CN104515847B - 尿液铁蛋白轻链和重链的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种尿液铁蛋白及其轻链和重链的应用,具体为尿液铁蛋白在制备用于诊断或检测前列腺增生和前列腺癌的制剂中的应用。本发明通过研究证实与前列腺增生组相比,铁蛋白轻链在前列腺癌组患者的尿液中特异表达下调,铁蛋白重链在前列腺癌组患者的尿液中特异表达上调,从而提出检测尿液铁蛋白轻链及重链可用于前列腺增生和前列腺癌的鉴别诊断及前列腺癌的诊治。本发明发挥了尿液标本获取无创、可大规模重复取样、保存方便等独特的优势,利用随机尿标本检测前列腺增生和前列腺癌患者尿液中的铁蛋白及其轻链和重链。
Description
技术领域
本发明涉及尿液铁蛋白的新用途,尤其涉及尿液铁蛋白及其轻链和重链在前列腺增生和前列腺癌的鉴别诊断以及前列腺癌的诊治中的应用。
背景技术
前列腺癌是发生于男性前列腺组织中的恶性肿瘤,是前列腺腺泡细胞异常无序生长的结果,是老年男性泌尿生殖系统中常见的恶性肿瘤之一。随着我国经济发展、生活水平提高、饮食结构欧美化以及人口老龄化等因素影响,前列腺癌的发病率呈现上升趋势。
目前前列腺癌及前列腺增生确诊的金标准是前列腺穿刺活检组织病理检查,但该检查有创、费用相对昂贵、技术要求高,不合时宜的前列腺穿刺不仅使患者承担发生并发症的风险,增加患者的心理负担和医疗成本,而且阴性的活检结果并不能完全排除恶性肿瘤的可能。前列腺特异性抗原(PSA)是目前公认的最有价值的前列腺癌的肿瘤标志物,在多年的临床检验工作中,研究者发现PSA升高特别是在4ng/ml至10ng/ml之间时,前列腺增生和前列腺癌难以鉴别,且没有比较好的鉴别诊断化验指标。临床上,当患者PSA大于4.0ng/ml时高度怀疑为前列腺癌,需要进行前列腺穿刺活检确诊,但有研究表明约有25%的前列腺增生患者PSA大于4.0ng/ml,这部分患者接受了不必要的穿刺活检以及治疗手段,造成很大的精神及经济负担;约15.2%的前列腺癌患者PSA小于4.0ng/ml,这部分患者因此而延误了肿瘤治疗的最佳时期。因此PSA在前列腺增生与前列腺癌鉴别诊断方面存在着灰区。
铁蛋白(Ferritin)是一种分子量较大的含铁蛋白,由球形外壳和铁核心构成。它是一个由24个多肽亚基围绕一个含有4000多个铁原子的核心组成的复合分子,相对分子质量为4.5×105。铁蛋白分子的外壳即去铁蛋白,铁蛋白的亚基以重链(H链)和轻链(L链)两种方式存在。H链和L链的结构相似,都是由5个α-螺旋组成,位于整个亚基长轴的一端。H链和L链以不同比例聚合而成的纯聚合体或杂合体称为同工铁蛋白。铁蛋白是机体细胞内铁储存蛋白,血清、肝、脾组织中的铁蛋白大多含L链,与矿化及铁贮存有关;而肿瘤细胞中的铁蛋白大多为H链,含铁量低,铁储存作用很小,在胞内外铁运输和快速解毒中起主要作用。研究表明,铁和铁蛋白的紊乱是包括肿瘤在内的许多疾病的重要病因之一,在多数肿瘤组织中,铁蛋白水平高于正常组织,可存在于肿瘤相关的巨噬细胞内,抑制巨噬细胞和单核细胞对肿瘤的杀伤力。铁蛋白重链可抵制免疫反应,有助于癌细胞的生长和扩散,电镜下发现乳腺癌的恶性上皮细胞内铁蛋白丰富,而良性中则很少。HKa(双链高分子量激肽原)是HK(高分子量激肽原)的降解产物,可以通过分解内皮细胞中的缓激肽而抑制血管再生,铁蛋白与HKa有高度的亲和力,从而促进血管再生及炎症反应,增强肿瘤细胞的迁移。有研究表明,铁蛋白在前列腺癌患者体内的作用可能与该机制有关。
