CN104487093B - 经由不含铜的环加成的基于peg的水凝胶的应变促进的交联 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含8‑元环炔官能化聚亚烷基二醇和多臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物的应变促进的反应产物的共价交联的水凝胶以及用于制备其的方法。因为可处理所述前体物质而不会引起交联,条件是不会达到所述应变阈值,这些水凝胶允许交联发生时(处)的机械控制并且比先前的应变‑激活或温度‑激活系统更易于使用。这些新型水凝胶不需要催化剂进行交联,从而避免许多催化剂常见的所述生物相容性问题。所述交联过程也不受是否存在催化剂或其它物质的影响,其已经在已知的应变诱导水凝胶中干扰交联。由于其交联反应动力学,这些新型水凝胶可包封并输送高度敏感的细胞和其它生物添加剂且不含已知的毒性副产物。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年7月3日提交的标题为“Strain-Promoted Crosslinking ofPEG-based Hydrogels via Copper-Free Cycloaddition”的美国临时专利申请序列号61/677,683的权益,并且通过引用整体并入。
政府支持的参考
本发明至少部分在美国国立卫生研究院授权号MLB,P41EB0063536的支持下研发。政府可以对本发明具有某些权利。
技术领域
本发明在应变促进的、共价交联的水凝胶的领域内并且涉及包含8-元环炔官能化聚亚烷基二醇和多臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物(glycerol exytholate triazide)的应变促进的反应产物的共价交联的水凝胶以及用于其制备的方法。
背景技术
聚合物水凝胶为本领域熟知的并且可被定义为由聚合物链的三维网络和填充大分子之间的空间的水组成的双组分或多组分系统。水凝胶为不溶于水的聚合物链的网络,有时以胶态凝胶被发现,其中水在分散介质中。水凝胶为具有超强吸收能力的(它们可含有超过99%的水)天然或合成聚合物。由于其显著的水含量,水凝胶还具有与天然组织非常相似的柔韧度。
水凝胶通常用于软性隐形眼镜、伤口敷料、药物递送系统、超强吸收剂、许多医学和再生医学应用。取决于使用的聚合物(多个聚合物)的性质,以及网络节点的性质和密度,平衡中的此类结构可含有各种量的水;通常水凝胶中处于溶胀状态的水的质量分数比聚合物的质量分数高得多。
已经定义了两种一般类别的水凝胶。第一为物理水凝胶,其中链通过静电力、氢键、疏水作用或链缠结(此类凝胶为非永久性的并且通常通过加热它们可被转化成聚合物溶液)连接。可使用多种环境触发剂(pH、温度、离子强度)和多种物理化学相互作用(疏水作用、电荷凝聚、氢键或超分子相互作用)实现聚合物链的物理交联。在物理交联的水凝胶中可逆交联点的存在允许溶剂浇铸和/或热处理。然而,物理交联的水凝胶的主要缺点为其在溶胀状态时的弱的机械性能以及可被触发以形成生理学相关状况的材料的范围极其有限。
第二类别的水凝胶为化学水凝胶,其通常具有连接链的共价键。化学方法包括各种点击反应、硫醇烯加成、金属催化的叠氮化物-炔烃环加成、迈克尔加成(Michaeladdition)和狄尔斯–阿尔德反应(Diels-Alder reaction)。由于其高度有效的转化、正交性和生物友好特性,已经将不含金属的、应变促进的叠氮化物-炔烃“点击”环加成反应应用于细胞成像以及水凝胶系统。凝胶形成过程为原子中性的,因为不存在污染系统和能够对相关生物系统造成毒性问题的残余物。
在这些系统中开始凝胶形成通常依赖于起始来自单体前体的网络形成的化学或光化学过程。生物相容性起始系统(诸如化学催化剂、热和/或紫外(UV)光)的使用和残留金属催化剂、有机溶剂的存在以及官能团的不完全转化经常导致与这些系统的生物相容性问题。这些凝胶化和官能化策略中的每一种的实验需求对各自水凝胶的实用性和通用性有明显的限制并且使得直接的临床转化为困难的或不可能的。
最近,已经发现原位形成的注射用水凝胶有另外的希望,因为相对于预成型的水凝胶它们能适应复杂的缺陷位置。在这些系统中,注射含有水凝胶的组成单体的一种或多种溶液或以其它方式将其递送至使用水凝胶并起始交联的位点。这些系统的常见问题为交联聚合物网络所需的基于光化学、热、UV光和或化学催化剂的引发剂经常生物相容性不大并且对敏感的细胞类型不起作用。而且,交联反应的所有副产物也必须为生物相容的并且残留金属催化剂、有机溶剂以及官能团的不完全转化经常导致与这些系统的生物相容性问题。
也已经开发由物理应变起始的原位形成水凝胶。然而,许多这些系统在存在明胶、胶原、脂质、碳水化合物或聚合物纳米纤维的情况下将不会交联,这显著限制其有效性。
因此,本领域需要的是这样的水凝胶,其能够原位(和体内)形成,不含有毒的副产物,允许交联发生时(和发生处)的机械控制,比基于热的系统更易于使用并且将在存在明胶、胶原、脂质、碳水化合物或聚合物纳米纤维的情况下交联。
发明内容
本发明涉及包含8-元环炔官能化聚亚烷基二醇和多臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物的应变促进的反应产物的共价交联的水凝胶。本发明的共价交联的水凝胶允许交联将发生时(处)的机械控制并且比应变-激活或温度-激活系统更易于使用。
可处理前体物质而不引起交联,只要不会达到所述应变阈值。水凝胶不需要催化剂交联,从而避免许多催化剂常见的生物相容性问题。所述交联过程也不受是否存在催化剂或其它物质的影响,其可在已知的应变诱导水凝胶中干扰交联。前体物质基本上为正交的并且将在存在明胶、胶原、脂质、碳水化合物或聚合物纳米纤维的情况下交联。由于其交联反应动力学,本发明的水凝胶可包封并输送高度敏感的细胞和其它生物添加剂。而且,本发明的水凝胶不含已知的毒性副产物。
而且,共价交联的水凝胶为通用的并且为生物相容的因为它们基于不含金属的、应变促进的叠氮化物-炔烃环加成。交联不需要光、引发剂和催化剂。不需要对敏感蛋白、肽或细胞有害的任何物质。
本发明还包括用于将细胞和其它敏感生物材料包封在水凝胶内的有效方法,其中胶凝化基于应变的环辛炔单元(cyclocotyne unit)和叠氮化物封端的PEG链之间的特定分子识别相互作用的累积效应。各自组分的分子质量的潜在变化性、分支单元的数目以及与hMSC和细胞培养基的相容性在应用中提供通用性,其中注射器可注射的材料或水凝胶的原位形成是必需的。
