CN104529905A

CN104529905A - N-3-苯并咪唑酰双胺类衍生物及其制备方法与应用

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Publication number: CN104529905A
Application number: CN201410751017.0A
Authority: CN
Inventors: 丁怀伟; 孙驰宇; 石爱龙; 宋宏锐
Original assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Current assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Priority date: 2014-12-09
Filing date: 2014-12-09
Publication date: 2015-04-22
Anticipated expiration: 2034-12-09
Also published as: CN104529905B

Abstract

本发明公开了一类新化合物N-3-苯并咪唑酰双胺类衍生物及其制备方法与应用。所述化合物的结构式如式I所示，式I中，R₁为H，或R₁为苯环上单取代或多取代的下述基团中的一种或多种：氟、氯、溴、甲基、甲氧基、羟基、硝基、氨基、乙酰氨基、三氟甲基、氰基；R₂为氢、氯、氟、甲基、甲氧基、羟基、氨基；X为硫或氧。本发明的化合物具有很好的抗肿瘤活性，在制备抗肿瘤药物领域，可以用作治疗肿瘤的治疗剂。

Description

N-3-苯并咪唑酰双胺类衍生物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种N-3-苯并咪唑酰双胺类衍生物及其制备方法与应用。

背景技术

Hedgehog(Hh)信号通路是哺乳动物体内一条非常重要的通路，控制着细胞的生长和存活。在胚胎发育过程中Hh通路参与细胞的分化增殖和器官形成；在成人体内Hh通路则与组织创伤修复、干细胞维系等密切相关。Hh信号转导通路主要由分泌型糖蛋白配体Hh、跨膜蛋白受体Ptch1、跨膜蛋白Smo和核转录因子Gli等相关蛋白组成。Hh信号转导是一个非常复杂的过程：在没有Hh信号时，Ptch1与Smo结合，抑制Smo的活性，致使Gli被剪切修饰，从而抑制下游目的基因效应；当有Hh信号时，Hh配体能与Ptch1结合，解除Ptch1对Smo的抑制活性，释放Gli，激活靶基因的表达。研究发现，Hh信号异常与多种肿瘤的产生、侵袭、转移密切相关。Hh通路参与肿瘤发生发展有3种机制：(1)基因突变，当Hh通路中的Ptch1，Smo，Gli等发生突变，会导致肿瘤发生，例如在临床的基底细胞癌(BCC)、髓母细胞瘤、横纹肌肉瘤中均检测到Ptch1，Smo等基因突变。(2)配体依赖方式，当Hh配体过量时，Smo的抑制作用减弱，从而刺激下游基因的过量表达，诱导肿瘤发生、促进肿瘤发展。报道发现Hh信号分子过度表达存在于胰腺癌、结肠癌、胃癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、食道癌、乳腺癌、卵巢癌、白血病等肿瘤。(3)肿瘤干细胞学说，近年有大量研究表明Hh信号通路参与到肿瘤细胞的自我更新过程，与肿瘤干细胞密切相关。近年来，认识到Hh信号通过参与多种肿瘤的发生、发展和复发过程，Hh信号通路已成为开发新型抗肿瘤药物的一个重要靶点。

目前已有多个Hh信号通路抑制剂处于研发阶段，其中罗氏(基因泰克)的Vismodegib(GDC-0449)于2012年1月被美国食品药品管理局(FDA)批准用于治疗晚期的BCC，同时Vismodegib正在开展针对其他多种肿瘤的临床试验。除此之外，诺华的Sonidegib(NVP-LDE-225)目前进入临床III期，礼来的LY-2940680和施贵宝BMS-833923(XL-139)则处于临床II期试验，而辉瑞的PF-04449913，诺华的LEQ-506以及武田公司的TAK-441进展相对较慢，目前处于临床I期研究中。鉴于Hh信号在多种肿瘤适应症的治疗中存在着较大的潜力，因此开发针对性强、毒副作用小、病人耐受性好的Hh抗癌药物具有重要临床意义。

发明内容

本发明的目的是提供N-3-苯并咪唑酰双胺类衍生物及其制备方法。

本发明所提供的N-3-苯并咪唑酰双胺类衍生物，其结构通式如式I所示：

式I中，R₁为苯环上单取代或多取代的下述基团中的一种：R₁为苯环上单取代或多取代的下述基团中的一种：氢、氟、氯、溴、甲基、甲氧基、羟基、硝基、氨基、乙酰氨基、三氟甲基、氰基；R₂为氢、氯、氟、甲基、甲氧基、羟基、氨基；X为硫或氧。

所述R₁多取代是指2,3-双取代、2,4-双取代、2,5-双取代、2,6-双取代、3,4-双取代、3,5-双取代；或者2,4,6-三取代、3,4,5-三取代。

优选的，R₁为氢、2-氟、3-氟、4-氟、2-氯、3-氯、4-氯、4-三氟甲基、3-三氟甲基、2,3-二氯、4-甲基、4-甲氧基、3,4-二氯、2,4-二氯、2,4-二氟，4-氟-3-氯。

上述式I所示化合物药学上可接受的盐也属于本发明的保护范围。

本发明的化合物可用于抑制Hedgehog激酶。

本发明所提供的应用是式I所示的化合物或药学上可接受的盐在制备真核生物肿瘤细胞抑制剂中的应用或在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用。

