曲线的变化。下文给出关于其的简述。

EPR光谱学测量在由当在外部磁场(塞曼场)中放置去耦电子系统时产生的分裂(splitting)导致的状态之间的能量差异。两种状态之间的能量差异将为gμBHZ形式，其中g是Landé因子，μB是波尔磁场，H外加磁场。用于获得所述光谱中的共振峰的所谓共振条件为：

hv＝g_jμ_BH_Z

其中场H_z是共振场。该表达可以用来获得获得Lande因子g。该因子g最终在鉴定样品时可以是非常有用的，但是其不是独特的，并且将依赖于选择用于辐照的频率。由光谱提供的其他数据，如强度、线数、它们之间的距离、其形状和宽度等也是非常可用于鉴定和表征样品的其他信息来源。因此，磁性粒子的电子，特别是最接近其来源的那些，基于所述磁性粒子的聚集状态，将产生不同的共振信号，其将被转化为光谱变化。

MVS和SQUID基于样品的磁化强度直接测量磁场并且确定其变化曲线。

穆斯堡尔光谱法是基于固体中的γ射线的发射和共振吸收的光谱技术。其与磁共振成像(MRI)光谱学类似，原因在于其探测核跃迁，并且因此对作为化学NMR位移的原因的相似的电子-核相互作用敏感。表征具有Fe⁵⁷的组合物的发光元件通常是Co⁵⁷。典型地，存在三种类型的观察到的核相互作用，即，同分异构体转换，四极分化和超精细化。超精细分裂(塞曼分裂)是核与任意周围的磁场之间的相互作用的结果。典型地，这将单峰分裂成六个非简并峰。超精细分裂通常作为这六个峰最外面的面积之间的距离进行测量。超精细分裂在通常是铁磁性的或反铁磁性的，产生强的内部磁场的含有铁的化合物的穆斯堡尔光谱学检测中是特别重要的。除了鉴定之外，不同峰的相对强度显示出所述化合物在样品中的相对浓度，并且可以用于半定量分析。此外，由于铁磁性现象取决于尺寸，因此光谱可以提供关于包含铁的材料的结晶尺寸和颗粒结构的信息。

X射线磁圆二色谱(XMCD)是两种X射线吸收光谱之间的差异，考虑到施加磁场，一种具有右圆形偏振光，并且另一种是左圆形偏振光(LCP)。这种技术的最大的优点在于其对每种元素的灵敏性，这允许磁力表征具体的元素并且发现少数元素或稀释在基质中的磁矩。由于X射线吸收的测量是关于对应于具体元素的吸收边缘的能量进行的，因此，仅观察到这种元素的特定的贡献。在处理纳米粒子时，这一特征是特别令人感兴趣的，原因在于其允许分开其他元素或可能的杂质对总磁化强度的贡献。该作用是基于这样的事实，即，物质对X射线吸收将依赖于光极性和电子的自旋和轨道力矩。测量两种圆形极性(左或右)的样品吸收并且减去两种光谱，获得XMCD信号。然后，可以通过所谓的求和法则(sum rule)计算电子的磁矩。这种技术还允许对于磁矩将自旋和轨道成分分开。

在铁磁共振技术(FMR)中，施加与包含样品的薄膜的平面平行的磁场。将样品放置在测角仪上，其允许其平面图从场的方向旋转。共振场，HR，以及峰至峰的线宽，ΔH，可以作为平面中的场的角度、温度的函数而获得，并且获得薄膜的厚度。

当将极化的光射线反射在磁化材料的表面上时，极化平面可能略微旋转。这种效应已知为磁光克尔效应(magneto-optic Kerr effect)或MOKE，其广泛用于铁磁性材料薄膜的表征。与FMR类似地，将样品放置在测角仪上，其允许其平面从场的方向旋转，但是，不同于FMR，从关于样品的不同取向角的反射系数的测量获得滞后现象的曲线面积的估测。

布里渊散射是一种光现象，其可以在当由入射光束横穿过的薄膜或介质中存在磁性不规则性时观察到。

在本发明的另一个优选的实施方案中，这些分析技术允许检测体内酶活性，并且可以选自由磁力测定和磁共振成像组成的组。在本发明的甚至更优选的实施方案中，这种分析技术是磁共振成像。

