CN104510732A - 1-(烷基亚磺酰基)-2-异硫氰基烷基-1-烯烃在制备治疗多种癌症与肿瘤的药物中的应用 - Google Patents
1-(烷基亚磺酰基)-2-异硫氰基烷基-1-烯烃在制备治疗多种癌症与肿瘤的药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种异硫氰酯在制备治疗多种癌症与肿瘤的药物组合物的应用，更具体地，该药物组合物包括1-(烷基亚磺酰基)-2-异硫氰基烷基-1-烯烃。本发明还提供了人或哺乳动物服用该药物组合物的应用方法。本发明还提供一种1-(烷基亚磺酰基)-2-异硫氰基烷基-1-烯烃在制备保健品与食品添加剂上的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种1-(烷基亚磺酰基)-2-异硫氰基烷基-1-烯烃(结构式I)用于治疗或预防人类或哺乳动物的多种癌症与肿瘤的应用。
1-(烷基亚磺酰基)-2-异硫氰基烷基-1-烯烃(结构式I)
本发明还涉及结构式I所示的化合物在制备用于治疗人类或哺乳动物的多种癌症与肿瘤的药物中的应用。
本发明还涉及结构式I所示的化合物在制备用于预防人类或哺乳动物的多种癌症的保健品和食品添加剂中的应用。
本发明还涉及莱菔素(4-异硫氰基-1-(甲基亚磺酰基)-1-丁烯，结构式II)用于治疗或预防人类或哺乳动物的多种癌症与肿瘤的应用。
莱菔素(结构式II)
本发明还涉及结构式II所示的化合物在制备用于治疗人类或哺乳动物的多种癌症与肿瘤的药物中的应用。
本发明还涉及结构式II所示的化合物在制备用于预防人类或哺乳动物的多种癌症的保健品和食品添加剂中的应用。
本发明涉及的含有莱菔素的药用组合物具有抑制多种癌细胞增殖的能力，所示癌细胞包括但不限于、肺癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、甲状腺癌、胰腺癌、食道癌、肝癌、头颈肿瘤、宫颈癌、子宫内膜癌、恶性黑色素瘤以及膀胱癌。
背景技术
癌症由部分在控制增殖和分化的机制过程中叛变的正常细胞衍生而来。在细胞分化过程中“叛变”细胞脱离正轨，自行设定增殖速度。癌症细胞能够渗入并破坏正常的人体组织，遍布于人或动物的体内。目前，癌症是对人类健康危害最大的疾病之一。癌症己成为世界上第二大死亡原因，据世界卫生组织统计数据显示，2007年全球共有760万人死于癌症，2030年全球因癌症死亡的人数可能将增至1320万，而且，全球20％的新发癌症患者分布在中国，全球24％的癌症死亡患者分布在中国。2008年统计数据显示，肺癌己经成为我国死亡率最高的癌症，肝癌则是我国死亡率仅次于肺癌的癌症。近三十年来，中国癌症发病率和死亡率均呈现升高的态势。因此，在发展中国家和世界上的其他地方，迫切地需要一种能够对癌症有效和经济的预防和治疗方法、以及相应的药物、保健品和食品添加剂。
肿瘤一般分为实体瘤和非实体瘤(血液系统恶性肿瘤)。实体瘤包括头颈癌、乳腺癌、肺癌、皮肤癌、肾肿瘤、结肠癌、直肠癌、胰腺癌以及前列腺癌。非实体瘤包括白血病和淋巴瘤。实体瘤通常采用手术切除或者手术切除与放射疗法相结合的治疗手段。如果癌症发生转移则会采取化学治疗的手段。而非实体瘤通常采用化学治疗。
本发明则给出了预防和治疗实体瘤的方法。化学治疗有两种方式：(1)使用对癌细胞和正常细胞都有杀伤能力的细胞毒性物质直接消灭癌细胞；(2)通过干扰性激素的产生进而阻断激素依赖的癌症细胞生长。用于临床癌症治疗的具有细胞毒性的化疗药物可分为以下几种：烷化剂、抗肿瘤抗生素、抗代谢剂、生物制剂、激素制剂、中草药/植物衍生剂。预防医学统计数据显示，
长期大量食用含有丰富芸苔属植物(如：西兰花、卷心菜、芝麻菜、独行菜、萝卜和甘蓝等)食物的人群，其癌症的发病率低于不食用和少量食用芸苔属植物的人群，特别是肺癌、直肠癌、结肠癌、胃癌、前列腺癌(Higdon J V et al.Pharmacology Research2007，55：224-236；US7402569B2；US2011/0195432A1；US2010/0183740A1；US2006/01677089A1)。
人们认为十字花科植物(尤其是芸苔属植物)在降低癌症发生风险方面发挥了重要作用。充分的科学实验数据显示，芸苔属植物中富含莱菔硫烷的前体物质——萝卜硫苷。萝卜硫苷指莱菔硫烷-硫代葡萄糖苷(SGS)，它是具有很大诱导Phase II解毒酶产生潜力的天然产物。Phase II解毒酶能促使癌细胞快速凋亡，从而达到抗癌、防癌的效果。(singh A V et al.Carcinogenesis2004，25：83-90；Nastruzzi C et al.J.Agric.Food Chem.1996，44：1014-1021；Zhang Y＆Tang L. Acta Pharmacologica Sinica2007，28：1343-1354；Higdon J V et al.Pharmacology Research2007；Pham N A et al.Mol Cancer2004，3：1239-1248)。