所述真核生物为哺乳动物；所述肿瘤细胞为癌细胞；所述癌细胞为结肠癌细胞、胃癌细胞；所述结肠癌细胞具体为SW620细胞，所述胃癌细胞具体为MGC803细胞。

以本发明提供的式I所示的化合物或药学上可接受的盐为活性成分制备的抗肿瘤药物或真核生物肿瘤细胞抑制剂也属于本发明的保护范围。

所述预防和/或治疗肿瘤药物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。

需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。

用式I化合物或其药学上可接受的盐制备的预防和/或治疗肿瘤药物可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

本发明提供的N-3-苯并咪唑酰双胺类衍生物(式I所示的化合物)，经仪器分析测试，结构正确无误。本发明提供的制备上述衍生物的方法，合成步骤简便且易于操作。该类化合物具有非常好的抗肿瘤活性，在制备抗肿瘤药物领域，具有重要的实用价值和应用前景。

本发明提供的制备式I所述化合物的方法，包括如下步骤：

1)使式II所示化合物与二甲基苯胺发生缩合、环合、还原反应，得到式III所示化合物。

其中，式II、III中R₂的定义同式I中R₂。

2)使式IV所示化合物与对羟基苯甲酸甲酯发生O-烃化反应得到式V所示化合物；然后在碱性条件下水解得到式VI化合物；

其中，式IV、V、VI中R₁的定义同式I中R₁。

3)使式III所述化合物与式VI所示化合物在缩合剂存在下进行缩合反应，得到式I所示化合物(其中X＝S)；式I所示化合物再经氧化反应，得到式I所示化合物(其中X＝O)。

上述方法，步骤1)中式II所示化合物与二甲基苯胺进行缩合反应的反应介质为四氢呋喃；进行环合反应的反应介质为冰醋酸，反应条件为110℃加热回流，反应时间为2-6小时，优选4小时；还原反应条件为氯化亚锡酸性条件。

步骤2)中所述O-烃化反应的反应介质为丙酮；所述碱性条件由1.5M的氢氧化钠水溶液与乙醇的混合溶液提供，其中水与乙醇的体积比为1:5。

步骤3)中所述缩合反应的反应介质为乙腈，反应条件为80℃加热回流，反应时间为4-8小时，具体选择6小时；氧化反应的反应介质为丙酮和水，其中丙酮与水的体积比为12:2，反应条件为双氧水弱碱性条件。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1N-(3-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-4-甲氧基苯基羰基)-4-(苄氧基)苯甲酰胺(式I中R₁＝H，R₂＝CH₃，X＝S的化合物1)的制备

步骤1)N-(2-氨基苯基)-2-甲基-5-硝基苯甲酰胺的合成

于100mL圆底烧瓶中，2-甲基-5-硝基苯甲酸3.18g(17.6mmol)溶于70mL无水四氢呋喃，加入草酰氯4.19g(35.2mmol)，滴加1滴DMF，35℃搅拌4小时。旋蒸浓缩得淡黄色的2-甲基-5-硝基苯甲酰氯固体，无水四氢呋喃溶解，待用。于另一100mL圆底烧瓶中，邻苯二胺1.91g(17.6mmol)溶于40mL无水四氢呋喃，加入2.42g(23.8mmol)三乙胺，冰浴下缓慢滴加2-甲基-5-硝基苯甲酰氯的四氢呋喃溶液，常温搅拌过夜，过滤，将滤液旋干，用水洗涤，将沉淀物通过过滤收集，得到深黄色N-(2-氨基苯基)-2-甲基-5-硝基苯甲酰胺固体。

步骤2)2-(2-甲基-5-硝基苯基)-1H-苯并[d]咪唑的合成

于100mL圆底烧瓶中，N-(2-氨基苯基)-2-甲基-5-硝基苯甲酰胺0.84g(0.0028mol)溶于40ml冰乙酸，110℃下回流3小时。将淡黄色透明液倒入水中，水层黄色浑浊，加入饱和碳酸氢钠调至弱酸，有大量乳白色絮状固体析出，抽滤，收集滤饼，硅胶拌样，柱色谱，洗脱剂(PE:EA＝6:1～9:1)，旋蒸浓缩得淡黄色2-(2-甲基-5-硝基苯基)-1H-苯并[d]咪唑固体。

步骤3)3-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-4-甲基苯胺的合成

将2-(2-甲基-5-硝基苯基)-1H-苯并[d]咪唑0.76g(3.2mmol)溶到乙醇中，80℃回流，全溶后加入1/5量的水，加入氯化亚锡2.6g(12.8mmol)，搅拌1小时。滴加24ml浓HCl，回流8小时。旋蒸浓缩母液得到褐色的盐酸水溶液，溶于水变成淡黄的透明液，用氢氧化钠调节到弱碱性，体系白色浑浊。等量乙酸乙酯萃取两遍，饱和食盐水洗涤，硫酸镁干燥，过滤，旋蒸浓缩得暗黄色3-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-4-甲基苯胺固体。

结构确证数据如下：

1H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ7.57(s，2H)，7.19(dd，J＝5.8，3.1Hz，2H)，7.02(d，J＝8.1Hz，1H)，6.96(d，J＝1.9Hz，1H)，6.64(dd，J＝8.0，1.9Hz，1H)，2.39(s，3H)。

步骤4)4-苄氧基苯甲酸甲酯的合成

于100mL圆底烧瓶中，对羟基苯甲酸甲酯5g(3.29mmol)溶于30mL丙酮，加入碳酸钾1.3g(9.87mmol)，65℃下搅拌1小时。滴加溴苄0.84g(4.94mmol)，80℃下回流5h。混合物冷却到室温，过滤，丙酮洗涤滤饼，旋蒸浓缩滤液得到白色类似蜡状粉末，用无水乙醇充分洗涤，旋蒸除去无水乙醇，干燥得到白色4-苄氧基苯甲酸甲酯固体。