在一些实施方案中,本发明涉及包含8-元环炔官能化聚亚烷基二醇和多臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物的应变促进的反应产物的共价交联的水凝胶。在一些实施方案中,本发明的共价交联的水凝胶可以包括上文描述的实施方案,其中8-元环炔官能化聚亚烷基二醇为选自以下的聚合物:聚乙二醇,聚丙二醇及其组合。在一些实施方案中,本发明的共价交联的水凝胶可以包含上文描述的任一实施方案,其中所述8-元环炔官能化聚亚烷基二醇的分子质量为约500Da至约12000Da。
在一些实施方案中,本发明的共价交联的水凝胶可以包含上文描述的任一实施方案,其中所述8-元环炔官能化聚亚烷基二醇为二苄基环辛炔官能化聚乙二醇。
在一些实施方案中,本发明的共价交联的水凝胶可以包含上文描述的任一实施方案,其中所述8-元环炔官能化聚亚烷基二醇为包含约1%至约40%重量百分比的二苄基环辛炔官能化聚乙二醇的水溶液。在一些实施方案中,本发明的共价交联的水凝胶可以包含上文描述的任一实施方案,其中所述8-元环炔官能化聚亚烷基二醇为包含约11重量百分比的二苄基环辛炔官能化聚乙二醇的水溶液。
在一些实施方案中,本发明的共价交联的水凝胶可以包含上文描述的任一实施方案,其中所述多臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物为具有2至5个臂的聚氧乙基甘油醚三叠氮化物。在一些实施方案中,本发明的共价交联的水凝胶可以包含上文描述的任一实施方案,其中所述多臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物为3-臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物。
在一些实施方案中,本发明的共价交联的水凝胶可以包含上文描述的任一实施方案,其中所述多臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物为包含约1%至约40%重量百分比的3-臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物的水溶液。在一些实施方案中,本发明的共价交联的水凝胶可以包含上文描述的任一实施方案,其中所述多臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物为包含约3%重量百分比的3-臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物的水溶液。
在一些实施方案中,本发明的共价交联的水凝胶可以包含上文描述的任一实施方案,其中所述共价交联的水凝胶通过所述二苄基环辛炔官能化聚乙二醇和所述多臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物的应变促进的环加成形成。在一些实施方案中,本发明的共价交联的水凝胶可以包含上文描述的任一实施方案,其中所述共价交联的水凝胶通过所述8-元环炔官能化聚亚烷基二醇和所述3-臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物的应变促进的环加成形成。在一些实施方案中,本发明的共价交联的水凝胶可以包含上文描述的任一实施方案,其中所述共价交联的水凝胶通过二苄基环辛炔官能化聚乙二醇和3-臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物的应变促进的环加成形成。在一些实施方案中,本发明的共价交联的水凝胶可以包含上文描述的任一实施方案,其中所述二苄基环辛炔官能化聚乙二醇的质量平均分子量为约1,000至约20,000。
在一些实施方案中,本发明的共价交联的水凝胶可以包括上文描述的任一实施方案,其中共价交联的水凝胶的交联密度为约2至约300mol/m3。在一些实施方案中,本发明的共价交联的水凝胶可以包括上文描述的任一实施方案,其中共价交联的水凝胶的交联密度为约8.6mol/m3。
在一些实施方案中,本发明的共价交联的水凝胶可以包括上文描述的任一实施方案,其中共价交联的水凝胶的损耗因数(tanδ)为约0.10至约0.50。在一些实施方案中,本发明的共价交联的水凝胶可以包括上文描述的任一实施方案,其中共价交联的水凝胶的损耗因数(tanδ)为约0.25。
在一些实施方案中,本发明的共价交联的水凝胶可以包括上文描述的还包含选自细胞、胶原、脱细胞组织、明胶及其组合的添加剂的任一实施方案。在一些实施方案中,本发明的共价交联的水凝胶可以包含上文描述的任一实施方案,其中所述添加剂用所述共价交联的水凝胶包封。在一些实施方案中,本发明的共价交联的水凝胶可以包含上文描述的任一实施方案,其中所述添加剂为人间充质干细胞。
在一些实施方案中,本发明的共价交联的水凝胶可以包含上文描述的任一实施方案,其中所述共价交联的水凝胶为约40%至约99.9%的水。在一些实施方案中,本发明的共价交联的水凝胶可以包含上文描述的任一实施方案,其中所述共价交联的水凝胶为约96.1%的水。
在一些实施方案中,本发明的共价交联的水凝胶可以包含上文描述的任一实施方案,其中所述二苄基环辛炔官能化聚乙二醇具有下式:
其中n为约60至约300的整数。在一些实施方案中,n为6或7。
在一些实施方案中,本发明的共价交联的水凝胶可以包含上文描述的任一实施方案,其中所述3-臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物具有下式:
其中n为约8至约30的整数。
在一些实施方案中,本发明的共价交联的水凝胶可以包括上文描述的具有下式的任一实施方案:
其中n为约8至约30的整数。
在其它方面,本发明涉及制备共价交联的水凝胶的方法,包括:(a)制备含有8-元环炔官能化聚亚烷基二醇的水溶液;(b)制备含有多臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物的水溶液;以及(c)将步骤(a)的溶液与步骤(b)的溶液组合;以及(d)将应变应用至步骤(c)的混合物直至所述8-元环炔官能化聚亚烷基二醇和所述多臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物之间形成共价交联。
在一些实施方案中,制备本发明的共价交联的水凝胶的方法可以包括上文描述的任一实施方案,其中所述8-元环炔官能化聚亚烷基二醇为选自聚乙二醇、聚丙二醇及其组合的聚合物。在一些实施方案中,制备本发明的共价交联的水凝胶的方法可以包括上文描述的任一实施方案,其中所述8-元环炔官能化聚亚烷基二醇为聚乙二醇。在一些实施方案中,制备本发明的共价交联的水凝胶的方法可以包括上文描述的任一实施方案,其中所述8-元环炔官能化聚亚烷基二醇为二苄基环辛炔官能化聚乙二醇。
在一些实施方案中,制备本发明的共价交联的水凝胶的方法可以包括上文描述的任一实施方案,其中步骤(a)的水溶液含有约1%至约40%重量百分比的所述8-元环炔官能化聚亚烷基二醇。在一些实施方案中,制备本发明的共价交联的水凝胶的方法可以包括上文描述的任一实施方案,其中步骤(a)的水溶液含有约11重量百分比的所述8-元环炔官能化聚亚烷基二醇。
在一些实施方案中,制备本发明的共价交联的水凝胶的方法可以包括上文描述的任一实施方案,其中所述多臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物为具有2至5个臂的聚氧乙基甘油醚三叠氮化物。在一些实施方案中,制备本发明的共价交联的水凝胶的方法可以包括上文描述的任一实施方案,其中所述多臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物为3-臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物。
在一些实施方案中,制备本发明的共价交联的水凝胶的方法可以包括上文描述的任一实施方案,其中步骤(b)的水溶液含有约1%至约40%重量百分比的所述多臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物。根据权利要求29所述的方法,其中步骤(b)的水溶液含有约3%重量百分比的所述多臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物。
在一些实施方案中,制备本发明的共价交联的水凝胶的方法可以包括上文描述的任一实施方案,其中所述二苄基环辛炔官能化聚乙二醇的质量平均分子量为约1,000至约20,000。
在一些实施方案中,制备本发明的共价交联的水凝胶的方法可以包括上文描述的还包括在步骤(d)之前将步骤C的混合物引入活有机体的步骤的任一实施方案。在一些实施方案中,制备本发明的共价交联的水凝胶的方法可以包括上文描述的任一实施方案,其中步骤(d)的混合物通过注射被引入活有机体。在一些实施方案中,制备本发明的共价交联的水凝胶的方法可以包括上文描述的任一实施方案,其中骤D在体内发生。
在一些实施方案中,制备本发明的共价交联的水凝胶的方法可以包括上文描述的任一实施方案,其中步骤(c)的混合物为粘性液体。在一些实施方案中,制备本发明的共价交联的水凝胶的方法可以包括上文描述的任一实施方案,其中步骤(c)的混合物的损耗因数(tanδ)大于或等于约1.0。在一些实施方案中,制备本发明的共价交联的水凝胶的方法可以包括上文描述的任一实施方案,其中步骤(c)的混合物的损耗因数(tanδ)为约1.0。
在一些实施方案中,制备本发明的共价交联的水凝胶的方法可以包括上文描述的还包括将选自细胞、胶原、脱细胞组织、明胶及其组合的添加剂加入至步骤(a)的水溶液、步骤(b)的水溶液或步骤(c)的混合物中的一种或多种的步骤的任一实施方案。在一些实施方案中,制备本发明的共价交联的水凝胶的方法可以包括上文描述的任一实施方案,其中所述添加剂用所述共价交联的水凝胶包封。在一些实施方案中,制备本发明的共价交联的水凝胶的方法可以包括上文描述的任一实施方案,其中所述添加剂为人间充质干细胞。
在一些实施方案中,制备本发明的共价交联的水凝胶的方法可以包括上文描述的任一实施方案,其中步骤(d)中应用的应变为约5%至约15%的振荡剪切应变。
附图说明
为了更完整地理解本发明的特征和优点,现参考本发明的详述连同附图,其中:
图1为根据本发明的至少一个实施方案制备的使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF)采集的DIBO-PEG(用NaTFA阳离子化)的质谱。单一同位素的质量-电荷比(m/z)标记在上频谱(upper spectrum)。测量的m/z值与预期结构一致。
图2为根据本发明的至少一个实施方案制备的聚氧乙基甘油醚三叠氮化物(用NaTFA阳离子化)的MALDI-TOF质谱。单一同位素的质量-电荷比(m/z)标记在上频谱。测量的m/z值与预期结构一致。
图3为根据本发明的至少一个实施方案在振荡剪切过程期间示出水凝胶的模量-时间依赖性的图。
图4A和4B为2,3:6,7-二苯并-9-氧杂双环[3.3.1]壬-2,6-二烯(vi)的1H NMR和13CNMR谱。
图5A和5B为3-羟基-2',3',2",3"-四甲氧基,-2:5,6-二苯并环辛-1,5,7-三烯(vii)的1H NMR和13C NMR谱。
图6A和6B为11,12-二溴-5,6,ll,12-四氢-二苯并[a,e]环辛烯-5-醇(viii)的1HNMR和13C NMR谱。
图7A和7B为5,6-二氢-11,12-二脱氢-二苯并[a,e]环辛烯-5-醇(ix)的1H NMR和13C NMR谱。
图8A和8B为碳酸,5,6-(二氢-11,12-二脱氢-二苯并[a,e]环辛烯-5-基酯,4-硝基苯基酯(x)的1HNMR和13CNMR谱。
图9为根据本发明的至少一个实施方案制备的DIBO-PEG的1HNMR谱。
图10为根据本发明的至少一个实施方案制备的聚氧乙基甘油醚三叠氮化物的1HNMR谱。
图11为根据本发明的至少一个实施方案制得的验证叠氮化物损失(2095cm-1)的冷冻干燥水凝胶的FTIR-ATR谱。
具体实施方式
在概要中,本发明涉及经由8-元环炔官能化聚亚烷基二醇和多臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物之间的应变促进的环加成叠氮化物-炔烃“点击”反应形成的共价交联的水凝胶以及用于制备其的方法。这些不含金属的、应变促进的叠氮化物-炔烃“点击”环加成反应已经被应用于细胞成像以及水凝胶系统由于它们高度有效的转化、正交性和生物友好的特征。本发明还包括将细胞和其它敏感的生物材料包封在水凝胶内的有效方法,其中胶凝化基于应变的环辛炔单元和叠氮化物封端的PEG链之间的特定分子识别相互作用的累积效应。各自组分的分子质量的潜在变化性、分支单元的数目以及与hMSC和细胞培养基的相容性为注射器可注射的(体内)和原位水凝胶应用提供通用性。