萝卜硫苷是一种间接的长效抗氧化剂。药代动力学研究表明，在萝卜中分离得到的黑芥子酶可以水解西兰花中的萝卜硫苷。黑芥子酶是在咀嚼或者加工的过程中释放。萝卜硫苷在被黑芥子酶水解后产生一个不稳定的中间体，该中间体进行重排后形成一种拥有抗癌活性的化合物——莱菔硫烷(简称SFN)。(Nastruzzi C et al.J.Agric.Food Chem.1996，44：1014-1021；Vaughn S F et al.Industrial Crops and Products2005，21：193-202；Fahey J W et al.Journal of Chromatography A 2003，966：85-93；Zhang Y＆Tang L. Acta Pharmacologica Sinica2007，28：1343-1354)。
莱菔硫烷是异硫氰酸酯化合物的一种，通常是从十字花科蔬菜中芸苔属植物里获得，萝卜、花椰菜、椰菜芽甘蓝、卷心菜、芥末、辣根、西兰花中都含有丰富莱菔硫烷。莱菔硫烷具有治疗癌症的潜力，能够减少癌症干细胞的生长并能削弱它们的生存能力。含有莱菔硫烷的化合物已经被用作化学预防剂。鉴于异硫氰酸酯类化合物有预防和治疗癌症的潜力，因此在医学和药物界迫切需要找到更多的对多种癌症具有预防和化学治疗更有效的化合物，以用于制备能够预防或治疗癌症的药物或制备能够预防或者治疗多种癌症的经济有效的保健品和食品添加剂。
莱菔素(简称SFE)是萝卜籽中主要的含硫化合物，在西兰花和紫甘蓝中也有一定的含量。莱菔素具有抗病毒，抗真菌、抗细菌(例如葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、大肠杆菌。详见表格)的活性。论抗病毒效果，对革兰氏阳性菌优于革兰氏阴性菌，对脱氧核糖核酸病毒优于核糖核酸病毒，它的活性会被血清或者一些含硫化合物(如硫化氢、巯基乙酸、胱氨酸和谷胱甘肽)所抑制。传统中药理论已经发现使用萝卜具有抗病毒、抗真菌和抗病毒的效果。考虑到莱菔素能平衡体内甲状腺素和降血钙素的产生，在俄罗斯，萝卜已经长期用于治疗各种类型的甲状腺疾病。
发现于萝卜籽(十字花科)中的莱菔素[4-异硫氰酸基-(甲基亚磺酰基)-1-丁烯]为莱菔硫烷结构类似物，对其抗癌研究的报道很少，己有的少量研究表明，莱菔素具有抑制大肠癌 癌细胞的作用，从而可能具有防治大肠癌的效果。
然而，这些研究非常初步，而且也无研究涉及其与莱菔硫烷的对比研究，特别是，由于癌症非常复杂，不同种类的癌症通常具有显著不同的特性，对不同的抗癌药物的敏感性也通常有差异，此外，即使有研究表明莱菔素对某类肿瘤或者癌症有效，也无法确定莱菔素对其他肿瘤或者癌症是否有效，或者，某种抗癌药物对某个/某些种类的肿瘤或癌症的效果优于莱菔素，但不能确定其对其他肿瘤或者癌症的效果是否优于莱菔素。此外，也无莱菔素与临床现有的一线抗癌药物的对比研亢以确定其抗癌的有效性和安全性，进而显示其在临床应用抗癌潜力的研究。
本发明中所引述的文献，著作，专利和专利申请的公开书，其中全部或局部都明确地和独立地都在本专利申请书引用参考。
发明概述
本发明意料之外地发现，莱菔素不但对大多数癌细胞具有与莱菔硫烷和其它几种一线化疗或者靶向药物，包括，但不限于厄洛替尼、吉西他滨和紫杉醇相当或者更优的抑制作用，同时其安全性显著优于莱菔硫烷、顺铂、5-氟尿嘧啶(5-FU)、紫杉醇和阿霉素，因而其对于多种癌症有应用价值，包括，但不限于肺腺癌、肺鳞癌、胰腺癌，肝癌、乳腺癌、宫颈癌和恶性黑色素瘤。
因此，在本发明的一个方面，提供了1-(烷基亚磺酰基)-2-异硫氰基烷基-1-烯烃(结构式I)用于制备治疗或预防人类或哺乳动物的多种癌症的药物组合物的应用。
1-(烷基亚磺酰基)-2-异硫氰基烷基-1-烯烃(结构式I)
其中R1、R2和R3独立地代表取代的或未取代的烷基、烯烃、炔基、芳基、烷氧基、环氧基，环氮基和芳氧基。优选地，R1是甲基。R2和R3都为氢原子。R4是被取代的或未被取代的亚烷基，-CH2-O-CH2-，烷氧芳基。优选地，R4为亚甲基。n的数值在1-10之间。优选地，n的数值在1-5之间。更优选地，n＝2。其中R2-C1＝C2-R3的双键可以为顺式或反式结构。
在本发明的另一方面，提供了1-(烷基亚磺酰基)-2-异硫氰基烷基-1-烯烃(结构式I)用于制备作预防人类或哺乳动物多种癌症的保健品或食品添加剂的应用。
本发明另一个目的是提供莱菔素(结构式II)用于制备治疗或预防人类或哺乳动物的多种癌症的药物组合物上的应用。
莱菔素：1-(甲基亚硫酰基)-4-异硫酸基-1-丁烯(结构式II)
本发明另一个目的是提供莱菔素(结构式II)在制备预防人类或哺乳动物多种癌症的保健品和食品添加剂中的应用。
莱菔素是异硫氰酸酯家族的一员。莱菔素与莱菔硫烷(结构式III)的结构区别是，莱菔 素在α位的碳上有一个不饱和的C＝C键。
莱菔硫烷：1-(甲基亚硫酰基)-4-异硫氰基丁烷(结构式III)
在本发明的一个具体实施方案中，所述莱菔素是从萝卜种子，萝卜苗或萝卜中提取。
在本发明的另一个具体实施方案中，所述药物组合物、保健品或食品添加剂中含有药物用载体、添加剂和药物用赋形剂。
