CN104497095A - 表雄酮和去氢表雄酮衍生物及其制备方法、及其在制备抗乳腺癌药物中的应用 - Google Patents

表雄酮和去氢表雄酮衍生物及其制备方法、及其在制备抗乳腺癌药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种式(I)所示表雄酮和去氢表雄酮衍生物及其制备方法，将表雄酮、去氢表雄酮依次通过羟基保护、C-16位酰基化、关环反应、C-3位羟基修饰合成了一系列C-16、C-17位稠合吡唑环、异恶唑环、氨基嘧啶环、噻二唑环衍生物。本发明还提供了该类表雄酮和去氢表雄酮衍生物在制备抗乳腺癌药物中的应用。

Description

表雄酮和去氢表雄酮衍生物及其制备方法、及其在制备抗乳腺癌药物中的应用
技术领域
本发明属于医药及其制备和应用的技术领域，具体涉及一种表雄酮和去氢表雄酮衍生物及其制备方法和在制备抗乳腺癌药物中的应用。
背景技术
去氢表雄酮(Dehydroepiandrosterone,DHEA)是人体外周循环中的最常见的内源性甾体激素,其主要由肾上腺皮质分泌，是生物合成雄激素和雌激素的重要前体物质。表雄酮是去氢表雄酮在人体代谢过程中的重要中间产物之一。作为合成各种甾体激素类药物的重要中间体，去氢表雄酮和表雄酮及其衍生物的抗肿瘤活性在近些年来受到了越来越多的关注。有研究表明，体内DHEA具有广泛的生物学活性，可增强机体免疫功能，预防肥胖症、肿瘤和糖尿病等疾病的发生。去氢表雄酮可以通过诱导肿瘤细胞凋亡与分化，并能与许多化疗药物协同发挥抗癌功效，同时对于促癌剂诱发的癌变也表现出一定的抑制功能。目前，从DHEA的衍生物中鉴定出来的Abiraterone已成为治疗去势抵抗性前列腺癌的重要药物。随着去氢表雄酮及其衍生物的各种生物学功能及作用机制被进一步阐明，加之去氢表雄酮成本低廉，来源丰富，所以以表雄酮和去氢表雄酮作为先导化合物，开发新的抗肿瘤药物越来越受到重视。
发明内容
本发明提出一种表雄酮和去氢表雄酮衍生物，其结构如式(I)所示：
其中，所述H为五元杂环或六元杂环；
所述R为-H、-COOC2H5、-CF3、-CH2OH、-COOH、-Ac、-SO2Me、
本发明提出的一种去氢表雄酮衍生物，如式(1)所示，其中，R＝-H、-COOC2H5、-CF3、-CH2OH、-COOH。
本发明提供的一种去氢表雄酮衍生物，如式(2)所示，其中，R＝-H、-COOC2H5、-COOH。
本发明提供的一种去氢表雄酮衍生物，如式(3)所示。
本发明提供的一种去氢表雄酮衍生物，如式(4)所示，其中，R＝-H、-Ac。
本发明提供的一种去氢表雄酮衍生物，如式CH16、CH17、CH18、CH19所示：
本发明提供的一种表雄酮衍生物，如式(5)所示，其中，R＝-H、-Ac、-SO2Me、
本发明式(1)表雄酮和去氢表雄酮衍生物包括式(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(CH16)、(CH17)、(CH18)、(CH19)等结构。
本发明还提供了式(I)去氢表雄酮衍生物、表雄酮衍生物的制备方法。
本发明提出的一种式(1)、式(2)、式(3)所示去氢表雄酮衍生物的制备方法，以去氢表雄酮为原料，经羟基保护、酰基化反应、关环反应、羟基脱保护，酯基的还原、酯基的水解反应后，得到式(CH05)、式(CH06)、式(CH07)、式(CH08)、式(CH09)、式(CH10)、式(CH13)、式(CH14)、式(CH15)所示的去氢表雄酮衍生物。所述制备方法中，所述羟基保护反应所用的保护基为叔丁基二甲基硅基，所用碱为咪唑、2,6‐二甲基吡啶，所用溶剂为N,N‐二甲基甲酰胺；所述酰基化反应所用的试剂包括甲酸乙酯、碳酸二乙酯、草酸二乙酯、三氟乙酸乙酯，反应温度在‐10℃～150℃之间；所述关环反应所用试剂包括盐酸肼、盐酸羟胺、盐酸胍；所述脱TBS保护所用的试剂包括盐酸乙醚溶液、盐酸乙酸乙酯溶液，所用的溶剂包括二氯甲烷、乙酸乙酯，反应温度为‐10℃～100℃。所述制备方法的反应路线如以下：
以上可见，将DHEA的C-3位羟基TBS保护得到化合物1，将化合物1分别与甲酸乙酯、草酸二乙酯、三氟乙酸乙酯进行甲酰化、草酰化、三氟乙酰化得到相应化合物2、化合物3、化合物4。化合物2、化合物3、化合物4分别和盐酸肼关环反应得到如式(1)所示去氢表雄酮衍生物CH05、CH07、CH13。化合物CH07再分别进行乙酯的还原和水解得到如式(1)所示去氢表雄酮衍生物CH09、CH14。化合物2、化合物3分别和盐酸羟胺关环反应得到如式(2)所示去氢表雄酮衍生物CH06、CH08。化合物CH08再进行乙酯的水解得到如式(2)所示去氢表雄酮衍生物CH15。化合物2和盐酸胍关环反应得到如式(3)所示去氢表雄酮衍生物5。化合物5再脱除C-3位羟基保护，得到如式(3)所示去氢表雄酮衍生物CH10。
本发明还提出了式(4)所示去氢表雄酮衍生物的制备方法，以去氢表雄酮为原料，经羟基保护、缩合反应、关环反应、羟基脱保护反应后，得到式(CH11)、式(CH12)所示的去氢表雄酮衍生物。所述制备方法中，所述羟基保护反应所用的试剂为乙酸酐，所用催化剂为4-N,N-二甲基吡啶；所述脱酯基保护所用的碱为碳酸钾、氢氧化钠。所述制备方法的反应路线如以下：
以上可见，将DHEA的C-3位羟基乙酯保护得到化合物6，化合物6和盐酸氨基脲取代得到化合物7，化合物7在氯化亚砜的作用下发生关环反应得到式(4)去氢表雄酮衍生物CH11，CH11再经过C-3位乙酯的脱保护得到式(4)去氢表雄酮衍生物CH12。
本发明还提出了式(CH16)、式(CH17)、式(CH18)、式(CH19)所示去氢表雄酮衍生物的制备方法，以去氢表雄酮衍生物式(CH12)为原料，分别经IBX氧化、异丙醇铝氧化反应、硼氢化钠还原反应、羟基卤代反应后，得到去氢表雄酮衍生物式(CH16)、式(CH17)、式(CH18)、式(CH19)。所述制备方法中，所述氧化反应所用的试剂为IBX、异丙醇铝；所述还原反应所用的试剂为硼氢化钠。所述制备方法的反应路线如以下：
以上可见，以去氢表雄酮衍生物式(CH12)为原料，分别经IBX氧化、异丙醇铝氧化得到去氢表雄酮衍生物式(CH16)、式(CH17)。化合物CH17经硼氢化钠还原得到去氢表雄酮衍生物CH18。去氢表雄酮衍生物CH12为原料在氯化亚砜作用下发生取代反应得到去氢表雄酮衍生物CH19。
本发明还提出了式(5)所示表雄酮衍生物的制备方法，以表雄酮为原料，经羟基保护、缩合反应、关环反应、羟基脱保护反应后，得到表雄酮衍生物CH20、CH21；所述制备方法的反应路线如以下：
以上可见，将表雄酮的C-3位羟基乙酯保护得到化合物8，化合物8和盐酸氨基脲缩合得到化合物9，化合物9在氯化亚砜的作用下发生关环反应得到式(5)去氢表雄酮衍生物式(CH20)，CH20再经过C-3位乙酯的脱保护得到到式(5)去氢表雄酮衍生物式(CH21)。
本发明还提出了一种表雄酮衍生物的制备方法，以式(CH21)所示的表雄酮衍生物为原料，分别与丙酰氯、甲基磺酰氯、丁二酸酐在DMAP催化下发生缩合反应，得到表雄酮衍生物式(CH22)、式(CH23)、式(CH24)。所述制备方法中，所述酰化反应所用的试剂为酸酐、酰氯；所用催化剂为4-二甲氨基吡啶；所用溶剂为二氯甲烷。所述制备方法的反应路线如以下：
以上可见，以表雄酮衍生物式(CH21)为原料，分别与丙酰氯、甲基磺酰氯、丁二酸酐在DMAP催化下发生缩合反应，得到表雄酮衍生物式(CH22)、式(CH23)、式(CH24)。