在另一个优选的实施方案中，本发明涉及本专利申请所述的具有磁功能性的化合物的用途，其中酶反应引起磁性质的变化，优选至少超顺磁性至顺磁性的部分变化，该变化可通过确定选自由下述组成的组的参数而检测到：信号强度、纵向弛豫时间(T1)、横向弛豫时间(T2)、扩散参数、对第一系列脉冲的响应信号、饱和度信号I以及它们的组合。优选地，由酶反应引起的磁性质的变化可以由选自由下述组成的组的参数测量：纵向弛豫时间(T1)、横向弛豫时间(T2)，以及T1与T2的比。优选地，所述变化可以通过T1与T2的比确定。

优选地，由酶反应引起的磁性质的变化可以通过在所述酶反应发生之前和之后分析所述参数而确定，如本专利申请所述。具体地，在包含一种或多种酶的底物的具有本发明的磁性质目的的化合物与这些酶中的一种或多种之间的反应发生之前和之后分析所述参数。

基于磁共振的测量方法，例如，磁共振成像或电子顺磁共振(EPR)，是足以测量在具有磁功能性的化合物、其至少一种分解产物或二者的组合的磁性质中的变化的间接方法。在磁共振成像的情形中，测量响应与强磁场垂直的射频(RF)的施加的作用的弛豫时间。这些持续时间称为T1和T2，并且表示水质子特有的弛豫时间，其是由作为RF消失的结果的分别由在所施加的RF纵向上的平面中的磁场的消失和在与所施加的RF平面垂直的磁场中力的再现导致。如与抗磁性材料(如大部分组织和生物流体)相比，在存在铁磁性、顺磁性和超顺磁性材料的情况下，T1和T2显著更短。长久以来，还已知加入顺磁性溶质引起水氢质子的参数T1的测量上的减少。

当在临床应用中使用时，磁共振是基于质子的极小的磁矩与生物组织中存在的非常大量的质子之间的平衡，这导致在存在大磁场的情况下的可测量的作用。对于与z轴平行的B₀，这些弛豫信号为：

$m_z=m(1-e^{-t/T_1})$

和

其中m_z是沿着z轴的磁化强度，m_xy是与z轴垂直的磁化强度，T1和T2分别为纵向和横向弛豫时间，ω₀是进动(precession)的频率，并且是相位常数。纵向弛豫反映从系统到其周围网络的能量损失，诸如热，并且特别是质子矩与其环境的偶极偶联的量度。平面xy的弛豫相对快，并且由质子进动中由于它们彼此之间以及与组织中磁矩的其他波动之间的磁性相互作用引起的相连贯性的损失促进。滞后(lag)也可以通过纵向应用范围内的局部非同质性影响，给出更短的弛豫时间的第二式中T2的替代，T2*：

$\frac{1}{{T_2}^{*}}=\frac{1}{T_2}+\mathrm{\γ}\frac{\mathrm{\Δ}{B}_0}{2}$

其中ΔB₀是通过所施加的场的均质性的变形或系统的磁化率的局部变化发生的场的变化。该ΔB₀变化可以完全由磁性粒子引起，其引起对_B0场的非同质性可能的局部因素的显著的优势。对于本发明的一些实施方案，导致ΔB₀的这些差异是由最先固定在底物上或其他感兴趣的大分子上的磁性粒子的分布或聚集状态中的变化引起，信号的起因作为所述底物或其他感兴趣的大分子的分解或代谢应用的结果检测到。

在另一个优选的实施方案中，本发明涉及如本专利申请所述的具有磁功能性的化合物的用途，其中磁性性质上的变化指示选自由下述组成的组的至少一种物理现象：

-磁性粒子的聚集，

-具有磁功能性的化合物或其至少一种反应产物的聚集，

-磁性粒子的尺寸的变化，和

-选自由下述组成的组中的至少一种的粒度变化：本发明的具有磁功能性目的的化合物，其至少一种反应产物和它们的组合。

必须突出对齐磁性粒子的磁矩的效果可以作为其分组或分布的结果显著变化。这可以从两个因素理解：1)如上所述的热或动力学振荡的作用，和2)如下所述的响应所施加的外部磁场所需要的平均时间和能量。

一种感兴趣的特殊情况是其中所述磁性粒子是超顺磁性的并且倾向于作为这种构造的变化的结果的聚集。然后，必须不一定是超顺磁性的所得到的磁性聚集物具有与初始磁性粒子的磁性质可测量的不同的磁性质。因此，当确定磁性性质上的变化时，可以检测酶作用的信号。在直径小于15nm的磁铁矿纳米粒子的情况下，当它们在生物温度下悬浮在水溶液中时，它们表现出超顺磁性，但是如果聚集形成更大直径的堆，其行为将变成顺磁性的。