步骤5)4-苄氧基苯甲酸的合成

于100mL圆底烧瓶中，对苄氧基苯甲酸甲酯5g(0.022mol)，溶于100mL乙醇，加10mL水出现浑浊再滴加乙醇至全溶。75℃搅拌15分钟，加入氢氧化钠4.36g(0.110mol)，回流2小时，浓缩，倒入200mL蒸馏水中，1M盐酸调节pH5-6，大量白色固体析出，抽滤，得白色4-苄氧基苯甲酸固体。

结构确证数据如下：

1HNMR(400MHz，DMSO-d₆)δ，5.11(s，2H)，6.99(d，J＝8.9Hz，2H)，7.31-7.45(m，5H)，7.99(d，J＝8.9Hz，2H)。

步骤6)N-(3-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-4-甲基苯基)-4-(苄氧基)苯甲酰基硫脲的合成

于100mL圆底烧瓶中，对苄氧基苯甲酸0.3g(1.32mmol)溶于甲苯，加入氯化亚砜0.79g(6.60mmol)，滴加1滴DMF，72℃回流6小时，旋蒸浓缩得淡黄褐色色固体，溶于乙腈溶解待用。100mL烧瓶，硫氰酸钾0.90g(9.24mmol)溶于乙腈，滴加对苄氧基苯甲酰氯的乙腈溶液，80℃回流5小时。加入3-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-4-甲基苯胺0.22g(0.88mmol)，80℃回流10小时。反应液倒入冰水中，乙酸乙酯萃取2遍，饱和食盐水洗，干燥，旋蒸浓缩得黄色混合物，硅胶板层析(环己烷：乙酸乙酯＝2:1)，得纯的黄色粉末为N-(3-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-4-甲氧基苯基羰基)-4-(苄氧基)苯甲酰胺(化合物1)。

结构确证数据如下：

1HNMR(600MHz，DMSO-d₆)δ12.65(s，1H)，8.04-7.98(m，3H)，7.77(d，J＝8.0Hz，1H)，7.68(d，J＝7.8Hz，1H)，7.52(d，J＝7.7Hz，1H)，7.46(d，J＝7.3Hz，2H)，7.41(dd，J＝15.0，7.8Hz，3H)，7.35(d，J＝7.3Hz，1H)，7.21(dt，J＝14.4，7.0Hz，2H)，7.15(d，J＝8.8Hz，2H)，5.21(s，2H)，2.62(s，3H)。

步骤7)N-(3-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-4-甲基苯基)-4-(苄氧基)苯甲酰基硫脲的合成

于100mL圆底烧瓶中，0.049g(0.1mmol)N-(3-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-4-甲基苯基)-4-(苄氧基)苯甲酰基硫脲溶于10mL丙酮水溶液，加入1.5ml饱和碳酸钠水溶液，体系呈弱碱性，搅拌若干时间，溶液由澄清透明变为白色浑浊。逐滴加入5ml 30％双氧水，体系变为淡黄色微浑，继续室温搅拌3h。加入1mol/L盐酸至中性，继续搅拌1h，体系呈黄色溶液，白色浑浊并冒有气泡。抽滤，干燥得白色固体粉末N-(3-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-4-甲基苯基)-4-(苄氧基)苯甲酰基硫脲(化合物16)。

结构确证数据如下：

¹HNMR(600MHz，DMSO-d₆)δ12.65(s，1H)，11.04(s，1H)，10.92(s，1H)，8.05(d，J＝8.8Hz，2H)，7.93(d，J＝1.9Hz，1H)，7.70–7.64(m，2H)，7.52(d，J＝7.7Hz，1H)，7.46(d，J＝7.4Hz，2H)，7.40(t，J＝7.5Hz，2H)，7.35(t，J＝7.4Hz，2H)，7.23–7.18(m，2H)，7.14(d，J＝8.9Hz，2H)，5.21(s，2H)，2.57(s，3H)。

选用其它取代的溴苄，采用与上完全相同的制备方法，得到其它取代的对苄氧基苯甲酸，最后与3-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-4-甲基苯胺或3-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-4-氯苯胺缩合，便得到其它式I中的产物。

N-(3-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-4-甲基苯基硫代氨基甲酰基)-4-(3-氯苄基)苯甲酰胺(化合物2)

79％yield.m.p.94-95℃.1HNMR(600MHz，DMSO-d₆)δ12.77(s，1H)，11.46(s，1H)，8.07–7.97(m，3H)，7.78(d，J＝7.9Hz，1H)，7.62(s，2H)，7.54(s，1H)，7.45-7.41(m，4H)，7.23(dd，J＝5.7，2.9Hz，2H)，7.16(d，J＝8.6Hz，2H)，5.24(s，2H)，2.62(s，3H).ESI-MS m/z:527.1[M+H]⁺。

N-(3-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-4-甲基苯基硫代氨基甲酰基)-4-(4-(三氟甲基)苄基氧基)苯甲酰胺(化合物3)