本发明还提出了一种表雄酮衍生物的制备方法，以表雄酮衍生物式(CH21)为原料，分别与N-Boc-甘氨酸、N-Boc-4-氨基丁酸、N-Boc-L-脯氨酸、N-Boc-D-脯氨酸、N-Boc-4-哌啶甲酸、N-Boc-3-哌啶甲酸在DMAP和EDCI作用下发生缩合反应，得到表雄酮衍生物式(CH25)、式(CH26)、式(CH27)、式(CH28)、式(CH29)、式(CH33)。所述制备方法中，所述酰化反应所用的试剂为有机酸；所用缩合剂为1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDCI)；所用催化剂为4-N,N-二甲基吡啶(DMAP)、1-羟基苯并三氮唑(HOBt)。所述制备方法的反应路线如以下：
以上可见，以表雄酮衍生物式(CH21)为原料，分别与N-Boc-甘氨酸、N-Boc-4-氨基丁酸、N-Boc-L-脯氨酸、N-Boc-D-脯氨酸、N-Boc-4-哌啶甲酸、N-Boc-3-哌啶甲酸在DMAP和EDCI作用下发生缩合反应，得到表雄酮衍生物式(CH25)、式(CH26)、式(CH27)、式(CH28)、式(CH29)、式(CH33)。
本发明还提出了一种表雄酮衍生物的制备方法，以表雄酮衍生物CH21为原料，分别与烟酰氯、异烟酰氯、吡嗪酰氯在DMAP催化下进行缩合反应，得到表雄酮衍生物式(CH30)、式(CH31)、式(CH32)。所述制备方法的反应路线如以下：
以上可见，以表雄酮衍生物式(CH21)为原料，分别与烟酰氯、异烟酰氯、吡嗪酰氯在DMAP催化下进行缩合反应，得到表雄酮衍生物式(CH30)、式(CH31)、式(CH32)。
本发明制备方法中，以上反应通常用薄板层析法来跟踪测定反应的完成程度，反应完毕后采用的后处理方法包括浓缩、萃取、柱层析分离等，最终产物通过核磁共振谱来验证。
本发明还提供了本发明去氢表雄酮衍生物、表雄酮衍生物在制备抗乳腺癌药物中的应用。本发明去氢表雄酮衍生物、表雄酮衍生物在抑制乳腺癌细胞增殖方面具显著效果，同时对乳腺癌细胞具有较好的选择性。
本发明抗乳腺癌的去氢表雄酮衍生物、表雄酮衍生物及其制备方法的优点包括，通过在天然物质去氢表雄酮的C-16、C-17位引入吡唑环、异恶唑环、氨基嘧啶环、噻二唑环以及在表雄酮D环稠合噻二唑环衍生物的C-3位进行结构修饰，合成了一系列新结构的去氢表雄酮衍生物、表雄酮衍生物。本发明制备方法的反应条件温和、所用试剂价格便宜、环境友好、合成路线短，合成方法简便。
本发明制备方法中，将去氢表雄酮的C-16、C-17位引入吡唑环、异恶唑环、氨基嘧啶环、噻二唑环以及在表雄酮D环稠合噻二唑环衍生物的C-3位进行结构修饰从而得到本发明去氢表雄酮衍生物、表雄酮衍生物。通过结构改造，明显增强了该类化合物的抗肿瘤活性，如图1、表1所示，其中CH33、CH27等几个化合物在相较于人成纤维细胞和其他多株肿瘤细胞系，对人源乳腺癌细胞系(T47D)表现出极好的选择性抑制，如表1、表2所示。实验表明，本发明去氢表雄酮衍生物或表雄酮衍生物比去氢表雄酮或表雄酮具有对肿瘤细胞系更好的增殖抑制和凋亡诱导活性，如图2、图3所示，并且还表现出了对人源乳腺癌细胞系T47D的极好的选择性。本发明衍生物可作为潜在肿瘤治疗药物，特别是某一特定类型乳腺癌的治疗药物，具有良好应用前景。
附图说明
图1表示本发明表雄酮和去氢表雄酮化合物在1μM浓度时对人源乳腺癌细胞系T47D的体外细胞毒活性即增殖抑制活性；其中化合物CH25、CH27、CH28、CH29、CH33相较于母体化合物(表雄酮EPI，去氢表雄酮DHEA)对其的抑制活性有明显提高。
图2、图3分别表示本发明化合物CH27和CH33对乳腺癌细胞系T47D凋亡诱导的测试结果；其中化合物CH27、CH33在24小时时可以浓度依赖性地诱导T47D细胞的明显凋亡。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。下述实施例中，化合物结构由核磁共振仪测定；试剂主要由上海国药化学试剂公司提供；产品纯化主要通过柱色谱，硅胶(200-300)由青岛海洋化工厂生产。
实施例1：式(1)所示去氢表雄酮衍生物的制备
化合物1：去氢表雄酮(10g，34.43mmol)溶解在无水DMF(100mL)中，冰水浴下依次加入TBSCl(15.6g，103.3mmol),Imidazole(14.05g，206mmol)，室温反应4小时。反应完全后，反应液倒入冰水(200mL)中，乙酸乙酯萃取(50mL×3)，合并有机相，饱和食盐水(50mL×3)洗涤，无水Na2SO4干燥，浓缩，硅胶柱层析(PE：EA＝5：1)纯化，得白色固体1(13.68g，92％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.29(d,J＝5.2Hz,1H),3.49–3.36(m,1H),2.40(dd,J＝19.2,8.6Hz,1H),2.27–2.17(m,1H),2.13(ddd,J＝13.4,5.1,2.2Hz,1H),2.08–1.96(m,2H),1.92–1.84(m,1H),1.83–1.73(m,2H),1.71–1.55(m,5H),1.54–1.36(m,3H),1.22(ddd,J＝10.9,7.7,3.7Hz,2H),0.97(s,3H),0.83(d,J＝3.0Hz,12H),0.00(s,6H).
化合物2：化合物1(3g，7.41mmol)溶解在无水HTF(30mL)中，冰水浴下依次加入HCOOEt(10ml，74.12mmol)，NaH(1.78g，74.12mmol),室温反应2小时。TLC检测反应完全后，缓慢滴加冰水淬灭反应，减压除去溶剂，加入水(40ml)，乙酸乙酯萃取(50mL×3)，合并有机相，饱和食盐水(50mL×3)洗涤，无水Na2SO4干燥，浓缩，得白色固体(3g)，未经纯化直接用于下一步反应。
化合物3:化合物1(2.5g，6.21mmol)溶解在无水HTF(30mL)中，冰水浴下加入NaH(1.49g，62.10mmol),室温反应1小时后加入(COOEt)2(10ml，74.12mmol)，继续反应5小时。TLC检测反应完全后，缓慢滴加冰水淬灭反应，，减压除去溶剂，加入水(40ml)，乙酸乙酯萃取(30mL×3)，合并有机相，饱和食盐水(30mL×3)洗涤，无水Na2SO4干燥，浓缩，得浅黄色油状物(2.78g)，未经纯化直接用于下一步反应。
化合物4:化合物1(700mg，1.74mmol)溶解在无水HTF(30mL)中，冰水浴下加入NaH(417mg，17.4mmol),室温反应1小时后加入CF3COOEt(2ml)，继续反应8小时。TLC检测反应完全后，缓慢滴加冰水淬灭反应，，减压除去溶剂，加入水(40ml)，乙酸乙酯萃取(30mL×3)，合并有机相，饱和食盐水(30mL×3)洗涤，无水Na2SO4干燥，浓缩，得浅黄色油状物(676mg)，未经纯化直接用于下一步反应。
CH05：化合物2(340mg，0.79mmol)、盐酸肼(414mg，3.95mmol)溶解在无水乙醇(30ml)中，氮气保护，回流反应4小时。TLC检测反应完全后，减压除去溶剂，加入水(30ml)，乙酸乙酯(10ml×3)萃取，合并有机相，无水Na2SO4干燥，浓缩，浓缩，硅胶柱层析(DCM：MeOH＝10：1)纯化，得白色固体化合物CH05(235mg，95％)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.40(s,1H),5.31(d,J＝4.9Hz,1H),3.32–3.21(m,1H),2.46(d,J＝6.1Hz,1H),2.25–1.96(m,5H),1.87–1.73(m,3H),1.72–1.59(m,4H),1.56(d,J＝9.3Hz,1H),1.37(td,J＝14.2,3.2Hz,1H),1.01(s,3H),0.93(s,3H).