水凝胶的8-元环炔官能化聚亚烷基二醇组分包含发生连接至聚亚烷基二醇骨架的叠氮化物-炔烃“点击”环加成反应所需的两个或更多个炔端基。聚亚烷基二醇骨架可以为聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇或其组合。在一些实施方案中,聚亚烷基二醇可以为PEG。
如上示出,聚亚烷基二醇组分具有一个或多个8-元环炔端基,它与多臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物组分上的叠氮化物端基反应以形成共价交联的水凝胶。可以使用能够被官能化至聚亚烷基二醇的任何8-元环炔,条件是其辅助基团不会干扰叠氮化物-炔烃“点击”环加成反应或不会与干扰叠氮化物-炔烃“点击”环加成反应的任何其它物质键合。合适的8-元环炔端基可以包括但不限于4-二苯并环辛炔醇(DIBO)。在一些实施方案中,8-元环炔可以为4-二苯并环辛炔醇(DIBO)。
8-元环炔官能化聚亚烷基二醇的分子质量可以为约500Da至约12000Da。在一些实施方案中,8-元环炔官能化聚亚烷基二醇的分子质量可以为约500Da至约2,000Da。在一些实施方案中,8-元环炔官能化聚亚烷基二醇的分子质量可以为约2,001Da至约4,000Da。在一些实施方案中,8-元环炔官能化聚亚烷基二醇的分子质量可以为约4,001Da至约8,000Da。在一些实施方案中,8-元环炔官能化聚亚烷基二醇的分子质量可以为约8,001Da至约10,000Da。在一些实施方案中,8-元环炔官能化聚亚烷基二醇的分子质量可以为约10,001Da至约12,000Da。
8-元环炔官能化聚亚烷基二醇可以具有约6至约300个亚烷基二醇单元。在一些实施方案中,8-元环炔官能化聚亚烷基二醇可以具有约6至约10个亚烷基二醇单元。在一些实施方案中,8-元环炔官能化聚亚烷基二醇可以具有约11至约50个亚烷基二醇单元。在一些实施方案中,8-元环炔官能化聚亚烷基二醇可以具有约51至约100个亚烷基二醇单元。在一些实施方案中,8-元环炔官能化聚亚烷基二醇可以具有约101至约150个亚烷基二醇单元。在一些实施方案中,8-元环炔官能化聚亚烷基二醇可以具有约151至约200个亚烷基二醇单元。在一些实施方案中,8-元环炔官能化聚亚烷基二醇可以具有约201至约250个亚烷基二醇单元。在一些实施方案中,8-元环炔官能化聚亚烷基二醇可以具有约251至约300个亚烷基二醇单元。
如本领域技术人员显而易见的是,8-元环炔官能化聚亚烷基二醇组分将存在于水溶液。水凝胶的8-元环炔官能化聚亚烷基二醇组分在水溶液中的浓度可以为约1%至约40%。在一些实施方案中,水凝胶的8-元环炔官能化聚亚烷基二醇组分在水溶液中的浓度可以为约10%至约15%。在一些实施方案中,8-元环炔官能化聚亚烷基二醇为包含约1%至约40%重量百分比的二苄基环辛炔官能化聚乙二醇的水溶液。在一些实施方案中,8-元环炔官能化聚亚烷基二醇为包含约10%至约15%重量百分比的二苄基环辛炔官能化聚乙二醇的水溶液。在一些实施方案中,8-元环炔官能化聚亚烷基二醇为包含约11重量百分比的二苄基环辛炔官能化聚乙二醇的水溶液。
在一些实施方案中,含有水凝胶的8-元环炔官能化聚亚烷基二醇组分的水溶液还包含添加剂,其可以被掺入至水凝胶并被水凝胶包封。合适的添加剂包括但不限于细胞、胶原、脱细胞组织、明胶、蛋白质、细胞培养基、血清白蛋白、病毒、药物化合物、酶、DNA、RNA、干扰RNA、其它小的生物制剂及其组合。在一些实施方案中,添加剂被包封在所述共价交联的水凝胶内。
在一些实施方案中,为4-二苯并环辛炔醇(DIBO)官能化聚(乙二醇)(PEG)聚合物。在一些实施方案中,水凝胶的8-元环炔官能化聚亚烷基二醇组分可以为二苄基环辛炔聚乙二醇。在一些实施方案中,8-元环炔官能化聚亚烷基二醇具有式(i)的结构。
其中n为约6至约300的整数。在一些实施方案中,n为6或7。在一些实施方案中,n为约6至约10的整数。在一些实施方案中,n为约11至约100的整数。在一些实施方案中,n为约101至约200的整数。在一些实施方案中,n为约201至约300的整数。
水凝胶的多臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物组分具有多个叠氮化物端基,其与在上文讨论的8-元环炔官能化聚亚烷基二醇组分的组分上的8-元环炔端基反应以形成共价交联的水凝胶。水凝胶的多臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物组分可以具有约2个至约5个叠氮化物端基,更优选约2个或3个叠氮化物端基。在一些实施方案中,水凝胶的多臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物组分为3-臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物。在一些实施方案中,水凝胶的多臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物组分为2-臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物。
多臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物的分子质量可以为约500Da至约2,000Da。在一些实施方案中,多臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物的分子质量可以为约500Da至约1,000Da。多臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物的分子质量可以为约1,000Da至约2,000Da。
叠氮化物端基经由聚氧乙基甘油醚骨架彼此连接,其可以为线性、支化或星型结构并且包含8至30个乙二醇单元组成的2至约5个臂。在一些实施方案中,每个叠氮化物封端的臂具有约8至约10个乙二醇单元。在一些实施方案中,每个叠氮化物封端的臂具有约11至约20个乙二醇单元。在一些实施方案中,每个叠氮化物封端的臂具有约21至约30个乙二醇单元。