本发明所述的药物组合物、保健品和食品添加剂对多种癌症具有抑制扩增作用，这里提到的癌症包括，但不限于，肺癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、甲状腺癌、胰腺癌、食管癌、肝癌、头颈癌、宫颈癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、膀胱癌。
发明详述
本发明提供了结构式II所示的莱菔素作为药用化合物，它分离自芸苔属植物中，所述芸苔属植物包括(并不限于)：萝卜、西兰花、卷心菜、芥菜和辣根。该化合物对于前面提及的癌症具有有效的预防和治疗作用。
本发明中在预防和治疗许多不同癌症时使用的莱菔素也可以用于食品、食品添加剂和保健品。
本发明利用人A549癌细胞株体外抗癌实验数据清楚地说明，莱菔素对人肺腺癌细胞生长增殖具有比莱菔硫烷更强的抑制作用。在利用不同浓度莱菔素和莱菔硫烷给药48小时后(给药浓度为：10、20、30、40和50μM)，经计算莱菔素对A549人肺腺癌细胞生长的半数抑制浓度(IC50)为：10.5μM；莱菔硫烷对A549人肺腺癌细胞生长的半数抑制浓度(IC50)为：14.7μM。
本发明利用人H460癌细胞株体外抗癌实验数据清楚地说明，莱菔素对人肺鳞癌细胞生长增殖具有比莱菔硫烷更强的抑制作用。在利用不同浓度莱菔素和莱菔硫烷给药48小时后(给药浓度为：10、20、30、40和50μM)，H460经计算，莱菔素对H460人肺鳞癌细胞生长的半数抑制浓度(IC50)为：25.7μM；莱菔硫烷对H460人肺腺癌细胞生长的半数抑制浓度(IC50)为：34.62μM。
本发明利用人PANC-1癌细胞株体外抗癌实验数据清楚地说明，莱菔素对人胰腺癌细胞生长增殖具有比莱菔硫烷更强的抑制作用。在利用不同浓度莱菔素和莱菔硫烷给药48小时后(给药浓度为：10、20、30、40和50μM)，经计算，莱菔素对PANC-1人胰腺癌细胞生长的半数抑制浓度(IC50)为：5.18μM；莱菔硫烷对PANC-1人胰腺癌细胞生长的半数抑制浓度(IC50)为：6.73μM。
本发明利用人MCF-7癌细胞株体外抗癌实验数据清楚地说明，莱菔素对人乳腺癌细胞生长增殖具有比莱菔硫烷更强的抑制作用。在利用不同浓度莱菔素和莱菔硫烷给药48小时后(给药浓度为：10、20、30、40和50μM)，经计算，莱菔素对MCF-7人乳腺癌细胞生长的半数抑制浓度(IC50)为：14.3μM；莱菔硫烷对MCF-7人乳腺癌细胞生长的半数抑制浓度(IC50)为：19.46μM。
本发明利用人HepG2癌细胞株体外抗癌实验数据清楚地说明，莱菔素对人肝癌细胞生长增殖具有抑制作用。在利用不同浓度莱菔素和莱菔硫烷给药48小时后(给药浓度为：10、20、30、40和50μM)，经计算，莱菔素对HepG2人肝癌细胞生长的半数抑制浓度(IC50) 为：59.0μM；莱菔硫烷对HepG2人肝癌细胞生长的半数抑制浓度(IC50)为：47.33μM。
本发明利用人HeLa癌细胞株体外抗癌实验数据清楚地说明，莱菔素对人宫颈癌细胞生长增殖具有与莱菔硫烷类似的抑制作用。在利用不同浓度莱菔素和莱菔硫烷给药48小时后(给药浓度为：10、20、30、40和50μM)，经计算，莱菔素对HeLa人肝癌细胞生长的半数抑制浓度(1C50)为：24.1μM；莱菔硫烷对HeLa人肝癌细胞生长的半数抑制浓度(IC50)为：25.8μM。
本发明利用人A375癌细胞株体外抗癌实验数据清楚地说明，莱菔素对人恶性黑色素癌细胞生长增殖具有比莱菔硫烷更强的抑制作用。在利用不同浓度莱菔素和莱菔硫烷给药48小时后(给药浓度为：10、20、30、40和50μM)，经计算，莱菔素对A375人恶性黑色素癌细胞生长的半数抑制浓度(IC50)为：26.088μM；莱菔硫烷对MCF-7人乳腺癌细胞生长的半数抑制浓度(IC50)为：33.11μM。
本发明利用人A549和H460癌细胞株体外抗癌实验数据清楚地说明，较之厄洛替尼、吉西他滨和紫杉醇，莱菔素对肺癌细胞生长增殖具有更为显著的抑制效果。
本发明利用人MCF-7癌细胞株体外抗癌实验数据清楚地说明，较之厄洛替尼、吉西他滨和紫杉醇，莱菔素的抑癌效果虽不及相同浓度的紫杉醇，却显著高于吉西他滨和5-FU。
本发明利用人外周血单个核细胞进行细胞毒性实验数据清楚地说明，莱菔素人白细胞的毒性显著低于莱菔硫烷、顺铂、5-氟尿嘧啶(5-Fu)、紫杉醇和阿霉素。进一步利用大鼠心肌细胞进行药物毒性评价试验数据说明，莱菔素的毒性显著低于莱菔硫烷和阿霉素。
本发明中包含莱菔素的组合物的受试者可以是人类，灵长类或者其他哺乳动物，上述化合物的给药途径可以是口服、经鼻给药、肠道外给药、外用(滴剂或透皮贴剂)。术语“肠道外给药”所指的用药途径包括静脉内、肌内、胸骨内、皮下和关节内注射。
本发明中包含莱菔素的组合物可以是固体形式，如片剂、糖衣片、丸剂、胶囊剂、颗粒剂或者是微粒剂(包括粉末或小袋包装)，固体制剂可以将药学上的惰性成分与固体形式的莱菔素混合而得到。
本发明中的包含莱菔素的组合物的剂型可以是口服液体剂型，其中包括，但不限于，药学上可接受的乳剂、溶液、悬浮液糖浆和酏剂。液体剂型中除了莱菔素可能含有惰性稀释剂，例如，水、增溶剂和乳化剂。所述惰性稀释剂还可以包括佐剂，如润湿剂、乳化剂、助悬剂、甜味剂、矫味剂和芳香剂。
本发明中的包含莱菔素的组合物的剂型可以是注射剂型剂型，其中包括，但不限于，药学上可接受的乳剂、溶液。
本发明中的包含莱菔素的组合物的剂型可以是混悬剂。所述的悬浮剂可以是异硬脂醇、聚山梨糖醇、山梨糖醇酐酯、微晶纤维素、膨润土、琼脂，黄蓍胶，以及它们的混合物。
本发明中包含莱菔素的组合物，可以以来源于磷脂或其他脂类物质的脂质体的形式给药。脂质体是利用磷脂双分子层膜所形成的囊泡包裹药物分子而形成的制剂。脂质体可以用在营养物质和药物的载体。可以通过破坏生物膜的方法(例如超声处理)制备脂质体。
本发明中含有1-(烷基亚磺酰基)-2-异硫氰基烷基-1-烯烃的组合物还可以含有一种或多种本领域技术人员己知的药用载体、添加剂和赋形剂，所述药用载体例如美国专利5,650,386号所述的载体：8-[(2-羟基苯酰基)胺基]辛酸钠。所述载体可以依照美国专利5,650,386号所述的方法来使用。所述添加剂可为例如维生素A或维生素C。所述赋形剂包括但不限于无毒的固体或液体。
附图说明
下面通过附图并结合具体实施方式来进一步描述本发明，在附图中：
图1显示莱菔素和莱菔硫烷对A549人肺腺癌细胞的半数抑制浓度(IC50值)。
图2显示莱菔素和莱菔硫烷对H460人肺鳞癌细胞的半数抑制浓度(IC50值)。
图3显示莱菔素和莱菔硫烷对PANC-1人胰腺癌细胞的半数抑制浓度(IC50值)。
图4显示莱菔素和莱菔硫烷对MCF-7人乳腺癌细胞的半数抑制浓度(IC50值)。
图5显示莱菔素和莱菔硫烷对HepG2人肝癌细胞的半数抑制浓度(IC50值)。
图6显示莱菔素和莱菔硫烷对HeLa人宫颈癌细胞的半数抑制浓度(IC50值)。
图7显示莱菔素和莱菔硫烷对A375人恶性黑色素癌细胞的半数抑制浓度(IC50值)。
图8显示莱菔素H460人肺鳞癌细胞裸鼠移植瘤抑癌实验结果。
图9显示莱菔素和莱菔硫烷H460人肺鳞癌细胞裸鼠移植瘤抑癌实验结果。
具体实施方式
I.抑制人类体外癌细胞的生长的实验
莱菔素的制备：在室温环境下，在pH＝7的磷酸盐缓冲液中，预先磨碎的萝卜中子中的硫代葡萄糖苷被内源性的黑芥子酶水解。为了去除蛋白和其他杂质将pH值提高到2.0，经过过滤、萃取、烘干后即可得到天然粗提物。通过高速逆流色谱得到纯度大于98％的莱菔素。
一般操作步骤：人癌细胞培养在含10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640(HyClone)培养基中，在含有在含5％CO2的37℃培养箱培养24小时，细胞增殖后用0.25％胰蛋白酶及0.02％EDTA常规消化后传代。EDTA是传统消化的手段。胰蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，具有底物特异性，用于消化贴壁细胞。然而，细胞中存在的二价阳离子，如钙和镁可以抑制消化。EDTA可以螯合二价阳离子，从而提高胰蛋白酶的消化效果。常用的MTT法测定细胞增殖、存活细胞的百分比和细胞毒性。MTT(3-[4，5-二甲基吡啶-2-基]-2，5-二苯基四唑溴)[又名噻唑蓝]的黄色染料。检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。因此可以用于评估和确定的存活率或细胞的抑制率。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高。
通过以下具体实施例的详细描述，进一步阐明本发明的优点，然而，下述实施例并不构成对本发明中任何或者全部权利要求保护范围的限制。
实施例
实施例1：
一、材料和方法
1.实验细胞系和相关化学试剂：人肺腺癌细胞系A549购买自美国ATCC细胞库，培养在含10％胎牛血清的RPMI-1640(HyClone)培养基中，用0.25％胰蛋白酶及0.02％EDTA常规消化后传代。本实验相关化学试剂皆购自Sigma公司。
2.莱菔素和莱菔硫烷对A549细胞的体外抑制实验：取对数生长期的A549细胞消化成单个细胞后，接种于96孔板中，每孔3000个细胞，在含5％CO2的37℃培养箱培养。将莱菔素和莱菔硫烷用无菌去离子水溶解后，过0.22μm滤膜除菌，用含血清培养液稀释，使莱菔素和莱菔硫烷最终浓度分别为10μM、20μM、30μM、40μM和50μM，在A549细胞接种培养24小时后，换成含莱菔素和莱菔硫烷相应浓度的培养液培养细胞，阴性对照组培养基中加入等体积的无菌去离子水培养细胞。再分别培养48小时后，每孔加入20μL MTT，在 含5％CO2的37℃培养箱继续孵育3小时后，吸净每孔中的溶液，分别加入150μL DMSO，摇床振荡10min后，测定每孔490nm波长下的吸光度。以0小时的阴性对照组存活细胞数为基准，计算细胞生长的半数抑制浓度(IC50)，实验结果数据见图1。
二、实验结果图1显示，莱菔素对A549人肺腺癌细胞的生长增殖具有显著的抑制效果。处理48小时后，莱菔素对A549细胞生长的半数抑制浓度(IC50)为：10.5μM；莱菔硫烷对A549人肺腺癌细胞的生长增殖具有显著的抑制效果。处理48小时后，莱菔硫烷对A549细胞生长的半数抑制浓度(IC50)为：14.7μM。
实施例2：
一、材料和方法
1.实验细胞系和相关化学试剂：人肺鳞癌细胞系H460购买自美国ATCC细胞库，培养在含10％胎牛血清的RPMI-1640(HyClone)培养基中，用0.25％胰蛋白酶及0.02％EDTA常规消化后传代。本实验相关化学试剂皆购自Sigma公司。
2.莱菔素和莱菔硫烷对H460细胞的体外抑制实验：取对数生长期的H460细胞消化成单个细胞后，接种于96孔板中，每孔3000个细胞，在含5％CO2的37℃培养箱培养。将莱菔素和莱菔硫烷用无菌去离子水溶解后，过0.22μm滤膜除菌，用含血清培养液稀释，使莱菔素和莱菔硫烷最终浓度分别为10μM、20μM、30μM、40μM和50μM，在H460细胞接种培养24小时后，换成含莱菔素和莱菔硫烷相应浓度的培养液培养细胞，阴性对照组培养基中加入等体积的无菌去离子水培养细胞。再分别培养48小时后，每孔加入20μL MTT，在含5％CO2的37℃培养箱继续孵育3h后，吸净每孔中的溶液，分别加入150μL DMSO，摇床振荡10min后，测定每孔490nm波长下的吸光度。以0小时的阴性对照组存活细胞数为基准，计算细胞生长的半数抑制浓度(IC50)，实验结果数据见图2。
二、实验结果图2显示，莱菔素对H460人肺鳞癌细胞的生长增殖具有显著的抑制效果。处理48小时后，莱菔素对H460细胞生长的半数抑制浓度(IC50)为：25.7μM；莱菔硫烷对H460人肺鳞癌细胞的生长增殖具有显著的抑制效果。处理48小时后，莱菔硫烷对H460细胞生长的半数抑制浓度(IC50)为：34.62μM。
实施例3：
一、材料和方法
1.实验细胞系和相关化学试剂：人胰腺癌细胞系PANC-1购买自美国ATCC细胞库，培养在含10％胎牛血清的RPMI-1640(HyClone)培养基中，用0.25％胰蛋白酶及0.02％EDTA常规消化后传代。本实验相关化学试剂皆购自Sigma公司。
2.莱菔素和莱菔硫烷对PANC-1细胞的体外抑制实验：取对数生长期的PANC-1细胞消化成单个细胞后，接种于96孔板中，每孔3000个细胞，在含5％CO2的37℃培养箱培养。将莱菔素和莱菔硫烷用无菌去离子水溶解后，过0.22μm滤膜除菌，用含血清培养液稀释，使莱菔素和莱菔硫烷最终浓度分别为10μM、20μM、30μM、40μM和50μM，在PANC-1细胞接种培养24小时后，换成含莱菔素和莱菔硫烷相应浓度的培养液培养细胞，阴性对照组培养基中加入等体积的无菌去离子水培养细胞。再分别培养48小时后，每孔加入20μLMTT，在含5％CO2的37℃培养箱继续孵育3h后，吸净每孔中的溶液，分别加入150μLDMSO，摇床振荡10min后，测定每孔490nm波长下的吸光度。以0小时的阴性对照组存活细胞数为基准，计算细胞生长的半数抑制浓度(IC50)，实验结果数据见图3。
二、实验结果图3显示，莱菔素对PANC-1人胰腺癌细胞的生长增殖具有显著的抑制 效果。处理48小时后，莱菔素对PANC-1细胞生长的半数抑制浓度(IC50)为：5.18μM；莱菔硫烷对PANC-1人胰腺癌细胞的生长增殖具有显著的抑制效果。处理48小时后，莱菔硫烷对PANC-1细胞生长的半数抑制浓度(IC50)为：6.73μM。
实施例4：
一、材料和方法
1.实验细胞系和相关化学试剂：人乳腺癌细胞系MCF-7购买自美国ATCC细胞库，培养在含10％胎牛血清的RPMI-1640(HyClone)培养基中，用0.25％胰蛋白酶及0.02％EDTA常规消化后传代。本实验相关化学试剂皆购自Sigma公司。
2.莱菔素和莱菔硫烷对MCF-7细胞的体外抑制实验：取对数生长期的MCF-7细胞消化成单个细胞后，接种于96孔板中，每孔3000个细胞，在含5％CO2的37℃培养箱培养。将莱菔素和莱菔硫烷用无菌去离子水溶解后，过0.22μm滤膜除菌，用含血清培养液稀释，使莱菔素和莱菔硫烷最终浓度分别为10μM、20μM、30μM、40μM和50μM，在MCF-7细胞接种培养24小时后，换成含莱菔素和莱菔硫烷相应浓度的培养液培养细胞，阴性对照组培养基中加入等体积的无菌去离子水培养细胞。再分别培养48小时后，每孔加入20μL MTT，在含5％CO2的37℃培养箱继续孵育3h后，吸净每孔中的溶液，分别加入150μL DMSO，摇床振荡10min后，测定每孔490nm波长下的吸光度。以0小时的阴性对照组存活细胞数为基准，计算细胞生长的半数抑制浓度(IC50)，实验结果数据见图4。
二、实验结果图4显示，莱菔素对MCF-7人乳腺癌细胞的生长增殖具有显著的抑制效果。处理48h后，莱菔素对MCF-7细胞生长的半数抑制浓度(IC50)为：14.3μM；莱菔硫烷对MCF-7人乳腺癌细胞的生长增殖具有显著的抑制效果。处理48h后，莱菔硫烷对MCF-7细胞生长的半数抑制浓度(IC50)为：19.46μM。
实施例5：
一、材料和方法
1.实验细胞系和相关化学试剂：人肝癌细胞系HepG2购买自美国ATCC细胞库，培养在含10％胎牛血清的RPMI-1640(HyClone)培养基中，用0.25％胰蛋白酶及0.02％EDTA常规消化后传代。本实验相关化学试剂皆购自Sigma公司。
2.莱菔素和莱菔硫烷对HepG2细胞的体外抑制实验：取对数生长期的HepG2细胞消化成单个细胞后，接种于96孔板中，每孔3000个细胞，在含5％CO2的37℃培养箱培养。将莱菔素和莱菔硫烷用无菌去离子水溶解后，过0.22μm滤膜除菌，用含血清培养液稀释，使莱菔素和莱菔硫烷最终浓度分别为10μM、20μM、30μM、40μM和50μM，在HepG2细胞接种培养24小时后，换成含莱菔素和莱菔硫烷相应浓度的培养液培养细胞，阴性对照组培养基中加入等体积的无菌去离子水培养细胞。再分别培养48小时后，每孔加入20μLMTT，在含5％CO2的37℃培养箱继续孵育3h后，吸净每孔中的溶液，分别加入150μL DMSO，摇床振荡10min后，测定每孔490nm波长下的吸光度。以0小时的阴性对照组存活细胞数为基准，计算细胞生长的半数抑制浓度(IC50)，实验结果数据见图5。
二、实验结果图5显示，莱菔素对HepG2人肝癌细胞的生长增殖具有显著的抑制效果。处理48小时后，莱菔素对HepG2细胞生长的半数抑制浓度(IC50)为：59.0μM；莱菔硫烷对HepG2人肝癌细胞的生长增殖具有显著的抑制效果。处理48小时后，莱菔硫烷对HepG2细胞生长的半数抑制浓度(IC50)为：47.33μM。
实施例6：
一、材料和方法
1.实验细胞系和相关化学试剂：人宫颈癌细胞系HeLa购买自美国ATCC细胞库，培养在含10％胎牛血清的RPMI-1640(HyClone)培养基中，用0.25％胰蛋白酶及0.02％EDTA常规消化后传代。本实验相关化学试剂皆购自Sigma公司。
2.莱菔素和莱菔硫烷对HeLa细胞的体外抑制实验：取对数生长期的HeLa细胞消化成单个细胞后，接种于96孔板中，每孔3000个细胞，在含5％CO2的37℃培养箱培养。将莱菔素和莱菔硫烷用无菌去离子水溶解后，过0.22μm滤膜除菌，用含血清培养液稀释，使莱菔素和莱菔硫烷最终浓度分别为10μM、20μM、30μM、40μM和50μM，在HeLa细胞接种培养24小时后，换成含莱菔素和莱菔硫烷相应浓度的培养液培养细胞，阴性对照组培养基中加入等体积的无菌去离子水培养细胞。再分别培养48小时后，每孔加入20μL MTT，在含5％CO2的37℃培养箱继续孵育3h后，吸净每孔中的溶液，分别加入150μL DMSO，摇床振荡10min后，测定每孔490nm波长下的吸光度。以0小时的阴性对照组存活细胞数为基准，计算细胞生长的半数抑制浓度(IC50)，实验结果数据见图6。
二、实验结果图6显示，莱菔素对HeLa人宫颈癌细胞的生长增殖具有显著的抑制效果。处理48h后，莱菔素对HeLa细胞生长的半数抑制浓度(IC50)为：24.1μM；莱菔硫烷对HeLa人宫颈癌细胞的生长增殖具有显著的抑制效果。处理48h后，莱菔硫烷对HeLa细胞生长的半数抑制浓度(IC50)为：25.8μM。
实施例7：
一、材料和方法
1.实验细胞系和相关化学试剂：人恶性黑色素癌细胞系A375购买自美国ATCC细胞库，培养在含10％胎牛血清的RPM1-1640(HyClone)培养基中，用0.25％胰蛋白酶及0.02％EDTA常规消化后传代。本实验相关化学试剂皆购自Sigma公司。
2.莱菔素和莱菔硫烷对A375细胞的体外抑制实验：取对数生长期的A375细胞消化成单个细胞后，接种于96孔板中，每孔3000个细胞，在含5％CO2的37℃培养箱培养。将莱菔素和莱菔硫烷用无菌去离子水溶解后，过0.22μm滤膜除菌，用含血清培养液稀释，使莱菔素和莱菔硫烷最终浓度分别为10μM、20μM、30μM、40μM和50μM，在A375细胞接种培养24小时后，换成含莱菔素和莱菔硫烷相应浓度的培养液培养细胞，阴性对照组培养基中加入等体积的无菌去离子水培养细胞。再分别培养48小时后，每孔加入20μL MTT，在含5％CO2的37℃培养箱继续孵育3h后，吸净每孔中的溶液，分别加入150μL DMSO，摇床振荡10min后，测定每孔490nm波长下的吸光度。以0小时的阴性对照组存活细胞数为基准，实验结果数据见图7。
二、实验结果图7显示，莱菔素对A375人恶性黑色素癌细胞的生长增殖具有显著的抑制效果。处理48小时后，莱菔素对A375细胞生长的半数抑制浓度(IC50)为；7.8μM；莱菔硫烷对A375人恶性黑色素癌细胞的生长增殖具有显著的抑制效果。处理48小时后，莱菔硫烷对A375细胞生长的半数抑制浓度(IC50)为：9.11μM。
实施例8：
一、材料和方法