81％yield.m.p.110-113℃.¹HNMR(600MHz，DMSO-d₆)δ12.77(s，1H)，11.46(s，1H)，8.03(d，J＝8.6Hz，2H)，8.00(s，1H)，7.77(d，J＝7.9Hz，3H)，7.69(d，J＝7.9Hz，2H)，7.61(s，2H)，7.42(d，J＝8.2Hz，1H)，7.22(dd，J＝5.6，2.9Hz，2H)，7.16(d，J＝8.6Hz，2H)，5.34(s，2H)，2.62(s，3H).ESI-MS m/z:561.1[M+H]⁺。N-(3-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-4-甲基苯基硫代氨基甲酰基)-4-(3-(三氟甲基)苄基氧基)苯甲酰胺(化合物4)

76％yield.m.p.112-113℃.ESI-MSm/z:560.1.¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)δ12.78(s，1H)，11.48(s，1H)，8.05(d，J＝8.9Hz，2H)，8.01(d，J＝2.0Hz，1H)，7.86(s，1H)，7.79(dd，J＝9.7，4.3Hz，2H)，7.74(d，J＝7.8Hz，1H)，7.68(d，J＝7.6Hz，1H)，7.63(s，2H)，7.44(d，J＝8.4Hz，1H)，7.23(dd，J＝6.0，3.2Hz，2H)，7.19(d，J＝8.9Hz，2H)，5.35(s，2H)，2.64(s，3H).ESI-MS m/z:561.1[M+H]⁺。

N-(3-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-4-甲基苯基硫代氨基甲酰基)-4-(2-氟苄基)苯甲酰胺(化合物5)

79％yield.m.p.88-90℃.¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)δ12.79(s，1H)，11.48(s，1H)，8.05(d，J＝8.9Hz，2H)，8.02(d，J＝2.0Hz，1H)，7.80(dd，J＝8.2，1.9Hz，1H)，7.63(dd，J＝5.4，3.2Hz，2H)，7.59(dd，J＝7.8，1.5Hz，1H)，7.44(d，J＝8.1Hz，2H)，7.29–7.26(m，2H)，7.24(dd，J＝6.1，3.1Hz，2H)，7.19(d，J＝8.9Hz，2H)，5.27(s，2H)，2.64(s，3H).ESI-MS m/z:511.1[M+H]⁺。

N-(3-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-4-甲基苯基硫代氨基甲酰基)-4-(2，3-二氯苄基)苯甲酰胺(化合物6)

80％yield.m.p.185-186℃.¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)δ12.91(s，1H)，11.62(s，1H)，8.18(d，J＝8.7Hz，2H)，8.14(s，1H)，7.92(d，J＝8.2Hz，1H)，7.81(d，J＝7.8Hz，1H)，7.75(t，J＝7.6Hz，3H)，7.56(t，J＝6.8Hz，2H)，7.37(dd，J＝6.0，3.1Hz，2H)，7.32(d，J＝8.8Hz，2H)，5.45(s，2H)，2.76(s，3H).ESI-MSm/z:561.0[M+H]⁺。

N-(3-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-4-甲基苯基硫代氨基甲酰基)-4-(4-甲基苄基氧基)苯甲酰胺(化合物7)

75％yield.m.p.83-86℃.¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)δ12.72(d，J＝56.2Hz，1H)，11.45(s，1H)，8.02(d，J＝8.8Hz，3H)，7.79(d，J＝7.9Hz，1H)，7.63(s，2H)，7.44(d，J＝8.3Hz，1H)，7.36(d，J＝7.3Hz，2H)，7.26–7.20(m，4H)，7.14(d，J＝8.8Hz，2H)，5.18(s，2H)，2.64(s，3H)，2.31(s，3H).ESI-MS m/z:507.1[M+H]⁺。

N-(3-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-4-甲基苯基硫代氨基甲酰基)-4-(3-氟苄氧基)苯甲酰胺(化合物8)

76％yield.m.p.105-108℃.¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)δ12.79(s，1H)，11.48(s，1H)，8.05(d，J＝8.9Hz，2H)，8.02(d，J＝1.9Hz，1H)，7.80(d，J＝8.2Hz，3H)，7.71(d，J＝8.0Hz，2H)，7.63(s，2H)，7.44(d，J＝8.4Hz，1H)，7.23(dd，J＝6.0，3.2Hz，2H)，7.18(d，J＝8.9Hz，2H)，5.37(s，2H)，2.65(s，3H).ESI-MSm/z:511.1[M+H]⁺。

N-3-1H-苯并[d]咪唑-2-基-4-甲基苯基硫代氨基甲酰基-4-(2-氯苄氧基)苯甲酰胺(化合物9)

82％yield.m.p.110-113℃.¹HNMR(600MHz，DMSO-d₆)δ12.80(s，1H)，11.49(s，1H)，8.04(d，J＝8.0Hz，2H)，8.02(s，1H)，7.81(d，J＝7.4Hz，1H)，7.64(d，J＝13.0Hz，2H)，7.62(d，J＝5.3Hz，1H)，7.52(d，J＝6.3Hz，1H)，7.44(d，J＝8.0Hz，2H)，7.40(s，1H)，7.27(s，2H)，7.18(d，J＝8.2Hz，2H)，5.26(s，2H)，2.61(s，3H).ESI-MS m/z:527.1[M+H]⁺。

N-(3-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-4-甲基苯基硫代氨基甲酰基)-4-(3，4-二氯苄基)苯甲酰胺(化合物10)

81％yield.m.p.79-81℃.¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)δ12.79(s，1H)，11.48(s，1H)，8.05(d，J＝8.7Hz，2H)，8.02(s，1H)，7.79(d，J＝10.3Hz，2H)，7.70(s，1H)，7.68(s，1H)，7.63(s，1H)，7.49(d，J＝6.7Hz，1H)，7.44(d，J＝8.4Hz，1H)，7.23(dd，J＝5.9，3.1Hz，2H)，7.17(d，J＝8.8Hz，2H)，5.26(s，2H)，2.65(s，3H).ESI-MSm/z:561.0[M+H]⁺。