如本领域技术人员显而易见的是,水凝胶的多臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物组分将存在于水溶液中。多臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物在水中的浓度可以为约1%至约40%。在一些实施方案中,多臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物为包含约1%至约40%重量百分比的3-臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物的水溶液。在一些实施方案中,多臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物为包含约1%至约10%重量百分比的3-臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物的水溶液。在一些实施方案中,多臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物为包含约11%至约20%重量百分比的3-臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物的水溶液。在一些实施方案中,多臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物为包含约21%至约30%重量百分比的3-臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物的水溶液。在一些实施方案中,多臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物为包含约31%至约40%重量百分比的3-臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物的水溶液。在一些实施方案中,多臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物为包含约3%重量百分比的3-臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物的水溶液。
在一些实施方案中,含有水凝胶的多臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物组分的水溶液还包含添加剂,其可以被掺入至水凝胶并被水凝胶包封。合适的添加剂包括但不限于细胞、胶原、脱细胞组织、明胶、蛋白质、细胞培养基、血清白蛋白、病毒、药物化合物、酶、DNA、RNA、干扰RNA、其它小的生物制剂及其组合。在一些实施方案中,添加剂用所述共价交联的水凝胶包封。
在一些实施方案中,水凝胶的多臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物组分可以为三臂PEG叠氮化物。在一些实施方案中,多臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物具有式(ii)的结构。
其中n为约8至约30的整数。在一些实施方案中,n为约8至约10。在一些实施方案中,n为约11至约20。在一些实施方案中,n为约21至约30。
在一些实施方案中,水凝胶的多臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物组分可以为双臂PEG叠氮化物。在一些实施方案中,多臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物具有式(iv)的结构。
其中n为约8至约30的整数。在一些实施方案中,n为约8至约10。在一些实施方案中,n为约11至约20。在一些实施方案中,n为约21至约30。
如上示出,本发明的水凝胶由上文讨论的8-元环炔官能化聚亚烷基二醇和多臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物经由应变促进的叠氮化物-炔烃“点击”环加成反应的共价交联组成。
已发现8-元环炔官能化聚亚烷基二醇组分和多臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物组分在水凝胶中的化学计量比率可能影响其物理性质。如果化学计量比率不精确,则网络中的交联效率将会下降。结果将为悬挂的链末端并降低机械性能。在一些实施方案中,比率可以为约1:1至约2:3。在一些实施方案中,比率可以为约1:1至约1:1.1。在一些实施方案中,比率可以为约1:1.1至约1:1.2。在一些实施方案中,比率可以为约1:1.2至约1:1.3。在一些实施方案中,比率可以为约1:1.4至约2:3。8-元环炔官能化聚亚烷基二醇组分和多臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物组分的化学计量比率为小于1:1,这将产生较低的交联度和较低的机械性能。
共价交联的水凝胶可以为约40%至约99.9%的水。在一些实施方案中,共价交联的水凝胶可以为约40%至约60%的水。在一些实施方案中,共价交联的水凝胶可以为约61%至约80%的水。在一些实施方案中,共价交联的水凝胶可以为约810%至约90%的水。在一些实施方案中,共价交联的水凝胶可以为约90%至约99.9%的水。在一些实施方案中,共价交联的水凝胶为约96.1%的水。
如本领域普通技术人员将了解,水凝胶的交联密度将取决于聚亚烷基和聚氧乙基甘油醚链的长度以及试剂混合物在溶液中的浓度。在一些实施方案中,水凝胶的交联密度为约2mol/m3至约300mol/m3。在一些实施方案中,水凝胶的交联密度为约10mol/m3至约200mol/m3。在一些实施方案中,水凝胶的交联密度为约5mol/m3至约10mol/m3。在一些实施方案中,水凝胶的交联密度为约8.6mol/m3。
聚合物的损耗因数(tanδ)将取决于在水凝胶中的交联度和前体体聚合物的分子量。在一些实施方案中,水凝胶的损耗因数(tanδ)可以为约0.10至约0.50。在一些实施方案中,水凝胶的损耗因数(tanδ)为约0.25。
在一些实施方案中,水凝胶具有式(iii)的结构:
其中n为约8至约30的整数。在一些实施方案中,n为约8至约10。在一些实施方案中,n为约11至约20。在一些实施方案中,n为约21至约30。
当它们交联时,8-元环炔官能化聚亚烷基二醇和多臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物形成网络。如应显而易见的是,该网络仅包含约1%至约40%的水凝胶,其余主要为水。因此,在该网络内部及周边存在大量空间,在其内可以通过水凝胶包埋和输送各种添加剂。除了诸如水凝胶的交联度和前体体聚合物的分子量的因素之外,这些空间的尺寸和取向将确定可以通过水凝胶包埋和输送的添加剂的尺寸并且将在本文广泛称为水凝胶的筛目尺寸。筛目尺寸主要为使用的组分的分子量和浓度的函数。