图1显示当测量T2的倒数(也称为磁相关性R2)时磁铁矿超顺磁性和顺磁性纳米粒子的尺寸和聚集的效应。可以看出，所述超顺磁性纳米粒子一旦聚集表现为与顺磁性粒子更相似。

如果将磁性材料放置在强度为H的磁场上，所述材料中的个体原子矩在与其方向对齐的响应中起作用，这称为磁诱导：

B＝μ₀(H+M)

其中μ₀是介质的磁导率，并且磁化强度M＝m/V是每体积单位的磁矩，其中m是体积为V的材料中的磁矩。所有材料基于其原子结构和温度而具有磁响应。它们可以关于体积磁化率χ而大致分类，其中M＝χH描述由H在材料中诱导的磁化强度。在IS单位中，χ是无量纲的(adimensional)，并且M和H以Am^-1表示。

材料的敏感性不仅取决于温度，而且取决于磁场的强度(H)，产生M-H曲线的特征性S型，其中在高H值，M接近于饱和值。另一方面，在铁磁性和亚铁磁性材料中，通常出现磁滞曲线，这显示与杂质壁中磁畴的自旋相关的磁化过程中的不可逆性，或在材料内的粒化的限制，以及固有作用，诸如结晶网络的磁性各向异性。这导致这样的事实：M-H曲线产生磁滞循环。这些圆的形状部分由粒度决定：在(微米以上级别的)大颗粒中，一些磁畴的基本状态导致狭窄的磁滞循环，因为它需要相对低的场能来使得磁畴的壁移动。在更小的颗粒中，单个磁畴的基线状态决定滞后的存在。在甚至更小的尺寸(或十分之几纳米或更小的级别)，在粒子的磁矩响应热能自由波动而相对个体原子力矩保持其有序状态的情况下，观察到超顺磁性。这起始于没有磁滞的S形M-H曲线。甚至对于以松散体积排列的超顺磁性粒子，它们的磁矩相互作用，影响所述M-H曲线(在一些情形中，甚至可以观察到磁滞)以及弛豫时间，产生其他磁性和光学效应。

例如，这种效应可以通过磁振动光谱学(MVS)观察到。图2表示在10ml固定在琼脂糖中的盐水悬浮液中用直径为10nm的磁铁矿超顺磁性纳米粒子官能化的I型胶原的M-H曲线。

图3表示在37℃用I型胶原酶温育12小时后固定在琼脂糖中的相似的悬浮液的H-M曲线。图3显示略开放的曲线；然而，图2的H-M曲线没有显示出磁滞。这种磁力行为归因于在作为胶原酶的溶胶原活性的结果的纳米粒子聚集后全部纳米粒子的磁矩之间的相互作用。当胶原酶水解修饰的胶原时，α链分离，并且锚定的磁性纳米粒子作为热运动的结果倾向于聚集，所述热运动诱导与它们聚集时相同磁性的磁畴之间的磁性耦合。

用于进行测量的优选技术是磁共振，其中可以通过弛豫时间的变化，以及因此这种磁性粒子的对比效应的变化，测量磁性粒子的聚集或分散。在本发明的一些优选的实施方案中，胶原可以以分离的α链或原胶原的片段提供，二者都是天然存在的或按照相似的方法合成的，用于固定磁性粒子，这可以在α链或分离的单体中进行。α链可以经诱导采取三螺旋结构，诸如其在乙酸介质处理如胃蛋白酶，洗涤，过滤，洗涤，过滤和沉淀物收集中的悬浮液或溶液。图4显示用磁铁矿纳米粒子(B)官能化的修饰的胶原三肽(A)的示意图。该图不是按比例的，并且磁铁矿纳米粒子的分布不一定与真实的分布一致。图5显示在胶原被胶原酶消化后，溶胶原活性对首先固定在胶原中的磁性纳米粒子的分布的影响。

附图简述

图1显示按照本发明的一个实施方案核磁弛豫随粒度或聚集状态的演化。磁性弛豫以ms^-1表示，在以每升多少nM铁测量的不同的浓度，由三种不同的颗粒悬浮液产生：通过超声处理分散的10nm(三角形)，通过超声处理分散的50nm(正方形)和10nm聚集的(菱形)。