N-(3-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-4-甲基苯基硫代羰基)-4-(2，4-二氯苄基氧基)苯甲酰胺(化合物11)

77％yield.m.p.198-201℃.¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)δ12.76(d，J＝30.1Hz，1H)，11.50(s，1H)，8.06(d，J＝8.9Hz，2H)，8.02(d，J＝1.8Hz，1H)，7.80(dd，J＝8.2，1.8Hz，1H)，7.72(t，J＝3.9Hz，1H)，7.65(t，J＝8.7Hz，3H)，7.51(dd，J＝8.3，2.1Hz，1H)，7.44(d，J＝8.4Hz，1H)，7.24(dd，J＝6.0，3.2Hz，2H)，7.19(d，J＝8.9Hz，2H)，5.27(s，2H)，2.65(s，3H).ESI-MS m/z:561.0[M+H]⁺。

N-(3-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-4-甲基苯基硫代氨基甲酰基)-4-(4-氟苄基)苯甲酰胺(化合物12)

78％yield.m.p.99-101℃.¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)δ12.80(s，1H)，11.47(s，1H)，8.04(d，J＝6.7Hz，3H)，7.80(s，1H)，7.64(s，2H)，7.55(d，J＝5.9Hz，2H)，7.44(d，J＝7.2Hz，1H)，7.25(d，J＝6.3Hz，4H)，7.16(d，J＝6.7Hz，2H)，5.21(s，2H)，2.64(s，3H).ESI-MS m/z:511.1[M+H]⁺。

N-(3-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-4-氯苯基硫代氨基甲酰基)-4-(4-(三氟甲基)苄基氧基)苯甲酰胺(化合物13)

85％yield.m.p.214-215℃.¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)δ11.10(s，1H)，9.89(s，1H)，9.51(s，1H)，8.53(dd，J＝8.9，2.6Hz，1H)，7.96(d，J＝8.6Hz，3H)，7.79(d，J＝8.1Hz，3H)，7.69(d，J＝8.0Hz，3H)，7.13(d，J＝8.7Hz，3H)，5.34(s，2H).ESI-MSm/z:581.1[M+H]⁺。

N-(3-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-4-氯苯基羰基)-4-(3，4-二氯苄氧基)苯甲酰胺(化合物14)

85％yield.m.p.190-191℃.¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)δ12.78(s，1H)，11.55(s，1H)，8.27(d，J＝2.3Hz，1H)，8.04(d，J＝8.8Hz，2H)，7.91(dd，J＝8.7，2.3Hz，1H)，7.77(d，J＝1.3Hz，1H)，7.72–7.66(m，4H)，7.48(d，J＝8.0Hz，1H)，7.26(dd，J＝5.9，3.1Hz，2H)，7.17(d，J＝8.8Hz，2H)，5.25(s，2H).ESI-MSm/z:581.0[M+H]⁺。

N-(3-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-4-氯苯基羰基)-4-(2，4-二氯苄氧基)苯甲酰胺(化合物15)

83％yield.m.p.219-221℃.¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)δ12.79(s，1H)，11.58(s，1H)，8.28(d，J＝2.2Hz，1H)，8.05(d，J＝8.8Hz，2H)，7.93(dd，J＝8.6，2.1Hz，1H)，7.71(d，J＝8.9Hz，2H)，7.67(dd，J＝8.5，4.9Hz，3H)，7.51(dd，J＝8.2，1.8Hz，1H)，7.28(dd，J＝6.0，3.1Hz，2H)，7.19(d，J＝8.8Hz，2H)，5.27(s，2H).ESI-MSm/z:581.0[M+H]⁺。

N-(3-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-4-甲基苯基氨基甲酰基)-4-(苄氧基)苯甲酰胺(化合物16)

77％yield.m.p.212-214℃.¹HNMR(600MHz，DMSO-d₆)δ12.65(s，1H)，11.04(s，1H)，10.92(s，1H)，8.05(d，J＝8.8Hz，2H)，7.93(d，J＝1.9Hz，1H)，7.70–7.64(m，2H)，7.52(d，J＝7.7Hz，1H)，7.46(d，J＝7.4Hz，2H)，7.40(t，J＝7.5Hz，2H)，7.35(t，J＝7.4Hz，2H)，7.23–7.18(m，2H)，7.14(d，J＝8.9Hz，2H)，5.21(s，2H)，2.57(s，3H).ESI-MS m/z:477.1[M+H]⁺。

N-(3-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-4-甲基苯基氨基甲酰基)-4-(3-氯苄基氧基)苯甲酰胺(化合物17)

82％yield.m.p.234-236℃.¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)δ12.79(s，1H)，11.17(s，1H)，11.06(s，1H)，8.20(d，J＝8.7Hz，2H)，8.07(d，J＝1.7Hz，1H)，7.81(t，J＝7.3Hz，2H)，7.66(d，J＝7.5Hz，2H)，7.56(s，3H)，7.49(d，J＝8.4Hz，1H)，7.38–7.31(m，2H)，7.29(d，J＝8.8Hz，2H)，5.37(s，2H)，2.71(s，3H).ESI-MSm/z:511.1[M+H]⁺。

N-(3-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-4-甲基苯基氨基甲酰基)-4-(4-(三氟甲基)苄基氧基)苯甲酰胺(化合物18)