CH07化合物3(2.3g，4.57mmol)、盐酸肼(2.4g，22.85mmol)溶解在无水乙醇(30ml)中，氮气保护，回流反应4小时。TLC检测反应完全后，减压除去溶剂，加入水(30ml)，乙酸乙酯(20ml×3)萃取，合并有机相，无水Na2SO4干燥，浓缩，硅胶柱层析(DCM：MeOH＝20：1)纯化，得白色固体化合物CH07(2.07g，95％)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ13.07(s,1H),5.31(d,J＝4.3Hz,1H),4.28–4.18(m,2H),2.68–2.55(m,1H),2.31(dd,J＝14.5,11.4Hz,1H),2.21–1.99(m,4H),1.90–1.81(m,1H),1.78(dd,J＝9.7,4.0Hz,2H),1.66(dd,J＝16.4,8.5Hz,3H),1.56(dd,J＝20.9,11.7Hz,2H),1.37(dd,J＝23.8,10.9Hz,1H),1.27(t,J＝7.1Hz,3H),1.01(s,3H),0.93(s,3H).
CH09化合物CH07(150mg，0.39mmol)溶于无水THF(20mL)中,在冰水浴和氮气保护下加入LiAlH4(148mg，3.9mmol)，室温反应5小时。TLC检测反应完全后，冰水浴下，分批加入NaSO4·10H2O至体系无气泡产生，且体系成白色，分层，抽滤出固体，浓缩滤液，硅胶柱层析(DCM：MeOH＝10：1)。得白色固体(107mg，72％)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.91(s,1H),5.30(d,J＝4.3Hz,1H),5.14(s,1H),4.72(d,J＝4.0Hz,1H),4.36(d,J＝5.6Hz,2H),3.25(td,J＝10.7,5.6Hz,1H),2.43(dd,J＝13.8,4.5Hz,1H),2.21–2.05(m,4H),2.05–1.96(m,2H),1.81–1.46(m,8H),1.44–1.29(m,2H),1.00(s,3H),0.89(s,3H).
CH13化合物4(250mg，0.5mmol)溶解在无水乙醇(25ml)中，加入盐酸肼(263mg，2.5mmol)氮气保护，加热回流9小时。TLC检测反应完全后，将反应液浓缩，加入水(20ml)，乙酸乙酯(10ml×3)萃取，合并有机相，无水Na2SO4干燥，浓缩，硅胶柱层析(DCM：MeOH＝30：1)纯化，得白色固体(170mg，89％)。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ13.28(s,1H),5.32–5.19(m,1H),4.62(d,J＝4.5Hz,1H),3.29–3.22(m,1H),2.31(dt,J＝19.0,8.9Hz,1H),2.21–1.99(m,4H),1.79–1.50(m,7H),1.32(ddt,J＝22.8,17.7,8.9Hz,3H),1.17(t,J＝7.1Hz,1H),1.01(d,J＝2.5Hz,3H),0.94(d,J＝17.9Hz,3H).
CH14化合物CH07(150mg，0.39mmol)溶于甲醇(20mL)中,加入NaOH(156mg,3.9mmol)回流反应2小时。TLC检测反应完全后，减压除去溶剂，加入水(30mL)，稀盐酸酸化至弱酸性，乙酸乙酯(10ml×3)萃取，合并有机相，无水Na2SO4干燥，浓缩,硅胶柱层析(DCM：MeOH＝10：1)纯化，得白色固体化合物CH14(123mg，88％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.34–5.28(m,1H),3.52(d,J＝1.7Hz,1H),2.34–2.20(m,2H),1.97–1.89(m,1H),1.77–1.71(m,1H),1.68(d,J＝4.1Hz,4H),1.52(d,J＝9.3Hz,4H),1.37(t,J＝7.1Hz,3H),1.25(t,J＝7.1Hz,2H),1.01(s,3H),0.98(s,3H).
实施例2：式(2)所示去氢表雄酮衍生物的制备
CH06化合物2(340mg，0.79mmol)、盐酸羟胺(277mg，3.95mmol)溶解在无水乙醇(30ml)中，氮气保护，回流反应4小时。TLC检测反应完全后，减压除去溶剂，加入水(30ml)，乙酸乙酯(10ml×3)萃取，合并有机相，无水Na2SO4干燥，浓缩，浓缩，硅胶柱层析(DCM：MeOH＝10：1)纯化，得白色固体化合物CH06(183mg，74％)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.57(s,1H),5.31(d,J＝4.9Hz,1H),3.32–3.21(m,1H),2.46(d,J＝6.1Hz,1H),2.25–1.96(m,5H),1.87–1.73(m,3H),1.72–1.59(m,4H),1.56(d,J＝9.3Hz,1H),1.37(td,J＝14.2,3.2Hz,1H),1.01(s,3H),0.93(s,3H).
CH08化合物3(2.3g，4.57mmol)、盐酸羟胺(2.4g，22.85mmol)溶解在无水乙醇(30ml)中，氮气保护，回流反应4小时。TLC检测反应完全后，减压除去溶剂，加入水(30ml)，乙酸乙酯(20ml×3)萃取，合并有机相，无水Na2SO4干燥，浓缩，硅胶柱层析(DCM：MeOH＝20：1)纯化，得白色固体化合物CH08(2.07g，95％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.34–5.28(m,1H),4.34(qd,J＝7.1,2.1Hz,2H),3.52(d,J＝1.7Hz,1H),2.34–2.20(m,2H),1.97–1.89(m,1H),1.88–1.77(m,3H),1.77–1.71(m,1H),1.68(d,J＝4.1Hz,4H),1.52(d,J＝9.3Hz,4H),1.37(t,J＝7.1Hz,3H),1.25(t,J＝7.1Hz,2H),1.01(s,3H),0.98(s,3H).
CH15化合物CH08(150mg，0.39mmol)溶于甲醇(20mL)中,加入NaOH(156mg,3.9mmol)回流反应2小时。TLC检测反应完全后，减压除去溶剂，加入水(30mL)，稀盐酸酸化至弱酸性，乙酸乙酯(10ml×3)萃取，合并有机相，无水Na2SO4干燥，浓缩，硅胶柱层析(DCM：MeOH＝30：1)纯化，得白色固体化合物CH15(105mg，75％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.34–5.28(m,1H),3.52(d,J＝1.7Hz,1H),2.34–2.20(m,2H),1.97–1.89(m,1H),1.77–1.71(m,1H),1.68(d,J＝4.1Hz,4H),1.52(d,J＝9.3Hz,4H),1.37(t,J＝7.1Hz,3H),1.25(t,J＝7.1Hz,2H),1.01(s,3H),0.98(s,3H)
实施例3：式(3)所示去氢表雄酮衍生物的制备
化合物5化合物2(350mg，0.8mmol)溶解在无水乙醇(30ml)中，加入吗啡啉(0.7nL，8.0mmol)，氮气保护，回流反应1小时。TLC检测反应完全后，将反应液冷却至室温，依次加入盐酸胍(382mg，4.0mmol)、甲醇钠(216mg，4.0mmol)继续回流反应10小时。TLC检测反应完全后，减压除去溶剂，加入水(30ml)，乙酸乙酯萃取(10ml×3)，合并有机相，饱和食盐水(20ml×2)洗涤，无水Na2SO4干燥，浓缩，硅胶柱层析(DCM：MeOH＝10：1)纯化，得白色固体化合物5(293mg，80％)。
CH10化合物5(293mg，0.64mmol)溶解在二氯甲烷(10ml)中，加入饱和HCl二氧六环(5mL)，室温反应2小时。TLC检测反应完全后，减压除去溶剂，加入水(30ml)，乙酸乙酯萃取(10ml×3)，合并有机相，饱和食盐水(20ml×2)洗涤，无水Na2SO4干燥，浓缩，硅胶柱层析(DCM：MeOH＝10：1)纯化，得白色固体化合物CH10(195mg，90％)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.15(s,2H),5.32(s,1H),3.58–3.49(m,1H),3.39(d,J＝7.2Hz,1H),3.31–3.22(m,1H),2.67(dd,J＝14.7,6.3Hz,1H),2.39(t,J＝13.5Hz,1H),2.15(dd,J＝23.2,9.8Hz,2H),2.01(d,J＝7.5Hz,1H),1.98(s,1H),1.37(dd,J＝23.5,10.9Hz,1H),1.01(s,3H),0.96(s,3H).