图2显示按照本发明的一个实施方案，在10ml固定在琼脂糖中的盐水悬浮液中用直径为10nm的磁铁矿超顺磁性纳米粒子修饰的IV型胶原的M-H磁饱和曲线。水平轴表示施加的H场，并且竖直轴表示以安培/转/米测量的M磁化强度。

图3表示按照本发明的一个实施方案，如图2所示制备的固定化在琼脂糖中的悬浮液在37℃用胶原酶温育12小时后的H-M磁化强度曲线。水平轴表示所施加的H场，竖直轴表示磁化强度M，均以安培/转/米测量。

图4显示按照本发明的一个实施方案，用磁铁矿纳米粒子(B)官能化的修饰的胶原(A)的三螺旋区的示意图。

图5显示按照本发明的一个实施方案，溶胶原活性对首先固定在胶原中并且在所述胶原由胶原酶消化后磁性纳米粒子的分布的影响。

图6显示通过两个样品管(C)和(D)的轴向轴观察到的T2的图谱的比较，其中0.5mg胶原通过在其10％的赖氨酸中固定不具有表面变化的直径为10nm的磁铁矿粒子而被修饰具有磁功能性。在这两个管中，所述修饰的胶原被固定在1ml 10％的琼脂糖在10mM氯化钙和400mM氯化钠在pH 7.4的溶液中的悬浮液中，仅在管C中加入1mg胶原酶。管D为对照。两个管都放置在37℃温育1小时。按照本发明的一个实施方案，两个管的T2图谱的平均值对于(C)为168ms，对于(D)为150ms。

图7显示通过两个样品管(E)和(F)的轴向轴观察到的T2图谱的比较，其中0.5mg未修饰的胶原作为对照。在两个管中，仅在管(E)中加入1mg胶原酶之后，所述胶原被固定于在1ml的10mM氯化钙和400mM氯化钠在pH 7.5溶液中的10％琼脂糖悬浮液中。管(F)是对照。两个管放置在37℃温育1小时。按照本发明的一个实施方案，两个管的T2图谱的平均值对于(E)为191ms，对于(F)为189ms，并且这些弛豫时间不同于按照本发明的一个实施方案在图6的修饰的胶原中观察到的那些弛豫时间。如在该图中所示，T2图谱中的弛豫时间的差异是难以从视觉上注意到的。

图8示意性显示按照本发明的一个实施方案，用由N，N-二异丙基乙胺(DIEA)(I)介导的(3-氨基丙基)-三乙氧基硅烷(APTES)(G)用戊二酸酐(H)的活化，以增强与属于胶原赖氨酸的氨基基团的结合。

图9示意性显示按照本发明的一个实施方案，由碳二亚胺二异丙基(DIPCD)(L)介导的如图8所示的通过连接修饰的APTES(J)的属于胶原赖氨酸(K)的氨基基团的修饰允许不具有表面修饰的磁铁矿粒子在所述修饰的胶原(M)中的锚定。

图10示意性显示按照本发明的一个实施方案，由DIPCD(L)介导的如图8所示用活化的APTES(J)连接属于聚赖氨酸单体(N)的氨基基团以产生由APTES修饰的聚赖氨酸，以增强与纳米粒子的锚定。

图11显示按照本发明的一个实施方案，用如图10所示的至少修饰的聚赖氨酸(N)的不具有表面修饰(O)的磁铁矿粒子的修饰产生用聚赖氨酸(R)修饰的磁性粒子，其可以通过碳二亚胺的干预与内源性胶原赖氨酸连接。

图12显示按照本发明的一个实施方案，通过连接N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸化物(EDC)(T)的硫酸软骨素(S)单体的n-乙酰胺基团的修饰允许在其表面上用二巯基琥珀酸(U)修饰的磁铁矿粒子的锚定。

实施例

通过举例说明的方式提供下述实施例，并且其不意图限制本发明。

实施例1-通过用不具有表面修饰的磁性纳米粒子修饰胶原而制备具有 磁功能性的化合物

商业类型的来源于牛腱的胶原具有三螺旋结构和已证明的作为溶胶原活性的底物的性质。具有三螺旋结构的胶原片段的选择可以通过用胃蛋白酶处理然后过滤而进行。后一程序的效率可以通过圆二色谱证实。