在一些实施方案中,水凝胶还包含一种或多种添加剂,其可以被掺入至水凝胶和/或被水凝胶包封。合适的添加剂包括但不限于细胞、胶原、脱细胞组织、明胶、蛋白质、细胞培养基、血清白蛋白、病毒、药物化合物、酶、DNA、RNA、干扰RNA、其它小的生物制剂及其组合。可以与特定水凝胶使用的添加剂将主要取决于水凝胶的筛目尺寸和添加剂的尺寸以及正靶向的特定应用。
本发明的8-元环炔官能化聚亚烷基二醇组分可以通过用于该目的的本领域已知的或未知的任何方法制备。在一些实施方案中,8-元环炔官能化聚亚烷基二醇为DIBO-官能化PEG聚合物并且可以由4-硝基苯基氯甲酸酯激活的4-二苯并环辛炔醇和聚(乙二醇)双胺合成。1H NMR和MALDI-TOF(图1)结果显示氨基完全转化成二苯并环辛炔醇。
浓度和化学计量控制对于实现完全转化是重要的。任一试剂的太多或太少将限制胶凝化程度并降低靶向的机械性能。
在一些实施方案中,8-元环炔官能化聚亚烷基二醇为DIBO-官能化PEG聚合物并且可以如下文示出合成。
在一些实施方案中,苯乙醛(v)与含三甲基碘硅烷的氯仿反应以形成产率为约30%的2,3:6,7-二苯并-9-氧杂双环[3.3.1]壬-2,6-二烯(vi)中间体。然后将2,3:6,7-二苯并-9-氧杂双环[3.3.1]壬-2,6-二烯(vi)溶解于THF并与正丁基锂反应。将反应用水猝灭并纯化产物以产生产率为约90%的3-羟基-2',3',2",3"-四甲氧基,-2:5,6-二苯并环辛-1,5,7-三烯(vii)中间体。
3-羟基-2',3',2",3"-四甲氧基,-2:5,6-二苯并环辛-1,5,7-三烯(vii)中间物然后与含溴的氯仿反应以产生产率为约60%的11,12-二溴-5,6,ll,12-四氢-二苯并[a,e]环辛烯-5-醇(viii)中间物。据信,约60%的产率显著多于已经报导的并且可能为将反应时间限制在大约30分钟的结果。已发现额外的反应时间导致降低的产率。
11,12-二溴-5,6,11,12-四氢-二苯并[a,e]环辛烯-5-醇(viii)中间物然后可以与含二异丙基氨基锂的THF反应产生产率为约50%的5,6-二氢-11,12-二脱氢-二苯并[a,e]环辛烯-5-醇(ix)中间物。5,6-二氢-11,12-二脱氢-二苯并[a,e]环辛烯-5-醇(ix)中间物然后可以与4-硝基苯基氯甲酸酯和吡啶反应以产生碳酸,5,6-(二氢-11,12-二脱氢-二苯并[a,e]环辛烯-5-基酯,4-硝基苯基酯(x)中间物。最后,碳酸,5,6-(二氢-11,12-二脱氢-二苯并[a,e]环辛烯-5-基酯,4-硝基苯基酯(x)中间物可以与聚乙二醇双胺(xi)反应以用于二苄基环辛炔聚乙二醇(i)。
本发明的多臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物组分可以通过用于该目的的本领域已知的或未知的任何方法制备。在一些实施方案中,多臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物可以使用聚氧乙基甘油醚作为原料合成。然后用甲基磺酰氯衍生化羟基并使用叠氮化钠于两步方法中进一步取代。所需产物然后可以通过柱色谱法纯化并用1H NMR和MALDI-TOF证明。参见图2。
在概要中,本发明的水凝胶可以如下制备。分别制备上文讨论的含水8-元环炔官能化聚亚烷基二醇和含水多臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物溶液并组合以形成粘性液体。在交联之前,两种前体溶液的混合物的损耗因数(tanδ)将大于或等于约1.0,并且优选为约1.0,其为典型的粘性液体。然后将应变应用至混合物,使其交联以形成水凝胶。一旦交联,水凝胶的损耗因数(tanδ)可以为约0.10至约0.50,这对粘弹固体是典型的。在一些实施方案中,水凝胶的损耗因数(tanδ)为约0.25。参见图3。
在一些实施方案中,水凝胶交联如下文示出:
如上示出,交联反应为诱导的应变。据信应变提供足够的能量以起始反应。可以混合前体化合物并且直至应用至混合物的应变达到应变点时才进行交联。如本文所用,应变点是指反应组分开始交联必需的应变量。如本领域普通技术人员将认识到,这将在如图3示出的水凝胶的损耗模量(G″)等于水凝胶的储存模量(G')的点处发生。
合适的应变类型包括但不限于振荡剪切应变和线性剪切应变。在一些实施方案中,应用的应变可以为约5%至约15%的振荡剪切应变。在一些实施方案中,应用的应变可以为约10%至约15%的振荡剪切应变。在一些实施方案中,应用的应变可以为10%的振荡剪切应变。
在确定用于给定应用的适当应变中,除了反应混合物的应变点之外,应考虑若干因素。首先,应考虑被包封至水凝胶的任何添加剂的性质。如果应变率或幅度太高,则可能损害或破坏敏感细胞和其它生物材料。第二,已发现网络形成的速率可受到线性剪切应变的量的振荡剪切应变的速率和幅度的影响。如果应变的速率和/或幅度太高,则交联可能在例如将水凝胶施用至专利的注射器内过早地发生。
如本领域技术人员将理解的,交联反应的速度也可以是温度依赖的。通常并且所有其它因素均相等的情况下,点击反应的速度将随着温度增加。本方法的一个优势为,对于大多数实施方案来说,反应可在室温以及人和大多数恒温动物中发生。重要的是反应温度不应太高以致损害包封至水凝胶的任何细胞或其它敏感的添加剂并且据信约15℃至约43℃的这些温度对于大多数添加剂为安全的。还应认识到高温将加剧上文讨论的过早交联问题。
在一些实施方案中,交联温度为约15℃至约43℃。在一些实施方案中,交联温度为约20℃至约42℃。在一些实施方案中,交联温度为约23℃至约37℃。在一些实施方案中,交联温度为约23℃至约25℃。在一些实施方案中,交联温度为约37℃至约42℃。
在一些实施方案中,可以将水凝胶组分注入受试者并在体内交联。在一些实施方案中,将含水8-元环炔官能化聚亚烷基二醇和含水多臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物溶液在标准注射器中组合并注入受试者。在一些实施方案中,可以使用在分隔室中具有含水8-元环炔官能化聚亚烷基二醇和含水多臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物溶液的双室注射器。在这些实施方案中,当其注入受试者时组合溶液。注射提供足够的应变以起始交联反应并且水凝胶在体内形成。