实施例4：式(4)所示去氢表雄酮衍生物的制备
CH11化合物7(435mg，1.12mmol)溶解在无水二氯甲烷(10ml)中，冰水浴下滴加二氯亚砜(2ml),10分钟滴完，室温反应5小时。反应完全后，将反应液浓缩，加入水(30ml)，乙酸乙酯(10ml×3)萃取，合并有机相，无水Na2SO4干燥，浓缩，硅胶柱层析(DCM：MeOH＝40：1)纯化，得白色固体(335mg，82％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.42(d,J＝5.1Hz,1H),4.68–4.56(m,1H),3.05(dd,J＝15.5,6.3Hz,1H),2.63(dd,J＝15.5,11.9Hz,1H),2.48(dd,J＝10.2,2.4Hz,1H),2.42–2.29(m,2H),2.28–2.19(m,1H),2.15–2.06(m,1H),2.04(s,3H),1.96–1.84(m,3H),1.83–1.68(m,4H),1.60(s,2H),1.13(s,3H),1.12(s,3H).
CH12化合物11(230mg，0.62mmol)溶解在无水甲醇(10ml)和水(2ml)的混合溶剂中，加入碳酸钾(428mg，3.1mmol)，室温反应4小时。TLC检测反应完全后，将反应液浓缩，硅胶柱层析(DCM：MeOH＝30：1)纯化，得白色固体(190mg，93％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.42–5.35(m,1H),3.61–3.49(m,1H),3.04(dd,J＝15.5,6.3Hz,1H),2.64(dd,J＝15.5,11.9Hz,1H),2.48(dd,J＝12.5,2.8Hz,1H),1.13(s,3H),1.10(s,3H).
实施例5：CH16、CH17、CH18、CH19所示去氢表雄酮衍生物的制备
CH16化合物12(200mg，0.60mmol)溶解在THF(10ml)和DMSO(10ml)的混合溶剂中，加入IBX(252mg，0.90mmol)，室温反应5小时。反应完全后，向反应液中加入H2O(30ml)搅拌，过滤析出的固体，滤液用乙酸乙酯(10ml×3)萃取，合并有机相，饱和食盐水(10ml×2)洗涤，无水Na2SO4干燥，浓缩，硅胶柱层析(DCM：MeOH＝20：1)纯化，得白色固体(90mg，45％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.43–5.37(m,1H),3.32(dd,J＝16.3,3.4Hz,1H),3.06(dd,J＝15.5,6.3Hz,1H),2.88(dd,J＝16.5,1.9Hz,1H),2.66(dd,J＝15.5,11.9Hz,1H),2.55–2.46(m,2H),2.35(d,J＝16.6Hz,1H),2.27(td,J＝11.7,6.3Hz,1H),2.19–2.15(m,1H),2.14–2.10(m,1H),2.04(s,1H),2.03–1.96(m,1H),1.84(d,J＝7.3Hz,3H),1.81–1.70(m,2H),1.53(td,J＝13.4,4.5Hz,2H),1.29(s,3H),1.17(s,3H).
CH17化合物12(200mg，0.60mmol)溶解在甲苯(30ml)中，加入环己酮(2mL)，回流分水2小时除去溶剂中的水，冷却至90℃,加入异丙醇铝(367mg，1.80mmol)继续回流反应2小时。反应完全后，反应液冷却至室温，依次用饱和氯化铵(20ml×2)洗涤，饱和食盐水(20ml×3)洗涤，无水Na2SO4干燥，浓缩，硅胶柱层析(PE：EA＝1：1)纯化，得白色固体(187mg，94％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.77(s,1H),3.07(dd,J＝15.5,6.3Hz,1H),2.67(dd,J＝15.4,11.9Hz,1H),2.54–2.32(m,5H),2.23(td,J＝11.6,6.3Hz,1H),2.04(s,2H),1.94(d,J＝15.6Hz,2H),1.76(t,J＝20.9Hz,7H),1.27(s,3H),1.16(s,3H).
CH18化合物17(150mg，0.45mmol)溶解在无水甲醇(15ml)中，加入NaBH4(170mg，4.50mmol),室温反应3小时。反应完全后，减压除去溶剂，加入水(30ml)，乙酸乙酯(10ml×3)萃取，合并有机相，无水Na2SO4干燥，浓缩，硅胶柱层析(DCM：MeOH＝20：1)纯化，得白色固体(120mg，80％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.33(s,1H),4.20–4.13(m,1H),3.03(dd,J＝15.5,6.3Hz,1H),2.62(dd,J＝15.5,11.9Hz,1H),2.46(dd,J＝11.1,3.1Hz,1H),2.30(ddd,J＝13.9,8.3,2.5Hz,2H),2.24–2.06(m,3H),1.97(s,1H),1.93(dd,J＝10.8,3.4Hz,1H),1.78–1.70(m,4H),1.65–1.49(m,9H),1.35–1.24(m,2H),1.14(s,3H),1.13(s,3H).
CH19化合物12(150mg，0.45mmol)溶解在无水二氯甲烷(20ml)中，加入氯化亚砜(1mL)，室温反应2小时。反应完全后，减压除去溶剂，加入水(30ml)，乙酸乙酯(10ml×3)萃取，合并有机相，无水Na2SO4干燥，浓缩，硅胶柱层析(DCM：MeOH＝20：1)纯化，得白色固体(133mg，85％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.45–5.38(m,1H),3.84–3.71(m,1H),3.04(dd,J＝15.5,6.3Hz,1H),2.68–2.46(m,4H),2.23(td,J＝11.7,6.4Hz,1H),2.11(d,J＝14.4Hz,2H),1.92(s,3H),1.77(s,5H),1.61(s,2H),1.13(s,6H).
实施例6：式(5)所示去氢表雄酮衍生物的制备。
化合物8表雄酮(5g，17.2mmol)溶解在无水二氯甲烷(40ml)中，依次加入Ac2O(15.6g，103.3mmol),DMAP(630mg，5.16mmol)，室温反应5小时。反应完全后，减压除去溶剂,加入乙酸乙酯(60ml)溶解，依次用饱和碳酸氢钠溶液(50ml×3)，饱和氯化铵溶液(50ml×3)洗涤，分离有机相，无水Na2SO4干燥，浓缩，得白色固体(5.61g，98％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.73–4.61(m,1H),2.42(dd,J＝19.2,8.7Hz,1H),2.07(dd,J＝18.8,9.5Hz,1H),2.01(s,3H),1.96–1.87(m,1H),1.82–1.69(m,4H),1.66–1.57(m,2H),1.50(dd,J＝24.2,11.8Hz,3H),1.39–1.16(m,7H),1.00(dd,J＝27.9,15.3Hz,2H),0.85(s,3H),0.84(s,3H),0.70(td,J＝11.8,4.0Hz,1H).
化合物9化合物8(400mg，1.21mmol)溶解在无水乙醇(20mL)中，依次加入盐酸氨基脲(675mg，6mmol),无水乙酸钠(492mg，6mmol)，室温反应6小时。TLC检测反应完全后，将反应液浓缩，加入H2O(30mL),乙酸乙酯(10ml×3)萃取，合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠溶液(20ml×3)洗涤，饱和食盐水(20ml×3)洗涤，无水Na2SO4干燥，浓缩，硅胶柱层析(DCM：MeOH＝20：1)纯化，得白色固体(440mg，94％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.82(s,1H),4.73–4.63(m,1H),2.38(dd,J＝13.1,5.2Hz,2H),2.27–2.14(m,1H),2.02(s,3H),1.95–1.78(m,3H),1.74(d,J＝12.9Hz,2H),1.61(d,J＝11.8Hz,2H),1.56–1.39(m,3H),1.32(dd,J＝29.3,21.1Hz,5H),1.23–1.09(m,2H),1.09–0.92(m,2H),0.86(s,3H),0.84(s,3H),0.72(d,J＝2.5Hz,1H).
CH20化合物9(435mg，1.12mmol)溶解在无水二氯甲烷(20ml)中，冰水浴下滴加二氯亚砜(2ml),10分钟滴完，室温反应5小时。TLC检测反应完全后，将反应液浓缩，加入水(30ml)，乙酸乙酯(10ml×3)萃取，合并有机相，无水Na2SO4干燥，浓缩，硅胶柱层析(DCM：MeOH＝40：1)纯化，得白色固体(335mg，82％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.75–4.65(m,1H),3.02(dd,J＝15.5,6.3Hz,1H),2.59(dd,J＝15.5,11.9Hz,1H),2.43(dd,J＝12.0,3.1Hz,1H),2.22(td,J＝11.5,6.3Hz,1H),2.02(s,3H),1.91–1.81(m,2H),1.81–1.71(m,4H),1.69–1.46(m,5H),1.45–1.31(m,3H),1.30–1.21(m,1H),1.09(d,J＝5.0Hz,3H),0.91(s,3H).
