CN106589108A - 一种提高绒促性素稳定性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高绒促性素稳定性的方法。利用一定浓度的盐溶液能够促进蛋白质溶解的特性，在对绒促性素进行纯化抽提过程中，通过调节抽提液中盐的成分及其浓度，使绒促性素溶解于抽提液中，然后在抽提液中加入一定比例的乙醇使绒促性素沉淀析出，不同条件下反复去除不稳定的杂蛋白。技术方案是通过对绒促性素粗品分别进行抽提、沉淀、脱水、干燥等步骤来实现从绒促性素粗品中提取绒促性素，所得绒促性素效价约600 iu/mg。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说涉及一种提高绒促性素稳定性的方法。
背景技术
绒促性素（Chorionic Gonadotrophin）系自健康孕妇尿中提取、精制而成的一种天然促性腺激素，具有类似黄体生成素的功能。对女性可促进卵泡的成熟及排卵，并维持黄体的功能。对男性，能刺激睾丸间质细胞的发育，增加雄激素分泌，促使睾丸下降和男性第二性征发育。与尿促性素合用，可模拟生理性的促黄体生成素高峰，而触发排卵。临床上绒促性素至今仍是治疗月经失调、无排卵性不孕症、先兆流产和习惯性流产、隐睾症、男性性功能低下等的首选药物。
国际上从20年代就开始研究，1927年Zondek和Ascbheim首先发现妊娠妇女尿中存在着促性腺激素，1936年Brown和Venning找到在妊娠第60-80天，尿中绒促性素分泌达到最高峰。
1928年Zondek和Ascbheim 首先用乙醇沉淀法，从孕妇尿中取得了活性物质，其它研究者则进行应用吸附剂从尿中直接吸附绒促性素的研究，这包括1932年Katzman和Doisy用苯甲酸吸附法，1943年Katzman等人用人造沸石层析吸附法，1954年Loraine和Brown用高岭土吸附法，1959年难波修一等人用离子交换树脂吸附法等，用这些方法所取得的绒促性素再用各种纯化方法进行纯化。目前国际上生产的绒促性素的纯度2500-5000iu/mg，科研的水平则达到10000iu/mg。
发明内容
本发明提供了一种提高绒促性素稳定性的方法，利用绒促性素是一种糖蛋白，一定浓度的盐溶液能够促进蛋白质溶解的性质，抽提过程中，调节抽提液中盐的成分及其浓度，使绒促性素溶解于抽提液中，然后在抽提液中加入一定浓度的乙醇，使绒促性素沉淀析出，不同条件下反复去除不稳定的杂蛋白。
一种提高绒促性素稳定性的方法，其特征在于：将效价约10 iu/mg绒促性素粗品中加入抽提液溶解，不同条件下反复抽提，然后乙醇沉淀、脱水、干燥，所得绒促性素效价约600 iu/mg。
在发明的技术方案中，其特征还在于所述抽提法包括如下步骤：
1.抽提
1.1抽提液的配制：
称取乙酸钠1.36kg、无水氯化钙0.166kg、氯化钠2.92kg，加入纯化水溶解并稀释至100L；然后向该溶液中滴加冰乙酸，调节pH值至4.8-5.0，再加95%乙醇，使乙醇浓度为50%，搅拌混合均匀，置温度8-12℃条件下保存。
1.2 抽提：
将1kg效价约10 iu/mg的绒促性素粗制品慢慢加到抽提液15L-25L，在溶液温度8-12℃条件下搅拌5小时，静置过夜。
2.乙醇沉淀
2.1次日虹吸上清液，离心，每1kg离心渣干粉加抽提液3.3L，在溶液温度8-12℃条件下搅拌1小时，离心取上清液。
2.2合并二次上清液，按1L：(2L-3L)比例加 -20℃以下95%乙醇，边搅边加，并继续搅拌30分钟，在温度8-12℃条件下静置过夜。
3.二次抽提
3.1二次抽提液的配制：
称取乙酸钠1.36kg，加入纯化水溶解并稀释至100L；然后向该溶液中滴加冰乙酸，调节pH值至4.8-5.0，再加95%乙醇，使乙醇浓度为50%，搅拌混合均匀，置温度8-12℃条件下保存。