尿液作为人体代谢产物之一,富含了蛋白质的各种剪切、修饰、翻译等生命活动过程中的产物,其获取具有无创性、大规模重复取样性、保存方便等特点使其在动态的监测疾病过程和判断疗效等方面有独特的优势,其组成与性状反映机体的代谢状态,更直接反映了整个泌尿系统疾病发生、发展及预后的各种信息,奠定了其在临床检验尤其在分析泌尿生殖系统疾病方面的重要地位。目前存在希望通过尿液检查建立一种对前列腺增生和前列腺癌患者进行鉴别诊断及前列腺癌诊治的无创性检查的试剂盒及方法的需要,以弥补PSA在前列腺增生与前列腺癌鉴别诊断方面的灰区,对前列腺癌的早期筛查、诊断、预防及治疗均具有极其重要的意义。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的难题和需求,提供尿液铁蛋白在制备用于诊断或检测前列腺增生和前列腺癌的制剂中的应用。
优选地,在上述应用中,所述尿液铁蛋白的轻链的氨基酸序列如SEQID NO:1所示,所述尿液铁蛋白的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
优选地,所述制剂是一种试剂盒,其包括已包被兔抗人铁蛋白轻链或重链的多克隆抗体的固相载体。
优选地,所述酶为辣根过氧化物酶(HRP)。
优选地,所述试剂盒还包括铁蛋白轻链或重链标准品溶液、鼠抗人铁蛋白轻链或重链单克隆抗体浓缩液、酶标记的羊抗鼠IgG浓缩液、显色液A、显色液B、终止液和浓缩洗涤液。
优选地,所述试剂盒还包括盒体,所述固相载体为设置在所述盒体内的酶标板。
优选地,所述酶标板由外框支撑架和放置在所述外框支撑架上的可拆的12条酶标反应微孔条组成,所述每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔。
优选地,所述试剂盒还包括盖板膜、放置试剂的下凹瓶位和自封袋。
优选地,所述下凹瓶位共13个,且由塑料泡沫制成。
优选地,所述酶标板由聚苯乙烯制成。
本发明的目的还涉及检测尿液铁蛋白的制剂在制备用于诊断或检测前列腺增生和前列腺癌的制剂中的应用。特别是可以采用兔抗人铁蛋白轻链或重链的多克隆抗体制备用于诊断或检测前列腺增生和前列腺癌的制剂。该制剂可以是一种试剂盒。
发明人首先收集了泌尿外科病理诊断明确的前列腺增生和前列腺癌患者的清洁晨尿标本,离心后取上清,利用乙醇萃取尿蛋白,经双向电泳、考马斯亮蓝染色及脱色液脱色后用扫描仪获取凝胶图像,PDQuest2D软件分析扫描后的图像,将两组相差3倍以上界定为差异点。然后发明人对具有统计学意义的差异性多肽经酶切及乙腈处理后点靶,进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption ionization time offlight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)鉴定,采集数据获得由不同质荷比的蛋白峰构成的质谱多肽图。应用MASCOT搜索引擎及swiss-prot数据库进行检索,检索条件:肽指纹图中的肽片段质量控制在700~4000。肽片段分子量最大容许误差控制在±0.1Da。酶解片段不完全选择为1个,离子选择[M+H]和AVERAGE。最少匹配肽片段规定为5。Homo Sapiens默认,mass tolerance0.2Da,MS/MS tolerance0.6Da。从数据库检索得到前列腺增生和前列腺癌组间差异表达的铁蛋白轻链(ferritin,lightpolypeptide,HTL,蛋白号:P02792,氨基酸序列:mssqirqnys tdveaavnslvnlylqasyt ylslgfyfdr ddvalegvsh ffrelaeekr egyerllkmq nqrggralfq dikkpaedewgktpdamkaa malekklnqa lldlhalgsa rtdphlcdfl ethfldeevk likkmgdhlt nlhrlggpeaglgeylferl tlkhd)和铁蛋白重链(ferritin,heavy polypeptide1,FTH1,蛋白号:P02794,mttastsqvr qnyhqdseaa inrqinlely asyvylsmsy yfdrddvalknfakyflhqs heerehaekl mklqnqrggr iflqdikkpd cddwesglna mecalhleknvnqsllelhk latdkndphl cdfiethyln eqvkaikelg dhvtnlrkmg apesglaeyl fdkhtlgdsdnes),并且与前列腺增生相比,铁蛋白轻链和重链均在前列腺癌患者的尿液中呈高表达。
本发明通过研究证实与前列腺增生组相比,铁蛋白轻链和重链在前列腺癌组患者的尿液中特异表达上调,从而提出检测尿液铁蛋白轻链及重链可用于前列腺增生和前列腺癌的鉴别诊断及前列腺癌的诊治。
本发明发挥了尿液标本获取无创、可大规模重复取样、保存方便等独特的优势,利用随机尿标本检测前列腺增生和前列腺癌患者尿液中的铁蛋白及其轻链和重链。
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂,下文特举较佳实施例,并配合附图,作详细说明如下。
附图说明
图1是前列腺增生和前列腺癌的双向电泳图谱。A为前列腺增生患者的电泳图,B为前列腺癌患者的电泳图。
图2是铁蛋白轻链在图1的前列腺增生和前列腺癌的双向电泳图谱中的点。A中箭头所指为铁蛋白轻链在前列腺增生的双向电泳图谱中的点,B中箭头所指为铁蛋白轻链在前列腺癌的双向电泳图谱中的点。
图3是铁蛋白重链在图1的前列腺增生和前列腺癌的双向电泳图谱中的点。A中箭头所指为铁蛋白重链在前列腺增生的双向电泳图谱中的点,B中箭头所指为铁蛋白重链在前列腺癌的双向电泳图谱中的点。
图4是铁蛋白轻链质谱图。
图5是铁蛋白重链质谱图。
图6是铁蛋白/肌酐在前列腺增生和前列腺癌患者尿液中的表达。
图7是WB(Western Blot)验证铁蛋白轻链在前列腺增生和前列腺癌患者尿液中的表达。
图8是WB(Western Blot)验证铁蛋白重链在前列腺增生和前列腺癌患者尿液中的表达。
图9是免疫组化验证铁蛋白轻链在前列腺增生和前列腺癌患者组织中的表达。A为铁蛋白轻链在前列腺增生患者组织中的表达,B为铁蛋白轻链在前列腺癌患者组织中的表达。
图10是免疫组化验证铁蛋白重链在前列腺增生和前列腺癌患者组织中的表达。A为铁蛋白重链在前列腺增生患者组织中的表达,B为铁蛋白重链在前列腺癌患者组织中的表达。
图11是设置在本发明所述的试剂盒的盒体内的酶标板的示意图,其中1为酶标反应微孔条,2为酶标板的外框支撑架,3为包被有铁蛋白轻链或重链融合蛋白多克隆抗体的孔。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,下面结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
实施例1 尿蛋白的提取
分别收集首都医科大学附属北京世纪坛医院体检中心2010年3月份9名(平均年龄32岁)体检健康的正常人的新鲜晨尿;泌尿外科2010年11月份至2012年3月份32名(平均年龄73岁)病理确诊为前列腺增生患者和9名(平均年龄76岁)病理确诊为前列腺癌患者的新鲜晨尿。每份标本50ml,置于干燥洁净的250ml容器中,2小时内离心1500rpm,5min,取上清,在显微镜下确认尿沉渣与上清尿液分离完全,将上清与预冷无水乙醇1:3体积比混匀,4℃静置30min,-20℃过夜,4℃离心12000rpm,15min,去上清留取沉淀并将样品溶于裂解液中。超声50Hz、7秒,冷却9.9秒,循环17次,4℃离心12000rpm,20min,去沉淀取上清,分装50μl/EP,-80℃冻存备用。应用BCA试剂盒测定各蛋白浓度,日立7080-ISE生化分析仪测定尿液标本肌酐含量,Beckman coulter Unicel DXI800Access免疫分析仪测定尿液铁蛋白含量。
前列腺增生和前列腺癌患者尿液中铁蛋白/肌酐比值见图6,从图6中很明显看出铁蛋白/肌酐在前列腺癌患者尿液中显著高表达。
实施例2 尿蛋白双向凝胶电泳
从-80℃冰箱取出冻存蛋白,室温下复溶,根据蛋白浓度取适当体积的蛋白溶液,使蛋白上样量达到2mg,将蛋白溶液与水化上样缓冲液混匀,总上样体积600μl,沿着聚焦盘槽中的边缘从左至右线性加入样品,加完样后,用镊子去掉预制胶条上的保护层,将胶条胶面朝下放置于聚焦盘中样品溶液上,其中胶条的正极对应聚焦盘的正极,盖上聚焦盘的盖子,室温放置1小时后,将聚焦盘放入电泳仪中进行一向等电聚焦,具体参数参见表1。聚焦结束的胶条,立即进行平衡、二向SDS-PAGE电泳。
表1 等电聚焦参数
二向SDS-PAGE时先配置12%丙烯酰胺凝胶两块,其配方具体参见表2。将配置好的溶液灌入玻璃板夹层中,上部留1-2cm的空间,用双蒸水封面,保持胶面平整。将平衡后的胶条至于凝胶上面并与之紧密接触,加入融化后的琼脂糖封胶液。待凝固后将凝胶转移至电泳槽开始电泳,起始电压为110V,待样品完全走出IPG胶条浓缩成一条线后加大电压至200V。电泳结束后进行G250考马斯亮蓝染色及过夜脱色。参见图1和图2,A为前列腺增生患者的双向电泳图,B为前列腺癌患者的双向电泳图。
表2 120ml 12%SDS-PAGE凝胶配方
实施例3 差异蛋白点的筛选及鉴定
应用PDQuest2D软件分析扫描仪获取的染色后的2-DE凝胶图像,应用解剖刀将前列腺增生和前列腺癌凝胶中的差异点(两者相差3倍以上)切下,双蒸水冲洗,50mM碳酸氢胺/乙腈(l:l)溶液30μl,37℃脱色20min,吸干;加乙腈覆盖胶块,当胶块萎缩变白后去掉乙腈,用纯乙腈脱水至白色后真空干燥;加入15-20μl胰蛋白酶过夜消化,加入100μl 5%三氟乙酸40℃加热水浴1h,每30min超声一次,3min/次,冰冻干燥;向胶块中加入100μl 50%乙腈和2.5%三氟乙酸,30℃保温1h,每30min超声一次,3min/次,氮气吹干乙腈后,冰冻干燥;向冻干肽段加入2~10μl的0.1%三氟乙酸溶液混匀;将基质和样品以1:1体积混合后取0.5-1μl加到不锈钢样品靶上,空气中放置几分钟,待溶剂挥发干后将样品靶送入ABI4700质谱仪。质谱仪条件为紫外激光波长355nm,循环率200Hz,加速电压20KV,质量分辨率1SOODa,质量范围700到4000m/z,以基质峰和胰酶自动降解离子峰作为内标校正质谱峰。
应用MASCOT搜索引擎及swiss-prot数据库进行检索,检索条件:肽指纹图中的肽片段质量控制在700~4000。肽片段分子量最大容许误差控制在±0.1Da。酶解片段不完全选择为1个,离子选择[M+H]和AVERAGE。最少匹配肽片段规定为5。Homo Sapiens默认,mass tolerance0.2Da,MS/MS tolerance0.6Da。从数据库检索得到前列腺增生和前列腺癌组间差异表达的铁蛋白轻链(ferritin,light polypeptide,HTL,蛋白号:P02792)和铁蛋白重链(ferritin,heavy polypeptide1,FTH1,蛋白号:P02794),并且与前列腺增生相比,铁蛋白轻链和重链均在前列腺癌患者的尿液中呈高表达。
铁蛋白轻链和重链在前列腺增生和前列腺癌患者图谱中的位置请分别参照图2和图3,铁蛋白轻链和重链的质谱图请分别参照图4和图5。
实施例4 铁蛋白轻链及重链在前列腺增生和前列腺癌患者尿液中的Western Blot验证
取前列腺增生和前列腺癌患者(同实施例1)的新鲜2小时内清洁中段尿50ml,置于塑料容器内,1500rpm离心5min,取上清,弃沉渣;将上清与无水乙醇按1:3体积比混匀,4℃静置30min后;12000rpm15min,去上清留沉淀;将沉淀晾干后溶于上样缓冲液(尿素9M、CHAPS4%、DTT65mM、0.2%两性电解质)中,-20℃过夜冻存裂解;4℃ 14000rpm离心20min后,取上清,分装,应用BCA试剂盒检测蛋白浓度。安装电泳槽检查气密性后,分别配制1.5mm 20ml 12%分离胶和6ml 5%浓缩胶,先灌分离胶,待凝固后再灌浓缩胶,将30μg尿蛋白与2Xloading buffer1:1混匀后上样,开始电泳。初始电压为60V,待溴酚蓝电泳过浓缩胶后,调节电压至120V,至到达分离胶2/3处停止电泳,切下目的胶后进行转膜。转膜时由负极到正极依次为滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸的顺序进行电转,电压90V,转膜90min。转膜后取出PVDF膜,浸泡在封闭液中(PBST+5%脱脂奶粉),摇床摇2h,1h时换液一次。分别按照1:200用封闭液稀释鼠抗人铁蛋白轻链单克隆抗体(美国Santa cruz公司)或鼠抗人铁蛋白重链单克隆抗体(美国Santa cruz公司),杂交袋将膜与抗体密封,4℃孵育过夜。PBST洗膜20min/每次,共3次。按照1:1000比例,用封闭液稀释HRP-羊抗小鼠IgG(鼎国,北京)后,加入杂交袋中,封闭杂交袋后室温孵育90min。PBST洗膜15min/每次,共3次。在暗室按照增强型HRP-DAB底物显色试剂盒(天根,北京)说明进行显色。
具体结果请详见图7和图8。从图中明显看出,铁蛋白轻链和重链在前列腺癌组中的表达显著升高。
实施例5 铁蛋白轻链及重链在前列腺增生和前列腺癌患者组织中的免疫组化验证
选择首都医科大学附属北京世纪坛医院经病理确诊的前列腺增生和前列腺癌患者(同实施例1)的病理切片,二甲苯脱蜡10min,分别用100%、100%、90%、70%酒精下进行脱水,各4min,PBS洗3次,5min/次;滴加50μl内源性过氧化物酶以阻断非特异性结合位点,室温,20min,PBS洗3次,5min/次;加入50μl动物血清封闭,室温孵育30min;经抗原修复后分别加入鼠抗人铁蛋白轻链单克隆抗体(美国Santa cruz公司)或鼠抗人铁蛋白重链单克隆抗体(美国Santa cruz公司),37度孵育1h后,PBS清洗3次,5min/次;滴加羊抗小鼠IgG(鼎国,北京)酶标二抗,37度孵育30min,PBS洗3次,5min/次。在暗室按照增强型HRP-DAB底物显色试剂盒(天根,北京)说明进行显色。显色适宜后用蒸馏水稍加冲洗,苏木素复染1-2min,自来水蓝化,70%、90%、100%酒精依次上行脱水后二甲苯透明,中性树脂封片,显微镜下观察。
具体结果请详见图9和图10。从图中明显看出,铁蛋白轻链和重链在前列腺癌组中的表达显著升高。
实施例6 试剂盒的制备
1.包被抗体和酶标抗体工作浓度的选择
按照Pierce公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书操作,测定抗体及抗原的浓度,然后采用标准的棋盘测定方法,用包被缓冲液(8.4克碳酸氢钠、3.56克碳酸钠溶于1升去离子水中,调pH值至9.05)分别将兔抗人铁蛋白轻链或兔抗人铁蛋白轻链多克隆抗体(美国Santa cruz公司)稀释至浓度为20.0μg/ml、2.0μg/ml和0.2μg/ml,分别在ELISA板上包被,每个浓度包括三个纵行,4℃过夜,PBST洗涤3次。在其中一个横行的包被孔中加入强阳性抗原液,另一横行中加入弱阳性抗原液,第三行加入阴性对照。37℃孵育2小时,PBST洗涤4次。分别加入鼠抗人铁蛋白轻链或鼠抗人铁蛋白重链单克隆抗体(美国Santa cruz公司),37℃孵育1小时,PBST洗涤4次。加入HRP标记的二抗,37℃孵育30分钟,PBST洗涤4次,加入OPD底物,室温避光放置20分钟,加入中止液(2M硫酸),酶标仪上读数。选择包被抗体最佳浓度。