CH21化合物CH20(230mg，0.62mmol)溶解在甲醇(10ml)和水(2ml)的混合溶剂中，加入碳酸钾(428mg，3.1mmol)，室温反应4小时。TLC检测反应完全后，将反应液浓缩，加入水(30ml)，稀盐酸(1M)调节溶液pH至5-6，乙酸乙酯(10ml×3)萃取，合并有机相，无水Na2SO4干燥，浓缩，硅胶柱层析(DCM：MeOH＝30：1)纯化，得白色固体(190mg，93％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.66–3.56(m,1H),3.02(dd,J＝15.5,6.3Hz,1H),2.59(dd,J＝15.5,11.9Hz,1H),2.48–2.38(m,1H),2.21(td,J＝11.6,6.4Hz,1H),1.90–1.80(m,2H),1.80–1.70(m,4H),1.57(s,3H),1.43(dd,J＝11.3,3.5Hz,1H),1.32(ddd,J＝29.6,12.9,4.6Hz,4H),1.18(ddd,J＝10.3,7.6,3.7Hz,1H),1.10(s,3H),1.02(ddd,J＝14.5,12.2,5.6Hz,2H),0.90(s,3H).
CH22化合物CH21(150mg，0.45mmol)溶解在无水二氯甲烷(20ml)中，依次加入DMAP(55mg，0.45mmol)、丙酰氯(0.8mL，9.0mmol),氮气保护，室温反应4小时。TLC检测反应完全后，将反应液浓缩，加入水(30ml)，乙酸乙酯(10ml×3)萃取，合并有机相，无水Na2SO4干燥，浓缩，硅胶柱层析(PE：EA＝5：1)纯化，得白色固体(153mg，88％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.71(ddd,J＝16.2,11.0,4.9Hz,1H),3.02(dd,J＝15.5,6.3Hz,1H),2.59(dd,J＝15.5,12.0Hz,1H),2.43(dd,J＝11.9,3.2Hz,1H),2.29(q,J＝7.6Hz,2H),2.24–2.17(m,1H),1.89–1.80(m,2H),1.77(dd,J＝9.1,4.1Hz,4H),1.69–1.49(m,4H),1.41–1.31(m,3H),1.30–1.19(m,2H),1.13(t,J＝7.6Hz,3H),1.09(s,3H),0.92(s,3H).
CH23化合物CH21(150mg，0.45mmol)溶解在无水二氯甲烷(20ml)中，依次加入DMAP(55mg，0.45mmol)、甲基磺酰氯(0.7mL，9.0mmol),氮气保护，室温反应4小时。TLC检测反应完全后，将反应液浓缩，加入水(30ml)，乙酸乙酯(10ml×3)萃取，合并有机相，无水Na2SO4干燥，浓缩，硅胶柱层析(PE：EA＝2：1)纯化，得白色固体(167mg，90％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.69–4.58(m,1H),3.10–2.93(m,4H),2.60(dd,J＝15.5,11.9Hz,1H),2.44(dd,J＝11.4,3.2Hz,1H),2.21(td,J＝11.6,6.4Hz,1H),2.02(d,J＝14.0Hz,1H),1.86–1.71(m,6H),1.63(d,J＝11.7Hz,1H),1.58(s,3H),1.44–1.33(m,2H),1.30–1.21(m,1H),1.09(s,3H),0.92(s,3H).
CH24化合物CH21(150mg，0.45mmol)溶解在无水二氯甲烷(20ml)中，依次加入DMAP(55mg，0.45mmol)、丁二酸酐(225mg，2.25mmol),氮气保护，室温反应6小时。TLC检测反应完全后，将反应液浓缩，加入水(30ml)，稀盐酸酸化至弱酸性，乙酸乙酯(10ml×3)萃取，合并有机相，无水Na2SO4干燥，浓缩，硅胶柱层析(DCM：MeOH＝30：1)纯化，得白色固体(176mg，90％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.80–4.67(m,1H),3.02(dd,J＝15.5,6.3Hz,1H),2.70–2.64(m,2H),2.63–2.54(m,3H),2.43(dd,J＝11.9,3.1Hz,1H),2.21(td,J＝11.6,6.4Hz,1H),1.88–1.81(m,2H),1.81–1.71(m,4H),1.67–1.61(m,1H),1.60–1.49(m,2H),1.37(d,J＝11.3Hz,2H),1.31–1.20(m,2H),1.09(s,3H),0.91(d,J＝5.3Hz,3H).
CH25-1化合物CH21(250mg，0.75mmol)溶解在无水二氯甲烷(20ml)中，依次加入N-BOC-甘氨酸(526mg，3.0mmol)、HOBT(405mg，3.0mmol)、EDCI(575mg，3.0mmol)、DMAP(366mg，3.0mmol)，氮气保护，室温反应8小时。TLC检测反应完全后，将反应液浓缩，加入水(30ml)，乙酸乙酯(10ml×3)萃取，合并有机相，无水Na2SO4干燥，浓缩，硅胶柱层析(PE：EA＝3：1)纯化，得白色固体(340mg，93％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.01(s,1H),4.80(ddd,J＝16.1,11.0,5.0Hz,1H),3.89(d,J＝4.7Hz,2H),3.04(dd,J＝15.5,6.3Hz,1H),2.62(dd,J＝15.4,12.0Hz,1H),2.46(dd,J＝11.6,3.4Hz,1H),2.24(td,J＝11.6,6.3Hz,1H),1.86(dd,J＝14.7,7.6Hz,2H),1.83–1.73(m,4H),1.71–1.55(m,7H),1.48(s,9H),1.44–1.34(m,3H),1.34–1.21(m,2H),1.12(s,3H),0.94(s,3H).
CH25化合物CH25-1(280mg，0.57mmol)溶解在无水乙醚(20ml)中，缓慢加入三氟化硼乙醚(5mL)，室温反应2小时。TLC检测反应完全后，冰水浴下滴加饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，乙酸乙酯(10ml×3)萃取，合并有机相，无水Na2SO4干燥，浓缩，硅胶柱层析(DCM：MeOH＝10：1)纯化，得白色固体(172mg，77％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.82–4.71(m,1H),3.46(d,J＝10.7Hz,2H),3.01(dd,J＝15.5,6.3Hz,1H),2.59(dd,J＝15.5,11.9Hz,1H),2.43(dd,J＝11.7,3.2Hz,1H),2.27–2.12(m,4H),1.84(td,J＝11.3,3.6Hz,2H),1.81–1.71(m,4H),1.69–1.62(m,1H),1.61–1.48(m,2H),1.46–1.31(m,3H),1.31–1.19(m,2H),1.09(s,3H),0.91(s,3H).
CH26-1化合物CH21(200mg，0.60mmol)溶解在无水二氯甲烷(20ml)中，依次加入N-BOC-4-氨基丁酸(487mg，2.4mmol)、HOBT(324mg，2.4mmol)、EDCI(460mg，2.4mmol)、DMAP(293mg，2.4mmol)，氮气保护，室温反应8小时。TLC检测反应完全后，将反应液浓缩，加入水(30ml)，乙酸乙酯(10ml×3)萃取，合并有机相，无水Na2SO4干燥，浓缩，硅胶柱层析(PE：EA＝3：1)纯化，得白色固体(240mg，96％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.76–4.67(m,1H),4.65(d,J＝11.9Hz,1H),3.15(d,J＝6.3Hz,2H),3.01(dd,J＝15.5,6.3Hz,1H),2.59(dd,J＝15.5,12.0Hz,1H),2.43(dd,J＝11.8,3.3Hz,1H),2.31(t,J＝7.3Hz,2H),2.21(td,J＝11.6,6.4Hz,1H),1.90–1.71(m,8H),1.59–1.48(m,2H),1.43(s,9H),1.37(s,2H),1.09(s,3H),0.91(s,3H).