为了修饰这种类型的胶原，首先使APTES结合至其赖氨酸。用戊二酸酐活化APTES形成复合物。该反应用N，N-二异丙基乙胺(DIEA)进行。将APTES、戊二酸酐和IDEA以1∶1∶3的比率溶解在乙腈中，并且置于干燥气氛下搅拌24小时。将胶原溶解在具有衍射性的酸性介质(如甘露醇)中，并且进行冷冻干燥。将冷冻干燥的胶原在乙腈中悬浮并均化，将所得到的混合物以28∶1的比例加入至活化的APTES中，以1∶1的比率加入二异丙基碳二亚胺(DIPCD)，并且在干燥气氛中混合另外48小时。通过蒸发用乙醇替代乙腈，并且通过重复的离心去除过量的APTES、除胶原之外的化合物，并且将制剂再次悬浮在乙醇中。将在通常为水性的碱性介质中的悬浮液中的直径小于15nm的磁铁矿粒子以至少98∶1的乙醇/水比混合在乙醇中，并且进行超声处理。将它们加入至混合物中并且再次在干燥气氛下进行混合48小时。通过蒸发用水替换乙醇，用乙酸稳定在pH 3.5，并在4℃进行搅拌8小时。将所产生的悬浮液在iodoxinadol床上超滤14小时。取出上层床(upper bed)，并在4℃在具有30KD的孔的膜管中进行透析24小时。一旦制剂已被透析，可以加入甘露醇或另一种替代的表面活性剂，并将制剂冻干。

过量的可以通过柱、离心梯度或磁力分离、透析和冻干而去除。得到的制剂可用于溶胶原活性在体内、体外或离体的检测。归因于胶原的三螺旋结构，一旦具有磁功能性的修饰的胶原由胶原酶分解，则最初固定在其中的磁性粒子将倾向于基于其沿着胶原链的基线分布进行聚集或分散。

将3mg本实施例所述的被修饰具有磁功能性的胶原的制剂固定于在10mM氯化钙和400mM氯化钠在pH 7.5的溶液中的1mL 10％琼脂糖悬浮液中，并且在加入1mg胶原酶后，观察到170ms的弛豫时间T2，其使用4.7T的MRI设备测量。不存在胶原酶时，观察到的T2值为150ms。当使用未修饰的胶原时，对于具有胶原酶或不具有胶原酶的样品，弛豫时间分别为191ms和189ms。

实施例2-制备用于制造植入物的具有磁功能性的化合物

在该第一实施例中，使APTES结合至聚赖氨酸，然后锚定修饰的粒子。该修饰的聚赖氨酸可以通过由赖氨酰氧化酶介导的交联结合至胶原。在结合至APTES之前，用戊二酸酐活化聚赖氨酸。将APTES、戊二酸酐和N，N-二异丙基乙胺(DIEA)以1∶1∶3的比例溶解在乙腈中进行该活化反应。然后，在干燥环境中搅拌24小时。将聚赖氨酸悬浮在乙腈中，将所得到的混合物以1∶1的比例加入至活化的APTES，并且以1∶1的比例加入DIPCD，并且在干燥环境中混合48小时。通过蒸发用乙醇替代乙腈，并且通过重复的离心去除过量的APTES和不同于修饰的聚赖氨酸的其他化合物，并且重悬在乙醇中。将在水性碱性介质中的悬浮液中的直径小于15mm的磁铁矿粒子与乙醇以至少98∶1的乙醇/水的比例混合。超声处理，加入到预先获得的在乙醇中修饰的修饰的聚赖氨酸的混合物中，并且在干燥环境中混合另外48小时。通过蒸发用水替换乙醇，稳定在碱性pH以保持所述修饰的粒子的稳定性。

向用在10X D-PBS和250mM HEPES中的0.4M NaOH稳定在pH 7.4的0.1乙酸中的1.5mg/ml I型胶原的溶液中加入在25mMTris-HCl，pH 8.0，100mM NaCl，0.05％吐温-20，20％甘油和3nM DTT中的0.02mg/ml的赖氨酰氧化酶，最终浓度为1mM的用具赖氨酸官能化的磁性粒子，最终浓度小于1％的透明质酸，再将混合物稳定在pH 7.4，并且允许在4℃温育72小时。温育后，在4℃用pH 8的NaOH溶液进行洗涤和超声处理。最后，将凝胶放置在37℃温育45分钟。