3.2二次抽提
次日虹吸除去上清液，下层沉淀离心收集，合并离心渣，每1kg离心渣干粉加二次抽提液30L，在溶液温度8-12℃条件下搅拌1小时，离心取上清液。
4. 乙醇沉淀
4.1次日虹吸上清液，离心，每1kg离心渣干粉加二次抽提液15L，在溶液温度8-12℃条件下搅拌1小时，离心取上清液。
4.2合并二次上清液，按1L：(2L-3L)比例加 -20℃以下95%乙醇，边搅边加，并继续搅拌30分钟，在温度8-12℃条件下静置过夜。
5.脱水、干燥
次日虹吸除去上清液，下层沉淀离心收集，沉淀物再用丙酮或无水乙醇脱水，置六罐离心机中离心，弃去上清液，沉淀物置用五氧化二磷或无水氯化钙作干燥剂的真空干燥箱中真空干操，干燥后的即为绒促性素。
经检测，绒促性素效价约为600iu/mg。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：
将效价约10 iu/mg绒促性素粗品中加入抽提液溶解，不同条件下反复抽提，然后乙醇沉淀、脱水、干燥，所得绒促性素效价约600 iu/mg，稳定性大幅度提高。
具体实施方式
实施例1
1.抽提
1.1抽提液的配制：
称取乙酸钠1.36kg、无水氯化钙0.166kg、氯化钠2.92kg，加入纯化水溶解并稀释至100L；然后向该溶液中滴加冰乙酸，调节pH值至5.0，再加95%乙醇，使乙醇浓度为50%，搅拌混合均匀，置温度9℃条件下保存。
1.2 抽提：
将1kg效价为11iu/mg绒促性素粗制品慢慢加到抽提液20L，在溶液温度9℃条件下搅拌5小时，静置过夜。
2.乙醇沉淀
2.1次日虹吸上清液，离心，每1kg离心渣干粉加抽提液3.3L，在溶液温度8-12℃条件下搅拌1小时，离心取上清液。
2.2合并二次上清液，按1：2.6比例加 -20℃的95%乙醇，边搅边加，并继续搅拌30分钟，在温度9℃条件下静置过夜。
3.二次抽提
3.1二次抽提液的配制：
称取乙酸钠1.36kg，加入纯化水溶解并稀释至100L；然后向该溶液中滴加冰乙酸，调节pH值至4.8，再加95%乙醇，使乙醇浓度为50%，搅拌混合均匀，置温度9℃条件下保存。
3.2二次抽提
次日虹吸除去上清液，下层沉淀离心收集，合并离心渣，每1kg离心渣干粉加二次抽提液30L，在溶液温度9℃条件下搅拌1小时，离心取上清液。
4. 乙醇沉淀
4.1次日虹吸上清液，离心，每1kg离心渣干粉加二次抽提液15L，在溶液温度9℃条件下搅拌1小时，离心取上清液。
4.2合并二次上清液，按1：2.6比例加 -20℃的95%乙醇，边搅边加，并继续搅拌30分钟，在温度9℃条件下静置过夜。。
5.脱水、干燥
次日虹吸除去上清液，下层沉淀离心收集，沉淀物再用丙酮脱水，置六罐离心机中离心，弃去上清液，沉淀物置用五氧化二磷作干燥剂的真空干燥箱中真空干操，干燥后的即为绒促性素。
经检测，绒促性素效价为612 iu/mg。
实施例2
1.抽提
1.1抽提液的配制：
称取乙酸钠1.36kg、无水氯化钙0.166kg、氯化钠2.92kg，加入纯化水溶解并稀释至100L；然后向该溶液中滴加冰乙酸，调节pH值至5.2，再加95%乙醇，使乙醇浓度为50%，搅拌混合均匀，置温度10℃条件下保存。
1.2 抽提：
将1kg效价为9iu/mg绒促性素粗制品慢慢加到抽提液22L，在溶液温度10℃条件下搅拌5小时，静置过夜。
2.乙醇沉淀
2.1次日虹吸上清液，离心，每1kg离心渣干粉加抽提液3.3L，在溶液温度10℃条件下搅拌1小时，离心取上清液。
2.2合并二次上清液，按1L：2.2L比例加 -20.5℃的95%乙醇，边搅边加，并继续搅拌30分钟，在温度10℃条件下静置过夜。