CH26化合物CH26-1(230mg，0.55mmol)溶解在无水乙醚(20ml)中，缓慢加入三氟化硼乙醚(4mL)，室温反应2小时。TLC检测反应完全后，冰水浴下滴加饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，乙酸乙酯(10ml×3)萃取，合并有机相，无水Na2SO4干燥，浓缩，硅胶柱层析(DCM：MeOH＝10：1)纯化，得白色固体(133mg，72％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.77–4.65(m,1H),3.02(dd,J＝15.5,6.3Hz,1H),2.73(t,J＝7.0Hz,1H),2.59(dd,J＝15.5,11.9Hz,1H),2.43(dd,J＝12.0,3.0Hz,1H),2.33(dd,J＝12.5,5.1Hz,2H),2.22(td,J＝11.6,6.4Hz,1H),1.89–1.80(m,2H),1.75(dd,J＝14.1,7.1Hz,6H),1.67–1.46(m,3H),1.44–1.30(m,5H),1.30–1.17(m,2H),1.09(s,3H),0.91(d,J＝5.4Hz,3H).
CH27-1化合物CH21(250mg，0.75mmol)溶解在无水二氯甲烷(20ml)中，依次加入N-BOC-L-脯氨酸(646mg，3.0mmol)、HOBT(405mg，3.0mmol)、EDCI(575mg，3.0mmol)、DMAP(366mg，3.0mmol)，氮气保护，室温反应8小时。TLC检测反应完全后，将反应液浓缩，加入水(30ml)，乙酸乙酯(10ml×3)萃取，合并有机相，无水Na2SO4干燥，浓缩，硅胶柱层析(PE：EA＝3：1)纯化，得白色固体(390mg，98％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.80–4.68(m,1H),4.31–4.16(m,1H),3.46(ddt,J＝19.5,13.7,11.4Hz,2H),3.02(dd,J＝15.5,6.3Hz,1H),2.59(dd,J＝15.1,12.2Hz,1H),2.44(d,J＝9.1Hz,1H),2.22(td,J＝11.6,5.9Hz,2H),1.99–1.71(m,9H),1.71–1.51(m,6H),1.44(d,J＝16.5Hz,9H),1.35(t,J＝16.1Hz,3H),1.25(dd,J＝13.7,6.8Hz,2H),1.09(s,3H),0.91(s,3H).
CH27化合物CH27-1(300mg，0.56mmol)溶解在无水乙醚(20ml)中，缓慢加入三氟化硼乙醚(5mL)，室温反应2小时。TLC检测反应完全后，冰水浴下滴加饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，乙酸乙酯(10ml×3)萃取，合并有机相，无水Na2SO4干燥，浓缩，硅胶柱层析(DCM：MeOH＝10：1)纯化，得白色固体(180mg，74％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.84–4.68(m,1H),3.80–3.66(m,1H),3.14–3.06(m,1H),3.02(dd,J＝15.5,6.3Hz,1H),2.91(dd,J＝16.0,6.6Hz,1H),2.60(dd,J＝15.3,12.1Hz,1H),2.47–2.41(m,1H),2.27–2.09(m,2H),1.81(dd,J＝24.5,10.5Hz,9H),1.59(dt,J＝25.2,12.1Hz,3H),1.46–1.32(m,3H),1.27(d,J＝9.6Hz,2H),1.10(s,3H),0.93(s,3H).
CH28-1化合物CH21(250mg，0.75mmol)溶解在无水二氯甲烷(20ml)中，依次加入N-BOC-4-哌啶甲酸(688mg，3.0mmol)、HOBT(405mg，3.0mmol)、EDCI(575mg，3.0mmol)、DMAP(366mg，3.0mmol)，氮气保护，室温反应8小时。TLC检测反应完全后，将反应液浓缩，加入水(30ml)，乙酸乙酯(10ml×3)萃取，合并有机相，无水Na2SO4干燥，浓缩，硅胶柱层析(PE：EA＝3：1)纯化，得白色固体(400mg，98％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.78–4.65(m,1H),3.99(d,J＝13.4Hz,2H),3.01(dd,J＝15.5,6.3Hz,1H),2.92–2.77(m,2H),2.59(dd,J＝15.4,12.0Hz,1H),2.49–2.35(m,2H),2.21(td,J＝11.6,6.4Hz,1H),1.79(ddt,J＝20.5,17.5,8.7Hz,9H),1.61(td,J＝14.4,4.1Hz,4H),1.45(s,9H),1.40–1.30(m,3H),1.09(s,3H),0.91(s,3H).
CH28化合物CH28-1(320mg，0.59mmol)溶解在无水乙醚(20ml)中，缓慢加入三氟化硼乙醚(4mL)，室温反应2小时。TLC检测反应完全后，冰水浴下滴加饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，乙酸乙酯(10ml×3)萃取，合并有机相，无水Na2SO4干燥，浓缩，硅胶柱层析(DCM：MeOH＝10：1)纯化，得白色固体(210mg，82％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.79–4.61(m,1H),3.14–3.05(m,2H),3.02(dd,J＝15.5,6.4Hz,1H),2.68–2.60(m,2H),2.60–2.54(m,1H),2.48–2.40(m,1H),2.36(ddd,J＝11.2,7.5,3.6Hz,1H),2.22(td,J＝11.6,6.4Hz,1H),1.90–1.69(m,9H),1.69–1.51(m,6H),1.40–1.21(m,4H),1.09(s,3H),0.91(s,3H).
CH29-1化合物CH21(250mg，0.75mmol)溶解在无水二氯甲烷(20ml)中，依次加入N-BOC-3-哌啶甲酸(688mg，3.0mmol)、HOBT(405mg，3.0mmol)、EDCI(575mg，3.0mmol)、DMAP(366mg，3.0mmol)，氮气保护，室温反应8小时。TLC检测反应完全后，将反应液浓缩，加入水(30ml)，乙酸乙酯(10ml×3)萃取，合并有机相，无水Na2SO4干燥，浓缩，硅胶柱层析(PE：EA＝5：1)纯化，得白色固体(392mg，96％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.78–4.64(m,1H),4.12(d,J＝7.1Hz,1H),3.94–3.83(m,1H),3.00(dt,J＝16.5,8.2Hz,2H),2.86–2.76(m,1H),2.59(dd,J＝15.4,12.0Hz,1H),2.46–2.34(m,2H),2.21(td,J＝11.6,6.4Hz,1H),2.02(d,J＝15.8Hz,1H),1.86–1.70(m,7H),1.63(s,3H),1.55(dd,J＝29.3,12.0Hz,5H),1.46(s,9H),1.41–1.31(m,4H),1.09(s,3H),0.91(s,3H).
CH29化合物CH29-1(270mg，0.49mmol)溶解在无水乙醚(20ml)中，缓慢加入三氟化硼乙醚(4mL)，室温反应2小时。TLC检测反应完全后，冰水浴下滴加饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，乙酸乙酯(10ml×3)萃取，合并有机相，无水Na2SO4干燥，浓缩，硅胶柱层析(DCM：MeOH＝10：1)纯化，得白色固体(162mg，75％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.24(s,1H),4.75(s,1H),3.63–3.10(m,4H),3.01(dd,J＝15.5,6.3Hz,1H),2.90(s,1H),2.59(dd,J＝15.4,12.0Hz,1H),2.43(dd,J＝11.9,2.9Hz,1H),2.28–1.96(m,5H),1.95–1.69(m,9H),1.56(dd,J＝24.6,12.2Hz,3H),1.46–1.31(m,3H),1.25(s,1H),1.09(s,3H),0.92(s,3H).
CH33-1化合物CH21(250mg，0.75mmol)溶解在无水二氯甲烷(20ml)中，依次加入N-BOC-D-脯氨酸(646mg，3.0mmol)、HOBT(405mg，3.0mmol)、EDCI(575mg，3.0mmol)、DMAP(366mg，3.0mmol)，氮气保护，室温反应8小时。TLC检测反应完全后，将反应液浓缩，加入水(30ml)，乙酸乙酯(10ml×3)萃取，合并有机相，无水Na2SO4干燥，浓缩，硅胶柱层析(PE：EA＝3：1)纯化，得白色固体(342mg，86％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.80–4.67(m,1H),4.33–4.14(m,1H),3.60–3.33(m,2H),3.02(dd,J＝15.5,6.3Hz,1H),2.65–2.53(m,1H),2.43(d,J＝11.4Hz,1H),2.30–2.11(m,2H),2.00–1.71(m,8H),1.46(s,3H),1.42(s,6H),1.09(s,3H),0.91(s,3H).