79％yield.m.p.234-236℃.¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)δ12.78(s，1H)，11.16(s，1H)，11.06(s，1H)，8.20(d，J＝8.9Hz，2H)，8.06(d，J＝2.1Hz，1H)，7.91(d，J＝8.3Hz，2H)，7.82(d，J＝8.1Hz，4H)，7.66(d，J＝7.4Hz，1H)，7.49(d，J＝8.5Hz，1H)，7.38–7.32(m，2H)，7.30(d，J＝8.9Hz，2H)，5.48(s，2H)，2.70(s，3H).ESI-MSm/z:545.1[M+H]⁺。

N-(3-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-4-甲基苯基氨基甲酰基)-4-(3-(三氟甲基)苄基氧基)苯甲酰胺(化合物19)

83％yield.m.p.152-155℃.¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)δ11.10(s，1H)，10.99(s，1H)，8.09(d，J＝8.7Hz，2H)，8.01(s，1H)，7.86(s，1H)，7.82–7.74(m，4H)，7.73(s，1H)，7.68(d，J＝7.7Hz，1H)，7.45(t，J＝7.7Hz，3H)，7.19(d，J＝8.7Hz，2H)，5.34(s，2H)，2.55(s，3H).ESI-MS m/z:545.1[M+H]⁺。

N-(3-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-4-甲基苯基氨基甲酰基)-4-(2-氟苄氧基)苯甲酰胺(化合物20)

85％yield.m.p.230-232℃.¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)δ11.08(s，1H)，10.97(s，1H)，8.09(d，J＝8.6Hz，2H)，7.98(s，1H)，7.78–7.66(m，3H)，7.59(t，J＝7.3Hz，1H)，7.44(dd，J＝15.8，7.7Hz，2H)，7.37–7.30(m，2H)，7.29–7.24(m，2H)，7.20(d，J＝8.6Hz，2H)，5.26(s，2H)，2.57(s，3H).ESI-MS m/z:495.1[M+H]⁺。N-(3-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-4-甲基苯基氨基甲酰基)-4-(2，3-二氯苄基)苯甲酰胺(化合物21)

81％yield.m.p.245-247℃.¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)δ11.12(s，1H)，8.09(d，J＝8.6Hz，2H)，7.95(s，1H)，7.68(d，J＝8.0Hz，2H)，7.61(d，J＝7.4Hz，3H)，7.44(t，J＝7.8Hz，1H)，7.37(d，J＝8.3Hz，1H)，7.23(dd，J＝5.7，3.0Hz，2H)，7.19(d，J＝8.7Hz，2H)，5.32(s，2H)，2.59(s，3H).ESI-MS m/z:545.1[M+H]⁺。

N-(3-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-4-甲基苯基氨基甲酰基)-4-(4-甲基苄基氧基)苯甲酰胺(化合物22)

79％yield.m.p.246-248℃.¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)δ12.79(s，1H)，11.18(s，1H)，11.05(s，1H)，8.18(d，J＝8.8Hz，2H)，8.07(d，J＝1.9Hz，1H)，7.81(dd，J＝12.2，4.6Hz，2H)，7.66(d，J＝7.5Hz，1H)，7.56–7.46(m，3H)，7.35(t，J＝8.7Hz，4H)，7.26(d，J＝8.9Hz，2H)，5.29(s，2H)，2.71(s，3H)，2.63(s，3H).ESI-MSm/z:491.2.[M+H]⁺。

N-(3-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-4-甲基苯基氨基甲酰基)-4-(3-氟苄氧基)苯甲酰胺(化合物23)

76％yield.m.p.155-158℃.¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)δ11.23(s，1H)，11.11(s，1H)，8.19(d，J＝8.9Hz，2H)，8.14(d，J＝2.1Hz，1H)，7.92(dd，J＝6.0，3.1Hz，3H)，7.64–7.58(m，3H)，7.57(d，J＝8.9Hz，1H)，7.44(d，J＝7.8Hz，2H)，7.29(d，J＝9.0Hz，3H)，5.38(s，2H)，2.66(s，3H).ESI-MS m/z:495.1[M+H]⁺。

N-(3-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-4-甲基苯基氨基甲酰基)-4-(2-氯苄基氧基)苯甲酰胺(化合物24)

84％yield.m.p.230-232℃.¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)δ11.17(s，1H)，8.21(d，J＝8.9Hz，2H)，8.07(d，J＝2.2Hz，1H)，7.80(dd，J＝8.2，2.3Hz，2H)，7.75(dd，J＝6.6，2.7Hz，1H)，7.69–7.64(m，2H)，7.56–7.52(m，2H)，7.49(d，J＝8.5Hz，1H)，7.35(s，2H)，7.31(d，J＝9.0Hz，2H)，5.40(s，2H)，2.70(s，3H).ESI-MSm/z:511.1[M+H]⁺。

N-(3-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-4-甲基苯基氨基甲酰基)-4-(3，4-二氯苄基氧基)苯甲酰胺(化合物25)

81％yield.m.p.178-180℃.¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)δ11.08(s，1H)，8.08(d，J＝8.9Hz，2H)，7.95(d，J＝2.2Hz，1H)，7.76(d，J＝1.8Hz，1H)，7.68(d，J＝8.3Hz，2H)，7.62(s，2H)，7.47(dd，J＝8.3，1.9Hz，1H)，7.37(d，J＝8.5Hz，1H)，7.23(dd，J＝6.0，3.1Hz，2H)，7.16(d，J＝8.9Hz，2H)，5.25(s，2H)，2.59(s，3H).ESI-MSm/z:545.1[M+H]⁺。