用聚赖氨酸修饰的磁性粒子通过由酶赖氨酰氧化酶将赖氨酸转化为阿立辛(alysines)而与胶原连接，所述赖氨酰氧化酶还增强键阿立辛-阿立辛。所产生的凝胶是半固体的，并且一旦植入，其可以替代结缔组织。所述植入物的植入涉及分泌胶原酶的成纤维细胞对其的侵入，还分解所述植入物的胶原并且将其替换为与周围组织的胶原形态相似的胶原。胶原的预分解引起磁性粒子的聚集，这种聚集可以通过加权磁共振成像(weighted magnetic resonance imaging)的图谱进行检测。

实施例3-用由羧基基团官能化的磁性纳米粒子修饰硫酸软骨素链以被 包括在软骨植入物中

将300微升APTES、414微升DIEA和16mg的戊二酸酐在200毫升乙腈中混合24小时。加入250ml最低纯度为99％的乙醇，2ml悬浮在具有16mg/ml的近似铁浓度的酸溶液中的10nm的磁铁矿粒子和10ml 30％的NH₃溶液。允许所述混合物搅拌3小时，并且在pH 2洗涤两次，用乙酸替代乙醇。由此获得具有部分被羧基基团修饰的表面的磁性纳米粒子。

将硫酸软骨素的盐溶解在10mM 4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基乙磺基)酸(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinotanosulphonic)acid)HEPES溶液中。加入之前获得的表面部分官能化的磁铁矿纳米粒子，具有来自硫酸软骨素的单体的铁浓度约为1摩尔，以及也来自硫酸软骨素单体的1.21∶1过量的N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸化物(EDC)。将所得到的悬浮液稳定在pH 7.4，允许在4℃搅拌24小时，并且通过过滤或透析去除过量的材料。将用硫酸软骨素官能化的纳米粒子加入至另外的硫酸软骨素、用于软骨植入物中的其他糖胺聚糖或糖蛋白的水性混合物中。搅拌所述混合物形成凝胶。所述凝胶可以包含在软骨植入物中，并且作用为硫酸软骨素的水解酶或硫酸酯酶的活性的报道子，所述硫酸软骨素的水解酶或硫酸酯酶实现了在软骨再生中的作用。

实施例4.制造包含具有磁功能性的胶原的凝胶

用在10X D-PBS和250mM HEPES中的0.4M NaOH将在0.1％乙酸中的1.5mg/ml的I型胶原的溶液稳定在pH 7.4，加入核糖至250mM，加入浓度为1.5mg/ml的具有磁功能性的胶原的悬浮液，最终浓度低于1％的透明质酸，将混合物再次稳定在pH 7.4，并且允许在4℃温育72小时。然后，在4℃用pH 8的NaOH溶液进行洗涤和超声处理。最后，将凝胶在37℃进行温育45分钟。

所产生的凝胶是半固体的，并且可以用于体外测定或形成植入物，所述植入物在植入后可以替代结缔组织。包含透明质酸增强分泌胶原酶的成纤维细胞对其的侵入，并且所述成纤维细胞还降解植入物的胶原，并将其替换为具有与周围组织相似的形态的胶原。之前的胶原降解引起磁性粒子的聚集，所述聚集可以通过加权磁共振成像图谱检测。

实施例5：制造包含具有磁功能性的透明质酸的植入物

按照实施例4所述的条件，将具有磁功能性的胶原替换为稳定在pH7.4的具有磁功能性的透明质酸的2％溶液。所得到的植入物允许通过透明质酸酶的活性检测所述植入物的降解。

一些类型的植入物还可以共中心组合，通过在4℃的新的温育在之前制备的植入物上导致胶凝，但是使用具有不同官能性的化合物。因此，在同一种植入物中，可以检测多于一种酶活性，这取决于其发生的区域。

实施例5：制造包含具有磁功能性的透明质酸的注射植入物

将4mg/ml在0.1％乙酸中的具有磁功能性的I型胶原的悬浮液与也在0.1％乙酸中的浓度为3％的透明质酸的溶液混合。将混合物在4℃用在10X D-PBS和250mM HEPES中的0.4M NaOH稳定在pH 7.4，并且产生在pH 7.4的1mg/ml具有磁功能性的I型胶原和1％的透明质酸的最终浓度。

所产生的凝胶植入后可以提供弹性并且注射后替代结缔组织。透明质酸的存在增强分泌胶原酶的成纤维细胞对其的侵入，并且所述成纤维细胞还降解所述植入物的胶原并且将其替换为其自己的胶原。之前的胶原降解引起磁性粒子的聚集，所述聚集可以通过加权磁共振成像图谱检测。