CH33化合物CH33-1(332mg，0.63mmol)溶解在无水乙醚(20ml)中，缓慢加入三氟化硼乙醚(4mL)，室温反应2小时。TLC检测反应完全后，冰水浴下滴加饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，乙酸乙酯(10ml×3)萃取，合并有机相，无水Na2SO4干燥，浓缩，硅胶柱层析(DCM：MeOH＝10：1)纯化，得白色固体(218mg，81％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.80–4.68(m,1H),3.69(dd,J＝8.6,5.6Hz,1H),3.11–2.98(m,2H),2.88(dt,J＝10.2,6.7Hz,1H),2.59(dd,J＝15.5,11.9Hz,1H),2.43(dd,J＝11.8,3.2Hz,1H),2.21(td,J＝11.6,6.4Hz,1H),2.11(ddd,J＝15.5,12.7,8.0Hz,1H),2.00–1.70(m,12H),1.67–1.61(m,1H),1.60–1.47(m,2H),1.37(tt,J＝11.8,7.8Hz,3H),1.26(dt,J＝21.6,7.7Hz,1H),1.09(s,3H),0.91(s,3H)
CH30烟酸(277mg，2.25mmol)溶解在无水二氯甲烷(20ml)中，缓慢加入SOCl2(3mL)，氮气保护，回流反应2小时。减压除去溶剂和过量的SOCl2，残留物用无水二氯甲烷(20ml)溶解，依次加入化合物CH21(150mg，0.45mmol)、DMAP(122mg，1mmol)，氮气保护，室温反应4小时，TLC检测反应完全后，减压除去溶剂，加入H2O(30ml),乙酸乙酯(10ml×3)萃取，合并有机相，无水Na2SO4干燥，浓缩，硅胶柱层析(PE：EA＝2：1)纯化，得白色固体(163mg，83％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.24(s,1H),8.79(d,J＝4.3Hz,1H),8.41(d,J＝7.7Hz,1H),7.54–7.45(m,1H),5.06–4.95(m,1H),3.03(dd,J＝15.5,6.4Hz,1H),2.61(dd,J＝15.5,11.9Hz,1H),2.46(dd,J＝11.7,3.1Hz,1H),2.24(td,J＝11.6,6.4Hz,1H),2.00(d,J＝12.5Hz,1H),1.92–1.74(m,6H),1.70(d,J＝16.0Hz,1H),1.57(dd,J＝23.4,11.9Hz,2H),1.46–1.22(m,4H),1.18(d,J＝10.0Hz,1H),1.11(s,3H),0.98(s,3H).
CH31异烟酸(277mg，2.25mmol)溶解在无水二氯甲烷(20ml)中，缓慢加入SOCl2(3mL)，氮气保护，回流反应2小时。减压除去溶剂和过量的SOCl2，残留物用无水二氯甲烷(20ml)溶解，依次加入化合物CH21(150mg，0.45mmol)、DMAP(122mg，1mmol)，氮气保护，室温反应4小时，TLC检测反应完全后，减压除去溶剂，加入H2O(30ml),乙酸乙酯(10ml×3)萃取，合并有机相，无水Na2SO4干燥，浓缩，硅胶柱层析(PE：EA＝2：1)纯化，得白色固体(176mg，89％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.78(d,J＝5.2Hz,2H),7.90(d,J＝5.5Hz,2H),5.04–4.94(m,1H),3.03(dd,J＝15.5,6.3Hz,1H),2.61(dd,J＝15.5,11.9Hz,1H),2.45(dd,J＝11.7,3.2Hz,1H),2.24(td,J＝11.6,6.4Hz,1H),2.00(d,J＝10.2Hz,1H),1.80(d,J＝12.4Hz,6H),1.70(dd,J＝12.8,3.1Hz,1H),1.63–1.53(m,2H),1.33(d,J＝61.6Hz,4H),1.18(dd,J＝13.7,3.7Hz,1H),1.11(s,3H),0.97(s,3H).
CH322-吡嗪羧酸(279mg，2.25mmol)溶解在无水二氯甲烷(20ml)中，缓慢加入SOCl2(3mL)，氮气保护，回流反应2小时。减压除去溶剂和过量的SOCl2，残留物用无水二氯甲烷(20ml)溶解，依次加入化合物CH21(150mg，0.45mmol)、DMAP(122mg，1mmol)，氮气保护，室温反应4小时，TLC检测反应完全后，减压除去溶剂，加入H2O(30ml),乙酸乙酯(10ml×3)萃取，合并有机相，无水Na2SO4干燥，浓缩，硅胶柱层析(PE：EA＝3：1)纯化，得白色固体(172mg，87％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.30(s,1H),8.74(d,J＝5.6Hz,2H),5.15–5.04(m,1H),3.03(dd,J＝15.5,6.3Hz,1H),2.60(dd,J＝15.5,12.0Hz,1H),2.45(dd,J＝11.8,3.2Hz,1H),2.24(td,J＝11.6,6.4Hz,1H),2.02(d,J＝8.8Hz,1H),1.91–1.72(m,7H),1.65(s,4H),1.46–1.31(m,3H),1.10(s,3H),0.97(s,3H).
实施例7：母体化合物表雄酮和去氢表雄酮的结构。
实施例8：表雄酮和去氢表雄酮衍生物抗肿瘤细胞增殖测试
采用SRB法在乳腺癌细胞株T47D、MDA-231和MCF7，前列腺癌细胞株DU145和LNCaP，结肠癌细胞株HCT116和HT29，人成纤维细胞株HAF受试物对相应细胞增值的抑制率。采用MTS法在白血病细胞株HL60和Jurka中测定受试物对相应细胞增值的抑制率。计算半数抑制浓度(IC50)，并与阳性对照(阿霉素)进行比较。
1、测试原理：
SRB法：磺酰罗丹明B(SRB)是一种粉红色阴离子染料，易溶于水，在酸性条件下可特异性地与细胞内组成蛋白质的碱性氨基酸结合，其在515nm波长处产生吸收峰。在一定读值范围内，吸光值与细胞量成线性正相关，故可用作细胞数的定量检测。
MTS法：MTS是一种四唑类化合物，能够被细胞生物还原成为一种有色的甲臜产物，该产物可直接溶解于培养基中。甲臜产物的量与培养中的活细胞数成正比，其在490nm波长处产生吸收峰。在一定读值范围内，吸光值与甲臜产物和细胞量成线性正相关，故可用作细胞数的定量检测。
2、样品测试：
方法1(对T47D、MDA-231、MCF7、DU145、LNCaP、HCT116、HT29、HAF细胞适用)：
(1)各细胞以适当的密度接种到96孔板上，经过24小时培养后，实验组给予不同浓度的化合物处理96小时，对照组使用正常培养基。(2)药物作用96小时后，取出培养板，每孔加入25μL50％TCA溶液固定细胞，4℃放置1小时以上。(3)取出固定后的培养板，用水冲洗5遍，自然晾干或吹风机吹干后，每孔加入50μL 0.4％SRB溶液，染色10分钟，弃去染色液，1％冰醋酸洗涤并用吹风机吹干。(4)用100μL Tris-base碱液(10mM)溶解与细胞蛋白结合的染料，采用酶标仪515nm处测定光吸收值。(5)IC50用GraphPad软件计算得到。
方法2(对HL60、Jurka细胞适用)：
(1)白血病细胞以合适密度接种在96孔板上，同时给予不同浓度的化合物处理96小时，对照组使用正常培养基。(2)药物作用96小时后，取出培养板，每孔加入20μ入50％TCA MTS溶液，37℃孵育约60min。(3)采用酶标仪在490nm处测定光吸收值(control组读值应在0.8-1.2之间)。(4)IC50用GraphPad软件计算得到。
3、结论
各测试化合物对人源乳腺癌细胞T47D和人成纤维细胞HAF在1μM浓度下的抑制率见图1，半数抑制浓度(IC50)数据见表1。结果显示，化合物CH33(IC50＝0.0583μM)抑制乳腺癌细胞T47D增值能力明显强于母体表雄酮(IC50＝1.23μM)，与表雄酮相比增强了21倍，和阳性对照阿霉素(IC50＝0.0398μM)的抑制能力几乎相当。化合物CH33(21.13μM)与阳性化合物阿霉素(0.0680μM)相比，表现出了对正常成纤维细胞HAF更低的细胞毒性。同时CH33也表现出了对乳腺癌细胞系T47D和正常成纤维细胞HAF的极大的选择性(IC50HAF/IC50T47D＝362)。
部分测试化合物对肿瘤细胞的毒性测试的半数抑制浓度(IC50)数据见表2。可见本发明所述化合物对包括T47D在内的10株肿瘤细胞的抗细胞增值活性数据(IC50)。表中的本发明所述化合物，尤其是CH33同时表现出了对乳腺癌细胞T47D细胞增殖的选择性抑制。
测试化合物CH27、CH33在24小时时可以浓度依赖性地诱导T47D细胞的凋亡，如图2，图3所示。
CH33能够抑制多种肿瘤细胞的增殖，诱导细胞的凋亡，同时对人源乳腺癌细胞T47D表现出较强的选择性，可见其是治疗乳腺癌，特别是某一特别类型乳腺癌的潜在药物。
实施例9：CH27和CH33对乳腺癌细胞系T47D凋亡诱导的测试
实验原理：在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素(EGFP、FITC)标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。
样品测试：(1)T47D细胞以合适密度接种于6孔板，经过24小时培养后，按照0μM、0.5μM、2.5μM、12.5μM浓度的CH27或CH33处理细胞。(2)24小时后，收集细胞，设置不染组、单染PI组、单染Annexin V组以及不同浓度的双染组。(3)收集的细胞经PBS洗涤后，每管加入100μL 1×的结合缓冲液，不染组不加PI以及Annexin V，单染PI组加入PI 5μL，单染Annexin V组加入Annexin V 5μL，Annexin-V-PI双染组均加入PI和Annexin V各5μL，混匀。(4)室温避光孵育15分钟，将细胞转移到流式管中，上机检测。
结论：CH27及CH33在处理细胞24小时后，即可浓度依赖性地诱导T47D细胞的明显凋亡，如图2、3所示。这可能是本发明所述衍生物抗乳腺癌的主要机制所在。
以下表1，表示母体表雄酮、去氢表雄酮、阳性对照阿霉素和本发明所述化合物抑制人源乳腺癌细胞T47D以及人成纤维细胞HAF的细胞增殖活性数据(IC50)。其中化合物CH33(IC50＝0.0583μM)抑制人源乳腺癌细胞T47D增值能力明显强于其母体表雄酮(IC50＝1.23μM)，和阳性对照阿霉素(IC50＝0.0398μM)的抑制能力几乎相当。同时化合物CH33(21.13μM)与阳性化合物阿霉素(0.0680μM)相比，表现出了对正常细胞人成纤维细胞HAF更低的细胞毒性。同时CH33还表现出了对乳腺癌细胞系T47D和正常人成纤维细胞HAF的极大的选择性(IC50HAF/IC50T47D＝362)。
表2表示本发明所述化合物抑制包括人源乳腺癌细胞T47D在内的10株肿瘤细胞的细胞增殖活性数据(IC50)。表中的本发明所述化合物，尤其是CH33表现出了对人源乳腺癌细胞T47D选择性的增殖抑制活性。
表1.表雄酮衍生物对人源乳腺癌细胞株T47D以及人成纤维细胞HAF体外细胞毒活性
表2.表雄酮衍生物对T47D,HAF,MDA-231,MCF7,DU145,LNCaP,HCT116,HT29,HL60,Jurkat细胞株体外细胞毒活性

Claims (21)

1.一种表雄酮和去氢表雄酮衍生物，其特征在于，其结构如式(I)所示：
式(I)中，所述H为五元杂环或六元杂环；
所述R为-H、-COOC2H5、-CF3、-CH2OH、-COOH、-Ac、-SO2Me、
2.如权利要求1所述的去氢表雄酮衍生物，其特征在于，其结构如式(1)所示：
其中，R＝-H、-COOC2H5、-CF3、-CH2OH、-COOH。
3.如权利要求1所述的去氢表雄酮衍生物，其特征在于，所述去氢表雄酮衍生物如式(2)所示：
其中，R＝-H、-COOC2H5、-COOH。
4.如权利要求1所述的去氢表雄酮衍生物，其特征在于，所述去氢表雄酮衍生物如式(3) 所示：
。
5.如权利要求1所述的去氢表雄酮衍生物，其特征在于，所述去氢表雄酮衍生物如式(4)所示：
其中，R＝-H、-Ac。
6.如权利要求1所述的去氢表雄酮衍生物，其特征在于，所述去氢表雄酮衍生物分别如式(CH16)、式(CH17)、式(CH18)、式(CH19)所示：
7.如权利要求1所述的表雄酮衍生物，其特征在于，所述表雄酮衍生物如式(5)所示：
其中，R＝-H、-Ac、-SO2Me、
8.一种去氢表雄酮衍生物的制备方法，其特征在于，以去氢表雄酮为原料，经羟基保护、酰基化反应、关环反应、羟基脱保护、酯基还原、酯基水解反应后，得到如式(CH05)、式(CH06)、式(CH07)、式(CH08)、式(CH09)、式(CH10)、式(CH13)、式(CH14)、式(CH15)所示的去氢表雄酮衍生物；所述制备方法的反应路线如下：
。
9.一种去氢表雄酮衍生物的制备方法，其特征在于，以去氢表雄酮为原料，经羟基保护、缩合反应、关环反应、羟基脱保护反应后，得到如式(CH11)、式(CH12)所示的去氢表雄酮衍生物；所述制备方法的反应路线如下：
。
10.一种去氢表雄酮衍生物的制备方法，其特征在于，以式(CH12)所示的去氢表雄酮衍生物为原料，分别经IBX氧化、异丙醇铝氧化反应、硼氢化钠还原反应、取代反应后，得到如式(CH16)、式(CH17)、式(CH18)、式(CH19)所示的去氢表雄酮衍生物；所述制备方 法的反应路线如下：
。
11.一种表雄酮衍生物的制备方法，其特征在于，以表雄酮为原料，经羟基保护、缩合反应、关环反应、羟基脱保护反应后，得到如式(CH20)和式(CH21)表雄酮衍生物；所述制备方法的反应路线如下：
。
12.一种表雄酮衍生物的制备方法，其特征在于，以式(CH21)所示的表雄酮衍生物为原料，分别与丙酰氯、甲基磺酰氯、丁二酸酐在DMAP催化下发生缩合反应，得到如式(CH22)、式(CH23)、式(CH24)所示的表雄酮衍生物；所述制备方法的反应路线如下：
。
13.一种表雄酮衍生物的制备方法，其特征在于，以式(CH21)所示的表雄酮衍生物为原料，分别与N-Boc-甘氨酸、N-Boc-4-氨基丁酸、N-Boc-L-脯氨酸、N-Boc-D-脯氨酸、N-Boc-4-哌啶甲酸、N-Boc-3-哌啶甲酸在DMAP和EDCI的作用下发生缩合反应，得到如式(CH25)、式(CH26)、式(CH27)、式(CH28)、式(CH29)、式(CH33)所示表雄酮衍生物；所述制备方法的反应路线如下：
。
14.一种表雄酮衍生物的制备方法，其特征在于，以式(CH21)所示的表雄酮衍生物为原料，分别与烟酰氯、异烟酰氯、吡嗪酰氯在DMAP催化下发生缩合反应，得到如式(CH30)、式(CH31)、式(CH32)所示的表雄酮衍生物；所述制备方法的反应路线如下：
。
15.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述羟基保护反应所用的保护基为叔丁基二甲基硅基，所用碱为咪唑、2,6-二甲基吡啶，所用溶剂为N,N-二甲基甲酰胺；所述酰基化反应所用的试剂包括甲酸乙酯、碳酸二乙酯、草酸二乙酯、三氟乙酸乙酯，反应温度在-10℃～150℃之间；所述关环反应所用试剂包括盐酸肼、盐酸羟胺、盐酸胍；所述脱TBS保护所用的试剂包括盐酸乙醚溶液、盐酸乙酸乙酯溶液，所用的溶剂包括二氯甲烷、乙酸乙酯，反应温度为-10℃～100℃。
16.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述羟基保护反应所用的试剂为乙酸酐，所用催化剂为4-N,N-二甲基吡啶；所述脱酯基保护所用的碱为碳酸钾、氢氧化钠。
17.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述氧化反应所用的试剂为IBX、异丙醇铝；所述还原反应所用的试剂为硼氢化钠。
18.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述酰化反应所用的试剂为酸酐、酰氯；所用催化剂为4-二甲氨基吡啶；所用溶剂为二氯甲烷。
19.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述酰化反应所用的试剂为有机酸；所用缩合剂为1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDCI)；所用催化剂为4-N,N-二甲基吡啶(DMAP)、1-羟基苯并三氮唑(HOBt)。
20.如权利要求1～7之任一项所述的去氢表雄酮衍生物和表雄酮衍生物在制备抗乳腺癌药物中的应用。
21.如权利要求20所述的应用，其特征在于，所述表雄酮和去氢表雄酮衍生物抑制乳腺癌细胞的增殖，诱导乳腺癌细胞的凋亡。
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