N-(3-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-4-甲基苯基氨基甲酰基)-4-(2，4-二氯苄基氧基)苯甲酰胺(化合物26)

84％yield.m.p.241-242℃.¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)δ11.17(s，1H)，11.08(s，1H)，8.20(d，J＝8.6Hz，2H)，8.07(s，1H)，7.84(s，1H)，7.79(dd，J＝13.4，8.4Hz，4H)，7.63(d，J＝8.4Hz，1H)，7.50(d，J＝8.5Hz，1H)，7.37(dd，J＝5.5，3.1Hz，2H)，7.31(d，J＝8.8Hz，2H)，5.38(s，2H)，2.70(s，3H).ESI-MSm/z:545.1[M+H]⁺。

N-(3-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-4-甲基苯基氨基甲酰基)-4-(4-氟苄基氧基)苯甲酰胺(化合物27)

81％yield.m.p.176-178℃.¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)δ11.14(s，1H)，11.00(s，1H)，8.07(d，J＝8.9Hz，2H)，8.04(d，J＝2.2Hz，1H)，7.86(dd，J＝6.1，3.1Hz，2H)，7.83(d，J＝2.3Hz，1H)，7.59–7.54(m，2H)，7.52(dd，J＝12.2，6.3Hz，3H)，7.23(d，J＝8.9Hz，2H)，7.16(d，J＝9.0Hz，2H)，5.21(s，2H)，2.54(s，3H).ESI-MSm/z:495.1[M+H]⁺。

N-(3-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-4-氯苯基氨基甲酰基)-4-(2-氟苄氧基)苯甲酰胺(化合物28)

79％yield.m.p.230-232℃.¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)δ11.18(s，1H)，11.05(s，1H)，8.23(d，J＝2.6Hz，1H)，8.08(d，J＝8.9Hz，2H)，7.86(dd，J＝8.8，2.6Hz，1H)，7.75(dd，J＝6.1，3.1Hz，2H)，7.70(d，J＝8.8Hz，1H)，7.59(dd，J＝8.3，6.8Hz，1H)，7.45(dt，J＝9.4，3.7Hz，1H)，7.40(dd，J＝6.1，3.1Hz，2H)，7.27(dd，J＝15.9，8.0Hz，2H)，7.19(d，J＝9.0Hz，2H)，5.26(s，2H).ESI-MS m/z:515.1[M+H]⁺。N-(3-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-4-氯苯基氨基甲酰基)-4-(4-甲基苄基氧基)苯甲酰胺(化合物29)

83％yield.m.p.270-272℃.¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)δ12.76(s，1H)，11.13(s，1H)，11.00(s，1H)，8.20(d，J＝2.7Hz，1H)，8.06(d，J＝8.9Hz，2H)，7.87-7.70(m，3H)，7.61(dd，J＝17.1，7.9Hz，2H)，7.36(d，J＝8.0Hz，2H)，7.23(t，J＝5.7Hz，3H)，7.15(d，J＝9.0Hz，2H)，5.18(s，2H)，2.32(s，3H).ESI-MS m/z:511.1[M+H]⁺。N-(3-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-4-氯苯基氨基甲酰基)-4-(4-氟苄基氧基)苯甲酰胺(化合物30)

80％yield.m.p.270-272℃.¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)δ12.75(s，1H)，11.13(s，1H)，11.01(s，1H)，8.20(s，1H)，8.07(d，J＝8.5Hz，2H)，7.75(dd，J＝15.8，8.3Hz，2H)，7.61(dd，J＝15.2，8.2Hz，2H)，7.56-7.50(m，2H)，7.29-7.22(m，4H)，7.16(d，J＝8.6Hz，2H)，5.21(s，2H).ESI-MS m/z:515.9[M+H]⁺。

实施例2、MTT法细胞增殖抑制活性筛选

化合物的增殖抑制活性检测是采用MTT法，通过对人结肠癌细胞SW620和胃癌MGC803细胞的体外活性测试，以化合物Vismodegib和MRT-10作为对照。肿瘤细胞在96孔细胞培养皿中按每孔4×10³个细胞铺板。细胞在摄氏37℃，5％CO₂条件下在10％胎牛血清(FBS)的生长培养基(MEM)中培养。测试化合物以浓度梯度加入到培养基中，继续培养细胞48小时。新鲜的MTT(5mg/ml)加入到每个孔中，37℃孵育细胞4小时。甲臜晶体溶解在每孔的100μL DMSO中，在492nm(MTT甲臜的吸光度)和630nm(参考波长)的吸光度通过ELISAreader测量。所有化合物在每个细胞系中均测试了三次，以IC₅₀(50％抑制浓度)表示三次测定结果的平均值，并通过Bliss法进行计算。

用酶标仪于495nm处测量OD值，按如下公式计算细胞增殖抑制率(Inhibition Rate，IR％)：

IR％＝(空白对照OD-样品OD)/空白对照OD×100％

经计算，本发明实施例制备得到的化合物对SW620和MGC803细胞株的体外实验的半数抑制剂量IC₅₀值见表1。通过表1可知，本发明提供的N-3-苯并咪唑酰双胺类衍生物对抑制肿瘤细胞增长具有很好的抑制效果，尤其是对MGC803细胞有一定的选择性。

表1N-3-苯并咪唑酰双胺类衍生物类衍生物对SW620和MGC803细胞的半数抑制剂量IC₅₀值(单位μM/L)