在一些实施方案中,本发明的方法可以包括将添加剂包埋和/或包封在水凝胶内。如上示出,合适的添加剂包括但不限于细胞、胶原、脱细胞组织、明胶、蛋白质、细胞培养基、血清白蛋白、病毒、药物化合物、酶、DNA、RNA、干扰RNA、其它小的生物制剂及其组合。可以在交联之前任何时间将添加剂加入至任一前体溶液,但是应在两种前体溶液混合之前加入以防止加入添加剂引发交联反应。如上示出,可以与特定水凝胶使用的特定添加剂将主要取决于水凝胶的筛目尺寸和添加剂的尺寸。
当用作组织工程中的支架时,本发明的水凝胶可以含有人细胞以便修复组织。新型水凝胶的一些环境敏感性实施方案可以具有感知pH、温度或代谢物浓度的变化以及由于此类变化释放其负载的能力。作为用于烧伤或其它难以愈合的伤口的敷料,这些水凝胶可能对助于产生或保持伤口环境是极好的。可以将响应于特定分子,诸如葡萄糖或抗原的水凝胶用作生物传感器以及用于药物递送系统中。
本发明的水凝胶也可以用作典型药物递送中的储库,特别用于离子药物的递送。如上示出,由于化学反应的性质可精确地控制机械性能并且在溶液中不存在释放的残余分子。释放速率可为通过修改确定筛目尺寸的单独组分的分子质量的变化。由于交联化学的性质,筛目尺寸和所得输送性质可以相对于根本上起始交联的凝胶或物理交联的凝胶为严格控制的和高度可再生的。
已经将本发明的各方面在本文描述为从第一端点值至第二端点值的范围。应理解第一端点值和第二端点值旨在包括在公开范围内。
鉴于上述,应理解本发明通过提供以多种方式在结构上和功能上改善的共价交联的水凝胶显著推进本领域。尽管本发明的特定实施方案已经在本文详细公开,但是应理解本发明不限于其或此,因为本文本发明的变化将由本领域普通技术人员容易地理解。本发明的范围将由随后的权利要求理解。
实施例
提供以下实施例以更充分地阐释本发明,但是不应解释为限制其范围。此外,尽管一些实施例可以包括关于本发明可以发挥作用的方式的结论,但是发明人并非意图受那些结论的束缚,而是仅将其提出为可能的解释。而且,除非通过使用过去式显示,否则呈现的实施例并不暗示进行实验或程序或未进行实验或程序或实际获得该结果或未实际获得该结果。已经进行努力以确保相对于使用的数字(如,量、温度)的准确度,但是可能存在一些实验误差和偏差。除非另外指明,否则份为重量份,分子量为重均分子量,温度按摄氏度数计,且压力为在大气压下或接近大气压。
一般方法和材料
除非另有说明,否则化学品和溶剂购自Sigma-Aldrich和Acros并且不经进一步纯化即使用。所有反应在氩气气氛下于无水条件下进行。在硅胶(Sorbent TechnologiesInc.,70-230目)上进行快速色谱法。使用Varian NMRS500和Varian NMRS 300获得'H和l3CNMR谱。使用FTIR-ATR MIRacle 10SHIMADZU光谱仪获得FTIR谱。
在Waters Synapt HDMS四极/飞行时间(Q/ToF)仪器上进行ESI MS。通过将样品溶解于含有1%NaTFA(1mg/mL于甲醇中)溶液的氯仿/甲醇(1/1)制备喷雾溶液。选择以下ESI参数:ESI毛细管电压,3.5kV;样品锥电压,35V;萃取锥电压,3.2V;脱溶剂气流量,500L/h(N2);阱碰撞能量(CE),6eV;转移CE,4eV;肼气流,1.5mL/min(Ar);样品流速,5μL/min;源温度,80℃;脱溶剂温度,150℃。
用配备有Nd:YAG激光(355nm)的Bruker Ultraflex-III TOF/TOF质谱仪(BrukerDaltonics,Inc.,Billerica,MA)获得MALDI-TOF质谱。所有谱以阳性反射模式(positivereflection mode)测量。在考虑中的分子量下使用外部聚苯乙烯或PMMA标准校准仪器。将用作基质的反式-2-[3-(4-叔丁基苯基)-2-甲基-2-亚丙烯基]-丙二腈的溶液(DCTB,SantaCruz Biotechnology,Inc.,>99%)在20mg/mL的浓度下于CHCl3中制备。将用作阳离子化盐的三氟醋酸钠或三氟醋酸银的溶液在10mg/mL的浓度下于MeOH/CHCl3(v/v=1/3)中制备。将所有样品溶解于CHCl3。将基质和阳离子化盐以10/1(v/v)的比率混合。所述样品制备涉及将0.5μL基质和盐混合物沉积在384-孔磨光钢板的孔中,使得样品风干,将0.5μL样品沉积在基质点上,并将另一0.5μL基质和盐混合物加入至干燥的样品点。在溶剂蒸发之后,将靶板插入MALDI源。调整且减弱激光以使不需要的聚合物片段最小化并使峰强度最优化。
实施例1
4-二苯并环辛炔醇的合成。
4-二苯并环辛炔醇的合成基于先前描述于Jung,M.E.;Mossman,A.B.;Lyster,M.A.J.Org.Chem.1978,43,3698;Ning,X.;Guo,J.;Wolfert,M.A.;Boons,G.-J.Angew.Chem.Int.Ed.2008,47,2253;和Mbua,N.E.;Guo,J.;Wolfert,M.A.;Steet,R.;Boons,G.J.chembiochem 2011,12,1912中的方法,所述文献的公开内容通过引用整体并入本文。
实施例2
2,3:6,7-二苯并-9-氧杂双环[3.3.1]壬-2,6-二烯(vi)的合成。
将250mL烧瓶火焰干燥并装载氩气。然后经由注射器加入苯乙醛(18.52g,0.154mol)和100mL氯仿(无水的)。将反应烧瓶在冰浴中冷却。将碘化三甲基硅烷(25mL,37.5g,0.188mol)加入至溶液并使得反应物在5℃静置保持7天。通过薄层色谱法监控反应。在7天之后,加入硫代硫酸钠(1.0M,160mL)和氯仿(200mL),并搅拌混合物直至排出碘颜色。将有机相分离、干燥(硫酸钠)并真空浓缩。用氯仿洗脱硅胶上的色谱法得到6.1g晶状的醚化合物(35%)。反应产物的1H NMR和13C NMR谱附加为图4A和4B。1H NMR和13C NMR的结果如下: 1H NMR(300MHz,CDCl3)δ=7.09(m,8H),5.30(d,2H,J=5.9Hz,CH),3.55(dd,2H,J=6.3,16.2Hz,CH2),2.75(d,2H,J=16.4Hz,CH2); 13C NMR(300MHz,CDCl3)δ=137.98,131.79,129.28,127.02,126.16,125.35,69.75,36.31.ESI MS m/z 245.1334[M+Na+];C16H14NaO+的计算值:245.0942。
实施例3