3.二次抽提
3.1二次抽提液的配制：
称取乙酸钠1.36kg，加入纯化水溶解并稀释至100L；然后向该溶液中滴加冰乙酸，调节pH值至5.0，再加95%乙醇，使乙醇浓度为50%，搅拌混合均匀，置温度10℃条件下保存。
3.2二次抽提
次日虹吸除去上清液，下层沉淀离心收集，合并离心渣，每1kg离心渣干粉加二次抽提液30L，在溶液温度10℃条件下搅拌1小时，离心取上清液。
4. 乙醇沉淀
4.1次日虹吸上清液，离心，每1kg离心渣干粉加二次抽提液15L，在溶液温度10℃条件下搅拌1小时，离心取上清液。
4.2合并二次上清液，按1L：2.2L比例加 -20.5℃的95%乙醇，边搅边加，并继续搅拌30分钟，在温度10℃条件下静置过夜。
5.脱水、干燥
次日虹吸除去上清液，下层沉淀离心收集，沉淀物再用无水乙醇脱水，置六罐离心机中离心，弃去上清液，沉淀物置用无水氯化钙作干燥剂的真空干燥箱中真空干操，干燥后的即为绒促性素。
经检测，绒促性素效价为633 iu/mg。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (9)
1.一种提高绒促性素稳定性的方法，其特征在于：将效价约10 iu/mg绒促性素粗品中加入抽提液溶解，不同条件下反复抽提，然后乙醇沉淀、脱水、干燥，所得绒促性素效价约600 iu/mg。
2.如权利要求1所述的提高绒促性素稳定性的方法，其特征在于所述盐溶醇沉法包括如下步骤：
（1）配制抽提液;
（2）抽提液溶解绒促性素粗品;
（3）虹吸，离心;
（4）乙醇沉淀;
（5）配制二次抽提液;
（6）虹吸，离心;
（7）乙醇沉淀;
（8）虹吸，离心，脱水，干燥。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所用抽提液配制方法为分别称取乙酸钠13.6g、无水氯化钙1.66g、氯化钠29.2g，加入纯化水溶解并稀释至1L；然后向该溶液中滴加冰乙酸，调节pH值至5.0-5.2，再加95%乙醇，使乙醇浓度为50%。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所用二次抽提液配制方法为分别称取乙酸钠13.6g，加入纯化水溶解并稀释至1L；然后向该溶液中滴加冰乙酸，调节pH值至4.8-5.0，再加95%乙醇，使乙醇浓度为50%。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于操作温度均为8-12℃。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于抽提液溶解绒促性素粗品，重量体积比为1kg：（15L-25L）。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于乙醇沉淀时离心上清液与95%乙醇体积比为1L：（2L-3L）。
8.如权利要求2所述的方法，其特征在于所用脱水剂为丙酮或无水乙醇。
9.如权利要求2所述的方法，其特征在于所用干燥剂为五氧化二磷或无水氯化钙。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN112870337A (zh) * | 2021-01-26 | 2021-06-01 | 浙江科瑞特生物科技有限公司 | 一种血促性素和绒促性素复合激素冻干粉及其制备方法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20170426 |
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |