CN104490793A - 提高肝素钠热稳定性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高肝素钠热稳定性的方法，属于生物技术领域，通过特殊升降温、过滤、氧化、沉淀的方式提高精品肝素钠的热稳定性。本发明提高肝素钠热稳定性的方法，通过控制料液的浓度、酸碱度、升降温的速度和过滤器的孔径，再经过氧化、沉淀等步骤，去除精品肝素钠中隐藏杂质，从而提高精品肝素钠的热稳定性，确保肝素钠注射液无可见异物。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高肝素钠热稳定性的方法。
背景技术
肝素钠是由己糖醛酸(L-艾杜糖醛酸、D-葡萄糖醛酸)和D-硫酸氨基葡萄糖以1→4糖苷键交替形成的粘多糖，具有六糖或八糖重复单位的线性链状结构，其分子量在3000—37000之间，平均分子量在15000。自1916年首次发现肝素钠以来，其在医药方面作为抗凝试剂和抗栓试剂的应用越来越受到人们的关注。此外肝素钠还具有抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌、调血脂等多种生物学功能。
肝素钠是世界上迄今为止已知的分子结构最复杂的化合物，短期内无法人工化学合成，目前只有来源于猪小肠粘膜的肝素钠能够用于临床治疗。肝素钠原料药的原料是肝素钠粗品，其提取只能源自健康生猪的小肠粘膜，由于含有大量杂质蛋白、杂质核酸、微生物等杂质，需经过物理和化学提取分离过程，定向获取天然结构基团完整的肝素钠，从而制成肝素钠原料药。肝素钠原料药是标准肝素钠制剂的唯一有效成分和低分子肝素钠原料的生产起点，目前肝素钠制剂只有按照注射给药方式用于临床，这使得肝素钠原料药需要有很高的纯度，方可保证制剂的用药安全。
基于用药安全，保证产品质量，现中国药典CP2010附录IX H对肝素钠钠注射液(终端灭菌产品)可见异物做出明确规定。
企业应根据药典规定建立控制肝素钠钠注射液(终端灭菌产品)可见异物的措施，保证生产环境、设备、设施等均符合新版GMP的要求。但采用传统工艺所生产的肝素钠钠原料药生产成人体注射用肝素钠钠注射液(终端灭菌产品)在控制项目可见异物(有肉眼可见的小白点)总异常超标。
发明内容
本发明的目的是提供一种确保肝素钠注射液无可见异物的提高肝素钠热稳定性的方法。
本发明所述的提高肝素钠热稳定性的方法，包括以下步骤：
(1)溶解：将肝素钠搅拌溶解，控制溶液浓度(w/v)为13％-15％；
(2)升降温：将步骤(1)所得的肝素钠溶液pH调节至8.5±0.5，控制温度为82±2℃，保温1±0.2h，然后在30±5min内将肝素钠溶液温度升至93±2℃，保温30±5min，最后在30±5min内将肝素钠溶液温度降至35-40℃，停止搅拌，静置1.5-3h；
(3)过滤：将步骤(2)所得的溶液利用微孔过滤器过滤，收集滤液；
(4)沉淀：向步骤(3)所得的滤液中加入氯化钠，搅拌至溶解，然后加入药用乙醇进行沉淀，沉淀静置2.5-3.5h；
(5)二次溶解：将步骤(4)所得沉淀物溶解，控制溶液浓度(w/v)为13％-15％；
(6)氧化：将步骤(5)所得的肝素钠溶液的pH调节至10.5±0.5，控制温度为25-35℃，向肝素钠溶液中加入0.005倍体积的过氧化氢，氧化7-10h；
(7)二次过滤：将步骤(6)所得的溶液利用微孔过滤器过滤，收集滤液；
(8)二次沉淀：将步骤(7)所得的滤液的pH调节至8.5±0.5，向滤液中加入氯化钠，搅拌至溶解，然后加入药用乙醇进行沉淀，沉淀静置2.5-3.5h；
(9)冻干：将步骤(8)所得沉淀溶解，控制溶液浓度(w/v)为15％-20％，调节溶液pH为6.5-7.0，再利用微孔过滤器过滤，最后将滤液冻干。
所述步骤(6)中过氧化氢分三次加入，每次加入1/3的量，每次间隔30min。
所述过氧化氢为原浓度为30％的过氧化氢，加水稀释，过氧化氢与水的体积比为1:3。
所述微孔过滤器的孔径为0.22μm。
步骤(4)和(8)中，沉淀静置3h。
步骤(6)中氧化时间为8h。
所述氯化钠为质量分数为1％的氯化钠。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明提高肝素钠热稳定性的方法，通过控制料液的浓度、酸碱度、升降温的速度和过滤器的孔径，再经过氧化、沉淀等步骤，去除肝素钠中隐藏杂质，从而提高肝素钠的热稳定性，确保肝素钠注射液无可见异物。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
对300g肝素钠原料(质量符合CP2010的规定，但该批原料灌装的肝素钠钠注射液2ml5000单位，可见异物有小白点，检出不合格)进行热稳定性处理。
设备仪器：烧杯(5000ml 1个；250ml 2个)、量筒(250ml 1个；1000ml 1个)、玻璃棒2个、水浴锅2个、温度计、0.22μm囊式过滤器(PALL)、蠕动泵、冻干机。
初始物料：300g肝素钠原料(质量符合CP2010的规定，但该批原料灌装的肝素钠钠注射液2ml 5000单位，可见异物有小白点，检出不合格)。
初始物料性状：冻干粉状。
具体操作如下：
(1)溶解：将300g肝素钠原料置于5000ml的烧杯中，加入2.2L纯化水，搅拌溶解，物料浓度约13.6％；
(2)升降温：将步骤(1)所得的肝素钠溶液pH调节至8.5，然后水浴升温，缓缓搅拌，30min后，溶液温度升至82℃，开始保温1h，然后转移到另一水浴锅内，25min内升温至93℃，开始保温30min，最后在水浴降温，30min内将溶液温度降至38℃；停止搅拌，静止放置2h；
(3)过滤：将步骤(2)所得的溶液利用蠕动泵与0.22μm囊式过滤器进行过滤；
(4)沉淀：向步骤(3)所得的滤液中加入22g1％的氯化钠，搅拌至溶解，边搅拌边加入2.64L药用乙醇，沉淀静置3h；
(5)二次溶解：将步骤(4)所得沉淀物加入2L纯化水溶解，控制溶液浓度(w/v)为15％；
(6)氧化：将步骤(5)所得的肝素钠溶液的pH调节至10.5，水浴控制温度为28℃，将10ml过氧化氢分三次加入肝素钠溶液中，每次间隔30min，氧化8h；
(7)二次过滤：将步骤(6)所得的溶液利用蠕动泵与0.22μm囊式过滤器进行过滤，收集滤液；
(8)二次沉淀：将步骤(7)所得的滤液的pH调节至8.0，向滤液中加入20g1％的氯化钠，搅拌至溶解，然后边搅拌边加入2.4L药用乙醇，沉淀静置3h；
(9)冻干：将步骤(8)所得沉淀用2.0L纯化水溶解，控制溶液浓度(w/v)为15％，调节溶液pH为6.5，利用蠕动泵与0.22μm囊式过滤器进行过滤，最后将滤液冻干。
实施例2
对450g肝素钠原料(质量符合CP2010的规定，但该批原料灌装的肝素钠钠注射液2ml5000单位，可见异物有小白点，检出不合格)进行热稳定性处理。
设备仪器：烧杯(5000ml 1个；250ml 2个)、量筒(250ml 1个；1000ml 1个)、玻璃棒2个、水浴锅2个、温度计、0.22μm囊式过滤器(PALL)、蠕动泵、冻干机。
初始物料：450g肝素钠原料(质量符合CP2010的规定，但该批原料灌装的肝素钠钠注射液2ml 5000单位，可见异物有小白点，检出不合格)。
初始物料性状：冻干粉状。
具体操作如下：
(1)溶解：将450g肝素钠原料置于5000ml的烧杯中，加入3.3L纯化水，搅拌溶解，物料浓度约14.0％；
(2)升降温：将步骤(1)所得的肝素钠溶液pH调节至8.0，然后水浴升温，缓缓搅拌，30min后，溶液温度升至80℃，开始保温1h，然后转移到另一水浴锅内，25min内升温至91℃，开始保温35min，最后在水浴降温，25min内将溶液温度降至35℃；停止搅拌，静止放置2.5h；
(3)过滤：将步骤(2)所得的溶液利用蠕动泵与0.22μm囊式过滤器进行过滤；
(4)沉淀：向步骤(3)所得的滤液中加入33g1％的氯化钠，搅拌至溶解，边搅拌边加入3.98L药用乙醇，沉淀静置3.5h；
(5)二次溶解：将步骤(4)所得沉淀物加入2.8L纯化水溶解，控制溶液浓度(w/v)为14.5％；
(6)氧化：将步骤(5)所得的肝素钠溶液的pH调节至11，水浴控制温度为35℃，将15ml过氧化氢分三次加入肝素钠溶液中，每次间隔30min，氧化10h；
(7)二次过滤：将步骤(6)所得的溶液利用蠕动泵与0.22μm囊式过滤器进行过滤，收集滤液；
(8)二次沉淀：将步骤(7)所得的滤液的pH调节至8.5，向滤液中加入30g1％的氯化钠，搅拌至溶解，然后边搅拌边加入3.6L药用乙醇，沉淀静置3h；
(9)冻干：将步骤(8)所得沉淀用3.0L纯化水溶解，控制溶液浓度(w/v)为16％，调节溶液pH为7.0，利用蠕动泵与0.22μm囊式过滤器进行过滤，最后将滤液冻干。
实施例3
对30Kg肝素钠原料(质量符合CP2010的规定，但该批原料灌装的肝素钠钠注射液2ml12500单位，可见异物有小白点，检出不合格)进行热稳定性处理。