因此，本发明化合物对hedgehog通路显示抑制效应，其中与其相似物对hedgehog通路显示出较强的抑制效应。

实施例3、体外抑制Hh信号通路活性实验方法

实验步骤：收集对数期生长的Gli Reporter-NIH3T3细胞，以2×10⁴/孔接种于96孔板中，37℃下CO₂培养箱孵育培养过夜。第二天，待细胞生长铺满96孔板后轻柔去除细胞培养液。配置含0.5％FBS、0.7μg/mL Sonic Hedgehog(SHH)激动剂的培养基。阳性化合物以上述培养基配置，以300nmol·L^-1开始，三倍梯度稀释，设8个梯度浓度组，二甲基亚砜(DMSO)为0.1％。设一组含SHH，不含药物为阳性对照；设一组不含SHH，不含药物做阴性对照。继续培养于37℃温度下CO₂培养箱培养48h。使用Reporter Assay检测试剂盒检测Luciferase荧光。数据处理：相对荧光倍数＝SHH刺激组荧光值/非SHH刺激组荧光值。结果及计算：化合物的浓度和相对荧光倍数通过Prism5.0(GraphPad的软件)统计分析，基于此计算化合物的IC₅₀值(达到抑制率最大值的50％所需的化合物的浓度)。

表2所选3个N-3-苯并咪唑酰双胺类衍生物类衍生物对Gli-luc reporter的半数抑制剂量IC₅₀值(单位nM/L)

由表1和表2的测试结果表明，本发明提供的N-3-苯并咪唑酰双胺类系列衍生物对人结肠癌细胞SW620和胃癌细胞MGC803的增长具有很好的抑制效果。

Claims

1.结构通式如式I所示的化合物或其药学上可接受的盐：

（式I）

式I中记号表示以下含义：

R₁为苯环上单取代或多取代的下述基团中的一种：氢、氟、氯、溴、甲基、甲氧基、羟基、硝基、氨基、乙酰氨基、三氟甲基、氰基；

R₂为氢、氯、氟、甲基、甲氧基、羟基、氨基；

X为硫或氧。

2.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于：所述R₁为苯环上多取代的基团，其中多取代是指2,3-双取代、2,4-双取代、2,5-双取代、2,6-双取代、3,4-双取代、3,5-双取代；或者2,4,6-三取代、3,4,5-三取代。

3.根据权利要求1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于：所述式I中，R₁为氢、2-氟、2-氯、2-溴、2-甲基、2-甲氧基、2-氰基、2-三氟甲基、3-氟、3-氯、3-溴、3-甲基、3-甲氧基、3-氰基、3-三氟甲基、4-氟、4-氯、4-溴、4-甲基、4-甲氧基、4-氰基、4-三氟甲基、2,5-二氟、3,5-二氟、2,6-二氯、2,4-二氯、3,4-二氯、2-氯-6-氟、4-氟-3-氯、3,5-二甲氧基、3,5-二-三氟甲基、3,4,5-三氟、3,4,5-三氯、2,4,6-三甲氧基、3,4,5-三甲氧基、2,4,6-三甲基；R₂为氢、氯、氟、甲基、甲氧基、羟基、氨基；X为硫或氧。

4.制备权利要求1中式I所示化合物的方法，包括下述步骤：

1）使式II所示化合物与二甲基苯胺发生缩合、环合、还原反应，得到式III所示化合物；

(式II) (式III)

其中，式II、III中R₂的定义同式I中R₂；

2）使式IV所示化合物与对羟基苯甲酸甲酯发生O-烃化反应得到式V所示化合物；然后在碱性条件下水解得到式VI化合物；

(式IV) (式V) (式VI)

其中，式IV、V、VI中R₁的定义同式I中R₁；

3）使式III所述化合物与式VI所示化合物在缩合剂存在下进行缩合反应，得到式I所示化合物(其中X=S)；式I所示化合物再经氧化反应，得到式I所示化合物(其中X=O)。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：

步骤1)中式II所示化合物与二甲基苯胺进行缩合反应的反应介质为四氢呋喃；进行环合反应的反应介质为冰醋酸，反应条件为110℃加热回流，反应时间为2-6小时，优选4小时；还原反应条件为氯化亚锡酸性条件；

步骤2) 中所述O-烃化反应的反应介质为丙酮；所述碱性条件由1.5M的氢氧化钠水溶液与乙醇的混合溶液提供，其中水与乙醇的体积比为1:5；

步骤3) 中所述缩合反应的反应介质为乙腈，反应条件为80℃加热回流，反应时间为4-8小时，具体选择6小时；氧化反应的反应介质为丙酮和水，其中丙酮与水的体积比为12:2，反应条件为双氧水弱碱性条件。

6.根据权利要求1-2所述的可用盐为结构通式I的化合物与无机酸及有机酸反应形成的盐，其中所述无机酸包括盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等；所述的有机酸包括甲酸、乙酸、丙酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸等。

7.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗真核细胞肿瘤中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述真核生物为哺乳动物；所述肿瘤细胞为癌细胞。

9.根据权利要求8所述的癌细胞，其具体为结肠癌细胞、胃癌细胞。

10.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗由与Hedgehog相关的异常细胞生长、功能或行为引起的疾病或病症的药物中的用途。

11.一种药物组合物，其特征在于含有权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。

12.根据权利要求11所述的药物组合物，其特征在于可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。

13.根据权利要求11所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式。

14.根据权利要求11所述的药学上可接受的载体，载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。