2.试剂盒的制备
将兔抗人铁蛋白轻链或重链融合蛋白多克隆抗体用包被缓冲液进行稀释,将其加入到96孔酶标板,4℃包被过夜。倒去未包被的液体,用PBST洗涤3遍,加入200μl阻滞液阻止非特异性结合位点,37℃孵育1小时,PBST洗脱3次。放入4℃保存备用。试剂盒分装加入鼠抗人铁蛋白轻链或重链多肽单克隆抗体、HRP标记的羊抗鼠IgG,其它通用试剂Tween-20和OPD。
3.试剂盒的组成
用于检测前列腺癌和前列腺增生患者尿液铁蛋白轻链或重链的ELISA试剂盒,包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、12瓶试剂,其中酶标板是采用96孔试剂板作为固相载体,在试剂盒微孔中预包被兔抗人铁蛋白轻链或重链多克隆抗体,12瓶试剂分别为6瓶铁蛋白轻链或重链标准品溶液、1瓶酶标二抗、1瓶抗体浓缩液(即鼠抗人铁蛋白轻链或重链单克隆抗体浓缩液)、1瓶显色液A、1瓶显色液B、1瓶终止液、1瓶浓缩洗涤液(具体请参照图11)。
进一步地,该试剂盒还包括一张盖板膜和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋,其中盒体是硬纸盒;96孔试剂板为聚苯乙烯酶标板,放于真空铝箔袋内;盖板膜是塑料硬膜;标准品溶液用红色帽的白色PE塑料瓶,酶标二抗用黑色帽的白色PE塑料瓶,抗体浓缩液用绿色帽的白色PE塑料瓶,显色液A液用白色帽的白色PE塑料瓶,显色液B液用红色帽的黑色PE塑料瓶,终止液用黄色帽的白色PE塑料瓶,浓缩洗涤液用透明帽的半透明PE塑料瓶。下凹瓶位共13个,由塑料泡沫制成。
酶标板是由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成,每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔,每个反应孔预包被兔抗人铁蛋白轻链会重链多克隆抗体;盖板膜大小与酶标板横切面大小一致;标准品溶液6瓶,1ml/瓶;酶标二抗1瓶,12ml;抗体浓缩液1瓶,1ml;显色液A液1瓶,12ml;显色液B液1瓶,12ml;终止液1瓶,15ml;浓缩洗涤液1瓶,50ml。
实施例7 试剂盒灵敏度的检测
将铁蛋白轻链或重链重组蛋白(德国OriGene公司)用PBS稀释成200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、10μg/ml、2μg/ml、0.5μg/ml、0.05μg/ml、0.01μg/ml、0μg/ml,每孔100μl加入到上述包被好的酶标板中,37℃孵育2小时。用含0.1%Tween-20的PBS(PBST)洗涤3遍。
按1∶1000将鼠抗铁蛋白轻链或重链多肽单克隆抗体稀释,每孔加入100μl,37℃孵育1小时,PBST洗4遍。加入HRP标记二抗,37℃孵育30分钟,PBST洗4遍。加入100μl OPD底物室温放置15分钟,加入2M的硫酸,450nm波长的酶标仪下读数。
检测最低的铁蛋白轻链或重链的量,结果显示,该试剂能检测出0.01μg/ml铁蛋白轻链或重链的浓度,说明具有较高的检测灵敏度。经上述实验表明本发明的试剂盒检测前列腺增生和前列腺癌患者尿液样本中铁蛋白轻链或重链的含量,具有很高的灵敏度,样本的最低检测限0.01μg/ml,回收率为90%±11%。本试剂盒所需仪器较少,只需要酶标仪、振荡器、离心机、移液器等,所需成本低。
实施例8 试剂盒的特异性、稳定性的检测
取前列腺增生和前列腺癌患者(首都医科大学附属北京世纪坛医院)待测清洁中段随机尿30-50ml,装入清洁的尿管,常温下1500rpm离心5分钟,取上清待检。
纯化定量的铁蛋白轻链或重链基因重组蛋白作为标准品,将抗原(离心后的尿标本)按1∶3稀释后,加入到前面已经包被好的酶标板中,37℃孵育2小时,用洗板液PBST洗去未结合的抗原,吸干残余液体。加入鼠抗人铁蛋白轻链或重链多肽单克隆抗体37℃孵育1小时,PBST洗去未结合的抗体,吸干残余液体。加入HRP标记的二抗,37℃孵育30分钟,PBST洗涤4次,吸干残余液体。加入显色底物,室温放置10分钟,可见各孔显示不同深度的黄色,加入2M硫酸中止反应,酶标仪在450nm波长读数,计算样本中铁蛋白轻链或重链的含量。
通过该方法,发明人分别检测了50例前列腺增生和前列腺癌患者的随机尿中铁蛋白轻链或重链的含量,准确率均达到92%以上,具有良好的特异性。
分别取两位前列腺增生和前列腺癌患者的随机尿,利用上述方法进行了ELISA测定,每天测定一次,共重复10次,按公式变异系数(CV)=S/X×100%(S为标准差,X为平均值)计算批间及批内变异系数。最终得到铁蛋白轻链的批内与批间变异系数分别为3.83%和4.95%,铁蛋白重链的批内与批间变异系数分别为4.01%和5.20%,说明稳定性好。
以上详细说明了本发明的优选实施例,但本发明并不限于这些实施例,在本发明的申请范围内可以进行各种改变。尽管上文只是详细阐述了本发明的几个优选实施例,但是,所属技术领域的技术人员很清楚在实质上不脱离本发明的新颖性教导和优点的范围内,可以对例示性的实施例进行各种修改。
Claims (10)
1.尿液铁蛋白在制备用于诊断或检测前列腺增生和前列腺癌的制剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述尿液铁蛋白的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,所述尿液铁蛋白的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于,所述制剂是一种试剂盒,其包括已包被兔抗人铁蛋白轻链或重链的多克隆抗体的固相载体。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述试剂盒还包括铁蛋白轻链或重链标准品溶液、鼠抗人铁蛋白轻链或重链单克隆抗体浓缩液、酶标记的羊抗鼠IgG浓缩液、显色液A、显色液B、终止液和浓缩洗涤液。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述酶为辣根过氧化物酶。
6.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述试剂盒还包括盒体,所述固相载体为设置在所述盒体内的酶标板。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述酶标板由外框支撑架和放置在所述外框支撑架上的12条可拆装酶标反应微孔条组成,每个所述可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔。
8.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述试剂盒还包括盖板膜、放置试剂的下凹瓶位和自封袋。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述下凹瓶位共13个,且由塑料泡沫制成。
10.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述酶标板由聚苯乙烯制成。
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