实施例6：通过用由羧基基团官能化的磁性纳米粒子修饰而制备具有磁功 能性的化合物

将100微升浓度为10至20mg Fa/mi的用羧基修饰的10nm的磁铁矿粒子加入到50mg溶解在30ml具有10mM HEPES的乙酸溶液中的胶原的悬浮液中。用NaOH稳定在pH 8，并且最后加入10mg EDC，并且允许搅拌12小时。将得到的混合物再稳定在pH 3，并且允许在4℃搅拌72小时，然后超声处理5分钟，并在iodoxinadol床上以25000RPM进行超滤10小时。提取上清液，透析并最终冻干。

Claims (40)

1.包含至少一种具有磁功能性的化合物的植入物或凝胶，所述化合物进而包含参与细胞外基质再生的至少一种酶的底物和多个磁性粒子。

2.根据权利要求1所述的植入物或凝胶，其中所述磁性粒子通过共价键与所述底物结合。

3.根据权利要求1或2所述的植入物或凝胶，其中所述磁性粒子是超顺磁性粒子。

4.根据权利要求1-3中的任一项所述的植入物或凝胶，其中所述底物选自由下述组成的组：蛋白质、修饰的蛋白质、多肽、修饰的多肽、糖蛋白、糖胺聚糖以及它们的组合。

5.根据权利要求4所述的植入物或凝胶，其中所述底物选自由下述组成的组：胶原、肌原纤蛋白、弹性蛋白、层粘连蛋白、骨钙素、硫酸软骨素、透明质酸、骨结合素、骨桥蛋白、明胶以及它们的组合。

6.根据权利要求5所述的植入物或凝胶，其中所述底物选自由胶原、硫酸软骨素和透明质酸组成的组。

7.具有磁功能性的化合物，所述化合物包含参与细胞外基质再生的至少一种酶的底物和多个磁性粒子，所述化合物用于制造用于监测参与细胞外基质再生的酶活性的植入物或凝胶。

8.根据权利要求7所述的具有磁功能性的化合物，其中所述磁性粒子通过共价键与所述底物结合。

9.根据权利要求7或8所述的具有磁功能性的化合物，其中所述磁性粒子是超顺磁性粒子。

10.根据权利要求7-9中任一项所述的具有磁功能性的化合物，其中所述底物选自由下述组成的组：蛋白质、修饰的蛋白质、多肽、修饰的多肽、糖蛋白、糖胺聚糖以及它们的组合。

11.根据权利要求10所述的具有磁功能性的化合物，其中所述底物选自由下述组成的组：胶原、肌原纤蛋白、弹性蛋白、层粘连蛋白、骨钙素、硫酸软骨素、透明质酸、骨桥蛋白、明胶以及它们的组合。

12.根据权利要求11所述的具有磁功能性的化合物，其中所述底物选自由硫酸软骨素和透明质酸组成的组。

13.如权利要求7-12中任一项所述的具有磁功能性的化合物在制造用于监测参与细胞外基质再生的酶活性的植入物或凝胶中的用途。

14.根据权利要求13所述的具有磁功能性的化合物的用途，所述化合物用于监测结缔组织的再生。

15.根据权利要求13所述的具有磁功能性的化合物的用途，所述化合物用于监测植入物在人类或另一种活体中的生物整合。

16.具有磁功能性的化合物，所述化合物包含至少一种酶的底物和多个磁性粒子，其特征在于

i)所述磁性粒子不具有任何涂层或表面修饰，

或

ii)所述磁性粒子用羧基基团官能化。

17.根据权利要求16所述的具有磁功能性的化合物，其中所述磁性粒子是超顺磁性粒子。

18.根据权利要求16或17中的任一项所述的具有磁功能性的化合物，其中所述磁性粒子不具有任何涂层或表面修饰。

19.根据权利要求16-18中任一项所述的具有磁功能性的化合物，其中所述底物选自由下述组成的组：蛋白质、修饰的蛋白质、多肽、修饰的多肽、糖蛋白、糖胺聚糖以及它们的组合。

20.根据权利要求19所述的具有磁功能性的化合物，其中所述底物选自由下述组成的组：胶原、肌原纤蛋白、弹性蛋白、层粘连蛋白、骨钙素、硫酸软骨素、透明质酸、骨结合素、骨桥蛋白、明胶以及它们的组合。