设备仪器：搪玻璃反应釜(2000L 2个、夹层可利用蒸汽与冷冻水升降温；淄博太极)、量筒(250ml 1个；1000ml 1个)、流量计(泉州日新)、温度计、0.22μm微孔过滤器(密理博)、压缩空气、冻干机(上海东富龙)。
初始物料：30Kg肝素钠原料(质量符合CP2010的规定，但该批原料灌装的肝素钠钠注射液2ml 12500单位，可见异物有小白点，检出不合格)。
初始物料性状：冻干粉状
具体操作如下：
(1)溶解：将30Kg肝素钠原料置于2000L的烧搪玻璃反应釜中搅拌溶解，物料浓度为14.3％；
(2)升降温：将步骤(1)所得的肝素钠溶液pH调节至8.5，然后夹层通蒸汽，缓缓搅拌，30min后，溶液温度升至82℃，开始保温1h，然后开大蒸汽，25min内升温至92℃，开始保温30min，最后夹层内通冷冻水降温，30min内将溶液温度降至37℃；停止搅拌，静止放置2.0h；
(3)过滤：将步骤(2)所得的溶液利用压缩空气与0.22μm微孔过滤器进行过滤，过滤至另一2000L搪玻璃反应釜中；
(4)沉淀：向步骤(3)所得的滤液中加入2.1g1％的氯化钠，搅拌至溶解，边搅拌边加入252L药用乙醇，沉淀静置3.0h；
(5)二次溶解：将步骤(4)所得沉淀物加入200L纯化水溶解，控制溶液浓度(w/v)为15％；
(6)氧化：将步骤(5)所得的肝素钠溶液的pH调节至10.5，夹层控制温度为28℃，将1L过氧化氢分三次加入肝素钠溶液中，每次间隔30min，氧化8h；
(7)二次过滤：将步骤(6)所得的溶液利用压缩空气与0.22μm微孔过滤器进行过滤，过滤至另一2000L搪玻璃反应釜中，收集滤液；
(8)二次沉淀：将步骤(7)所得的滤液的pH调节至8.0，向滤液中加入2Kg1％的氯化钠，搅拌至溶解，然后边搅拌边加入240L药用乙醇，沉淀静置3h；
(9)冻干：将步骤(8)所得沉淀用200L纯化水溶解，控制溶液浓度(w/v)为15％，调节溶液pH为7.0，利用蠕动泵与0.22μm微孔过滤器进行过滤，最后将滤液冻干。
经检测，实施例1、2、3所制备的肝素钠冻干粉经检测，符合CP2010质量标准，利用其进行生产的肝素钠注射液(2ml 12500单位)，经检测无可见异物。
Claims (7)
1.一种提高肝素钠热稳定性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)溶解：将肝素钠搅拌溶解，控制溶液浓度(w/v)为13％-15％；
(2)升降温：将步骤(1)所得的肝素钠溶液pH调节至8.5±0.5，控制温度为82±2℃，保温1±0.2h，然后在30±5min内将肝素钠溶液温度升至93±2℃，保温30±5min，最后在30±5min内将肝素钠溶液温度降至35-40℃，停止搅拌，静置1.5-3h；
(3)过滤：将步骤(2)所得的溶液利用微孔过滤器过滤，收集滤液；
(4)沉淀：向步骤(3)所得的滤液中加入氯化钠，搅拌至溶解，然后加入药用乙醇进行沉淀，沉淀静置2.5-3.5h；
(5)二次溶解：将步骤(4)所得沉淀物溶解，控制溶液浓度(w/v)为13％-15％；
(6)氧化：将步骤(5)所得的肝素钠溶液的pH调节至10.5±0.5，控制温度为25-35℃，向肝素钠溶液中加入0.005倍体积的过氧化氢，氧化7-10h；
(7)二次过滤：将步骤(6)所得的溶液利用微孔过滤器过滤，收集滤液；
(8)二次沉淀：将步骤(7)所得的滤液的pH调节至8.5±0.5，向滤液中加入氯化钠，搅拌至溶解，然后加入药用乙醇进行沉淀，沉淀静置2.5-3.5h；
(9)冻干：将步骤(8)所得沉淀溶解，控制溶液浓度(w/v)为15％-20％，调节溶液pH为6.5-7.0，再利用微孔过滤器过滤，最后将滤液冻干。
2.根据权利要求1所述的提高肝素钠热稳定性的方法，其特征在于，所述步骤(6)中过氧化氢分三次加入，每次加入1/3的量，每次间隔30min。
3.根据权利要求1或2所述的提高肝素钠热稳定性的方法，其特征在于，所述过氧化氢为原浓度为30％的过氧化氢，加水稀释，过氧化氢与水的体积比为1:3。
4.根据权利要求1所述的提高肝素钠热稳定性的方法，其特征在于，所述微孔过滤器的孔径为0.22μm。
5.根据权利要求1所述的提高肝素钠热稳定性的方法，其特征在于，步骤(4)和(8)中，沉淀静置3h。
6.根据权利要求1所述的提高肝素钠热稳定性的方法，其特征在于，步骤(6)中氧化时间为8h。
7.根据权利要求1所述的提高肝素钠热稳定性的方法，其特征在于，所述氯化钠为质量分数为1％的氯化钠。
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