厄洛替尼、吉西他滨、紫杉醇或5-FU四种药物是肺癌和乳腺癌化疗的有效治疗药物。其中，作为一种靶向治疗药物，厄洛替尼可试用于两个或两个以上化疗方案失败的局部晚期或 转移的非小细胞肺癌的三线治疗。吉西他滨目前作为晚期非小细胞肺癌和转移性乳腺癌的一线治疗药物在临床使用。紫杉醇主要适用于乳腺癌，对肺癌也有一定疗效。5-FU对乳腺癌和消化系统癌(食管癌、胃癌、肠癌、胰腺癌、肝癌)疗效较好。因此，本实施例选用上述四种药物为对照化疗药物，研究莱菔素与其抑癌效果的差异。1.实验细胞系和相关化学试剂：人肺腺癌细胞系A549、人肺鳞癌细胞系H460和人乳腺癌细胞系MCF-7的来源及培养条件如前所述。本实验相关化学试剂皆购自Sigma公司。2.莱菔素与其他化疗药物比较对A549、H460和MCF-7细胞的体外抑制实验：取对数生长期的A549、H460和MCF-7细胞消化成单个细胞后，接种于96孔板中，每孔3000个细胞，在含5％CO2的37℃培养箱培养。以10μM莱菔素和10μM其他化疗药物(厄洛替尼、吉西他滨、紫杉醇或5-FU)处理细胞，阴性对照组培养基中加入等体积的无菌去离子水培养细胞。MTT法测定上述药物的抑癌效果。以0小时的阴性对照组存活细胞数为基准，计算抑癌效果。上述药物对肿瘤细胞的抑制率详见表I。
二、实验结果如表1所示，较之厄洛替尼、吉西他滨和紫杉醇，莱菔素对A549和H460细胞生长增殖具有更为显著的抑制效果。在MCF-7中，莱菔素的抑癌效果虽不及相同浓度的紫杉醇，却显著高于吉西他滨和5-FU。
从以上的结果可以看出，对于大多数癌细胞，莱菔素具有与莱菔硫烷和其它几种一线化疗或者靶向药物，包括但不限于厄洛替尼、吉西他滨和紫杉醇相当或者更优的抑制作用，因而，莱菔素对于以下癌症的生长具有显著的效果，这里提到的癌症包括，并不限于人肺腺癌、人肺鳞癌、人胰腺癌，人肝癌、人乳腺癌、人宫颈癌和人恶性黑色素瘤。
II.抑制动物体内癌细胞的生长的实验
实施例9：
1肿瘤细胞腋下接种：
1.1动物的准备：采用30只裸鼠，雌雄各半，在实验室中正常喂养3到5天。
1.2、H460细胞的准备：取正常培养好的H460肿瘤细胞，利用PBS稀释配制成细胞浓度为7.5×10６个/毫升的肿瘤细胞悬液。
1.3、肿瘤细胞的接种：利用1毫升的无菌注射器，吸取己经充分摇匀的肿瘤细胞悬液0.2毫升，通过皮下注射，将肿瘤细胞接种至裸鼠的腋下。正常喂养约2-3天，待肿瘤组织长至长径约3毫米，短径约2毫米时，将全部均长有肿瘤组织的裸鼠随机分成3组并投入后期给药实验中。
2实验组设计：灌胃药的水溶液的浓度为35.37×10-3mol·L-1
2.1、对照组：长好肿瘤组织的雌雄裸鼠各五只，每周灌胃超纯水三次(周一、周三和周五下午)，每次灌胃体积为0.3毫升。
2.2、实验组1：长好肿瘤组织的雌雄裸鼠各五只，每周灌胃75mg/kg的莱菔素药液三次(周一、周三和周五下午)，每次灌胃体积为0.3毫升。
2.3、实验组2：长好肿瘤组织的雌雄裸鼠各五只，每周灌胃75mg/kg的莱菔硫烷药液三次(周一、周三和周五下午)，每次灌胃体积为0.3毫升。
3、实验数据采集方法：
3.1、裸鼠体重数据的采集：每周采集裸鼠体重数据三次，分别在周一、周三和周五下午进行。利用电子天平，体重数据记录到0.01克。
3.2、裸鼠肿瘤组织大小数据的采集：每周采集裸鼠肿瘤组织大小数据三次，分别在周一、周三和周五下午进行。利用电子游标卡尺，肿瘤组织长径和短径数据记录到0.01毫米。
3.3、其他数据与现象的观察：密切观察裸鼠的存活情况，如有死亡发生，应及时记录死亡的时间、裸鼠编号及对应的组别。如观察到裸鼠有异常情况发生，应及时记录情况发生的时间和症状。
3.4、实验结束时间：当对照组中裸鼠肿瘤组织大小平均长至1000毫立方(体积＝长径×短径2×0.5236)时，应该在处理裸鼠之前，称量裸鼠体重及裸鼠肿瘤组织的大小并记录数据；停止实验并及时处理裸鼠。
3.5、实验结束时裸鼠的处理方式：将裸鼠逐个处死，将所有裸鼠按照不同组别排列后照相，同时挑选每组六只具有代表性的裸鼠进行照相；然后逐个剥离肿瘤组织称重，放置在对应的位置，照相)。动物实验结果如下：
每周灌胃三次(每次75mg/kg)用本发明的莱菔素药液，或者用对照组药液。从以上的结果，可以不难地看出本发明的优点：莱菔素对于体内癌细胞的生长具有显著抑制的效果(图8)，而且，其抑制作用要优于莱菔硫烷(图9)。
III.人外周血单个核细胞毒性实验
一般操作步骤：正常人外周血细胞经Ficoll分离，获得单个核细胞，经PBS清洗三次后，IMDM+10％FBS悬浮，加入10μM、30μM和50μM的莱菔素或莱菔硫烷及其他4种化疗药物处理，按每孔2.5万个细胞/100μL培养基接种96孔板，37℃培养过夜。
处理：由于外周血单个核细胞体外培养增殖有限，而且较快地进入衰亡期，因而，选择在24小时后以MTT方法检测细胞活性。分别选取具有不同作用机制的4种药物：顺铂、5-氟尿嘧啶(5-FU)、紫杉醇和阿霉素。以10μM的药物浓度处理白细胞。实验共分为11组，分别为：10μM、30μM和50μM的莱菔素处理组、10μM、30μM和50μM的莱菔硫烷处理组、顺铂处理组、紫杉醇处理组、阿霉素处理组、5-Fu处理组和阴性对照组，具体数据见表2。阴性对照：选择经无菌去离子水处理的外周血单个核细胞组作为阴性对照组。
实施例10：
一、材料和方法
1.实验细胞：正常人外周血细胞经Ficoll分离，获得单个核细胞，经PBS清洗三次后，IMDM+10％FBS悬浮培养。0.25％胰蛋白酶及0.02％EDTA常规消化后传代。
2.莱菔素及对照化疗药物对人外周血单个核细胞的体外抑制实验：取人外周血单个核细胞消化成单个细胞后，接种于96孔板中，每孔3000个细胞，在含5％CO2的37℃培养箱培养。将莱菔素用无菌去离子水溶解后，过0.22μm滤膜除菌，用含血清培养液稀释，使莱菔素最终浓度分别为10μM、30μM和50μM。莱菔硫烷的配制方法同上书莱菔素配置方法。对照化疗药物的配置浓度分布为：顺铂：50μM；5-FU：60μM；紫杉醇：20μM；阿霉素：5μM。在人外周血单个核细胞接种培养12小时后，换成含相应浓度的莱菔素或化疗药物培养液培养细胞，阴性对照组培养基中加入等体积的无菌去离子水培养细胞。再分别培养24小时后，每孔加入20μL MTT，在含5％CO2的37℃培养箱继续孵育3h后，吸净每孔中的溶液，分 别加入150μL DMSO，摇床振荡10min后，测定每孔490nm波长下的吸光度。实验结果数据见表2。
二、实验结果
表2显示，莱菔素对外周血单个核细胞毒性显著低于相同剂量莱菔硫烷及选择的其它化疗药物处理组。对照化疗药物对人外周血单个核细胞的生长增殖具有显著的抑制效果，莱菔硫烷对上述细胞增殖有一定的影响，然而，莱菔素对上述细胞增殖未见显著影响。
IV.大鼠心肌细胞毒性实验
一般操作步骤：选择1-2天的新生SD大鼠，雌雄不限，无菌条件下分离原代心肌细胞。细胞培养3天后，加入10μM、30μM和50μM的莱菔素或莱菔硫烷及10μM阿霉素处理24小时。利用ATP/总蛋白比值表征上述药物的心肌毒性。实验共分为8组，分别为：10μM、30μM和50μM的莱菔素处理组、10μM、30μM和50μM的莱菔硫烷处理组、阿霉素处理组和阴性对照组，具体数据见表2。阴性对照：选择经无菌去离子水处理的大鼠心肌细胞组作为阴性对照组。
实施例11：
一、材料和方法
1.实验细胞：选择1-2天的新生SD大鼠，雌雄不限，消毒后直接减去心室肌肉，用胰蛋白酶消化，制成心肌细胞悬液。在37℃、5％CO2培养箱中，利用差速贴壁法培养原代心肌细胞。利用台盼蓝染色法鉴定心肌细胞活性平均为98.2％；并进而利用免疫荧光法鉴定心肌细胞纯度为98.7％。
2.莱菔素及对照药物对大鼠原代心肌细胞的体外抑制实验：取大鼠原代心肌细胞消化成单个细胞后，接种于24孔板中，在含5％CO2的37℃培养箱培养。莱菔素、莱菔硫烷和阿霉素的配制方法同上。在大鼠原代心肌细胞接种培养12小时后，换成含相应浓度的莱菔素、莱菔硫烷或阿霉素培养液培养细胞，阴性对照组培养基中加入等体积的无菌去离子水培养细胞。再分别培养6小时后，将所有试验孔中换成无药物正常细胞培养基。在含5％CO2的37℃培养箱继续孵育42小时后，吸净每孔中的溶液，磷酸盐缓冲液冲洗3次后，胰酶消化收集细胞，并分为两份。其中一份细胞利用报告基因试验测定ATP水平。另一份细胞利用BCA法测定细胞蛋白质总浓度。计算ATP(ng)和蛋白质浓度(μg)的比值，各个实验组与阴性对照组相除得到相对ATP/总蛋白比值。实验结果数据见表3。
二、实验结果
表3显示，莱菔素的心肌细胞毒性显著低于相同剂量莱菔硫烷处理组，对照阿霉素对心肌细胞具有明显毒性。
结论：本发明的系统研究表明，莱菔素对于大多数癌细胞具有与莱菔硫烷和其它几种一线化疗或者靶向药物，包括，但不限于厄洛替尼、吉西他滨和紫杉醇相当或者更优的抑制作用，同时，意料之外的是，本品的安全性不但显著优于顺铂、5-氟尿嘧啶(5-FU)、紫杉醇和阿霉素，而且显著优于莱菔硫烷，是本发明中提及唯一对正常组织无显著毒性的化合物，因而其在多种癌症上有应用价值，所述多种癌症包括，但不限于人肺腺癌、人肺鳞癌、人胰腺癌，人肝癌、人乳腺癌、人宫颈癌和人恶性黑色素瘤。
Claims (8)
1.1-(烷基亚磺酰基)-2-异硫氰基烷基-1-烯烃(结构式I)在制备用于治疗或预防人类或哺乳动物癌症与肿瘤的药物组合物、保健品或食品添加剂上的应用：
其中R1、R2和R3独立地指取代的或未取代的烷基、烯烃、炔基、芳基、烷氧基、环氧基，环氮基和芳氧基；R4指取代的或未取代的亚烷基，-CH2-O-CH2-和烷氧芳基；n的数值在1-10之间。
2.权利要求1所述的应用，其中R1是甲基。
3.权利要求1所述的应用，R2和R3都为氢原子。
4.权利要求1所述的应用，R4是亚甲基，且n＝2。
5.权利要求1所述的应用，其中结构式I的化合物是4-异硫氰基-1-(甲基亚磺酰基)-1-丁烯(莱菔素)。
6.权利要求5所述的应用，其中所述莱菔素是从萝卜种子，萝卜苗或萝卜中提取。
7.权利要求1或5任一项所述的应用，其中所述药物组合物、保健品或食品添加剂中含有药用载体、添加剂和药用赋形剂。
8.权利要求1或5任一项所述的应用，其中所述人类或哺乳动物的癌症与肿瘤选自：肺癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、甲状腺癌、胰腺癌、食管癌、肺癌、头颈肿瘤、宫颈癌、子宫内膜癌、恶性黑色素肿瘤和膀胱癌。
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