21.根据权利要求20所述的具有磁功能性的化合物，其中所述底物选自由胶原、硫酸软骨素和透明质酸组成的组。

22.根据权利要求16或17所述的具有磁功能性的化合物，其中所述磁性粒子在生理pH倾向于聚集。

23.根据权利要求16或17中的任一项所述的具有磁功能性的化合物，其中所述磁性粒子仅在其部分表面上具有修饰。

24.用于获得如权利要求18-21中的任一项所述的具有磁功能性的化合物的方法，其特征在于所述方法包括：

a)修饰所述至少一种酶的底物，和

b)将多个不具有任何涂层或表面修饰的磁性粒子固定在阶段a)中所获得的修饰的化合物中。

25.根据权利要求24所述的用于获得具有磁功能性的化合物的方法，其中在阶段a)中，所述底物在具有最大2％的含水量的有机介质中与氨基硅烷反应。

26.根据权利要求25所述的用于获得具有磁功能性的化合物的方法，其中在阶段a)中，所述底物在有机介质中与作为(3-氨基丙基)-三乙氧基硅烷的氨基硅烷反应。

27.根据权利要求25-26中的任一项所述的用于获得具有磁功能性的化合物的方法，其中所述方法包括在阶段a)之前的另外的阶段，所述另外的阶段为在有机介质中用戊二酸酐和N，N-二异丙基乙胺活化氨基硅烷的氨基基团。

28.包含至少一种如权利要求16-24中的任一项所述的具有磁功能性的化合物的产品，其中所述产品选自由植入物、凝胶、药物组合物和造影剂组成的组。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述产品是如权利要求1-6中的任一项所述的植入物或凝胶。

30.如权利要求16-23中的任一项所述的具有磁功能性的化合物在制造如权利要求28-29中的任一项所述的产品中的用途，所述产品用于确定或区分一种或多种酶的酶活性。

31.根据权利要求30所述的具有磁功能性的化合物的用途，所述化合物用于制造足以检测与至少一种酶的酶活性相关的疾病或紊乱的造影剂。

32.根据权利要求31所述的具有磁功能性的化合物的用途，其中所述疾病或紊乱选自由下述组成的组：风湿性疾病、关节炎、损伤、与结缔组织相关的疾病、迪皮特朗病、阴茎纤维性海绵体炎、与胶原相关的疾病、脂肪变性、纤维化、肝硬化、转移、组织再生、癌症、冠状动脉疾病、肝病、代谢病、感染和炎性疾病。

33.如权利要求16-23中的任一项所述的具有磁功能性的化合物在制造用于监测细胞基质再生的植入物或凝胶中的用途。

34.根据权利要求33所述的具有磁功能性的化合物的用途，所述化合物用于制造用于监测软骨再生的植入物或凝胶。

35.如权利要求13-15或30-34中的任一项所述的具有磁功能性的化合物的用途，其中所述酶反应引起超顺磁性或顺磁性的至少部分变化。

36.根据权利要求35所述的具有磁功能性的化合物的用途，其中由酶反应引起的磁性质上的变化的确定通过选自由下述组成的组的技术进行：磁共振成像，核磁共振，电子顺磁共振，磁力测定，穆斯堡尔光谱法，超导量子干涉装置磁力测定，振动磁力测定，X射线磁圆二色谱，铁磁共振，磁光克尔效应，布里渊光散射，电磁感应，原子力显微镜检查，磁弛豫计以及它们的组合。

37.根据权利要求36所述的具有磁功能性的化合物的用途，其中由酶反应引起的磁性质上的变化的确定通过磁共振成像进行。

38.根据权利要求37所述的具有磁功能性的化合物的用途，其中由酶反应引起的磁性质上的变化通过选自由下述组成的组的参数确定：信号强度、纵向弛豫时间(T1)、横向弛豫时间(T2)、扩散参数、响应第一系列脉冲的信号或饱和度信号I以及它们的组合。

39.根据权利要求38所述的具有磁功能性的化合物的用途，其中由酶反应引起的磁性质上的变化通过在所述酶反应之前和之后分析所述参数而确定。

40.根据权利要求35-39中的任一项所述的具有磁功能性的化合物的用途，其中磁性质上的变化是选自由下述组成的组的至少一种物理现象的指示：

-磁性粒子的聚集，

-具有磁功能性的化合物或其至少一种反应产物的聚集，

-磁性粒子尺寸的变化，和

-选自由下述组成的组中的至少一种的粒度变化：本发明的具有磁功能性目的的化合物，其至少一种反应产物和它们的组合。