3-羟基-2',3',2",3"-四甲氧基,-2:5,6-二苯并环辛-1,5,7-三烯(vii)的合成。
将含实施例2的2,3:6,7-二苯并-9-氧杂双环[3.3.1]壬-2,6-二烯(vi)(2.00g,5.84mmol)的无水THF(60mL)置于三颈圆底烧瓶中并在氩气下于冰浴中冷却,经由注射器缓慢加入正丁基锂(4.92mL,2.5M,12.4mmol)。将反应混合物在室温下于氩气中搅拌4小时。通过小心地加入水猝灭反应并用2X 50mL CHC13萃取。将合并的有机相用30mL盐水洗涤,经Na2S04干燥,真空浓缩并通过硅胶CHC13上柱色谱法纯化以得到1.83g的3-羟基-2',3',2",3"-四甲氧基-2:5,6-二苯并环辛-1,5,7-三烯(vii)(90%)。
反应产物(vii)的1H NMR和13C NMR谱附加为图5A和5B。1H NMR和13C NMR的结果如下:1H NMR(300MHz,CDCl3):δ=7.48(m,1H),7.10–7.30(m,7H),6.86(q,2H,J=2.7,12.0Hz,CH),5.31(q,1H,J=6.1,10.0Hz,CHOH),3.45(m,2H,CH2);13C NMR(300MHz,CDCl3):d=140.9,136.9,136.3,134.6,131.8,131.7,130.3,129.9,129.3,128.8,127.3,127.2,126.1,125.9,74.7,42.7.ESI MS m/z 245.1277[M+Na+];C16H14NaO+的计算值:245.0942。
实施例4
11,12-二溴-5,6,ll,12-四氢-二苯并[a,e]环辛烯-5-醇(viii)的合成。
将溴(0.51mL,10mmol)逐滴加入搅拌的化合物(vii)(如上文实施例3中所示制备)(2.22g,10mmol)在CHCl3(50mL)中的溶液。在将混合物搅拌0.5小时之后,薄层色谱法(TLC)分析表明反应完成。将溶剂在减压下蒸发并将残余物通过快速色谱法经硅胶(2:1/1:2,v/v,己烷/CH2Cl2)纯化以得到呈浅黄色油状物的11,12-二溴-5,6,ll,12-四氢-二苯并[a,e]环辛烯-5-醇(viii)(60%)。反应产物的1H NMR和13C NMR谱附加为图6A和6B。1H NMR和13CNMR的结果如下:1H NMR(500MHz,CDCl3):δ=7.70–7.68(2H,芳烃),7.39–6.88(6H,芳烃),5.88(d,1H,J=5.4Hz,CHBr),5.47(dd,1H,J=3.6,15.9Hz,CHOH),5.30(d,1H,J=5.4Hz,CHBr),3.60(dd,1H,J=3.7,16.1Hz,CH2),2.87(dd,1H,J=3.7,16.1Hz,CH2);13C NMR(500MHz,CDCl3):δ=142.2,138.9,138.2,135.0,134.3,132.5,132.3,131.1,128.8,127.2,124.7,122.3,80.3,70.6,60.136.0.ESI MS m/z 402.9749[M+Na+];C16H14Br2NaO+的计算值:402.9309。
实施例5
5,6-二氢-11,12-二脱氢-二苯并[a,e]环辛烯-5-醇(ix)的合成。
将含二异丙基氨基锂的四氢呋喃(2.0M;8.0mL,16mmol)在氩气气氛下逐滴加入搅拌的11,12-二溴-5,6,ll,12-四氢-二苯并[a,e]环辛烯-5-醇(viii)(如上文实施例4中所示制备)(1.53g,4.0mmol)于四氢呋喃(40mL)中的溶液。将反应混合物搅拌0.5h,之后通过逐滴加入水(0.5mL)将其猝灭。将溶剂在减压下去除,并将残余物通过硅胶上的快速色谱法(己烷/CH2Cl22:1/0:1,v/v)纯化以得到呈白色无定形固体的5,6-二氢-11,12-二脱氢-二苯并[a,e]环辛烯-5-醇(ix)(0.52g,60%)。%)。反应产物(ix)的1H NMR和13C NMR谱附加为图7A和7B。1H NMR和13C NMR的结果如下:1H NMR(500MHz,CDCl3):δ=7.77(1H,芳烃),7.44–7.23(7H,芳烃),4.66(dd,J=2.1,14.7Hz,1H,CHOH),3.10(dd,J=2.1,14.8Hz,1H,CH2),2.94(dd,J=2.1,14.8Hz,1H,CH2);13C NMR(500MHz,CDCl3):δ=155.5,151.6,129.6,128.0,127.9,126.9,126.8,126.1,124.7,124.0,123.7,121.2,112.9,110.6,75.2,48.7.ESI MS m/z 243.1162[M+Na+];C16H12NaO+的计算值:243.0786。
实施例6
碳酸,5,6-(二氢-11,12-二脱氢-二苯并[a,e]环辛烯-5-基酯,4-硝基苯基酯(x)的合成。
将4-硝基苯基氯甲酸酯(0.4g,2mmol)和吡啶(0.4mL,5mmol)加入5,6-二氢-11,12-二脱氢-二苯并[a,e]环辛烯-5-醇(ix)(如上文实施例5中所示制备)(0.22g,1mmol)在CH2Cl2(30mL)中的溶液。在室温搅拌4个小时之后,用盐水(2×10mL)洗涤混合物并干燥(MgSO4)有机层。将溶剂在减压下蒸发并将残余物通过硅胶柱色谱法(己烷/乙酸乙酯,10:1,v/v)纯化以得到碳酸,5,6-(二氢-11,12-二脱氢-二苯并[a,e]环辛烯-5-基酯,4-硝基苯基酯(x)(0.32g,82%)。反应产物(x)的1H NMR和13C NMR谱附加为图8A和8B。1H NMR和13CNMR的结果如下:1H NMR(500MHz,CDCl3):δ=8.28–8.14(2H,芳烃),7.64–7.63(2H,芳烃),7.45–7.23(8H,芳烃),5.61(dd,J=3.9,15.3Hz,1H,CHOH),3.37(dd,1H,J=3.9,15.3Hz,CH2),2.05(dd,1H,J=3.9,15.3Hz,CH2);I3C NMR(500MHz,CDCl3):δ=155.5,151.7,150.1,149.7,129.9,128.4,128.3,127.7,127.5,126.6,126.2,125.4,125.0,123.6,123.5,121.8,121.7,121.3,113.3,109.6,81.6,45.8.ESI MS m/z 408.1450[M+Na+];C23H15NNaO5 +的计算值:408.0848。
实施例7
二苄基环辛炔聚乙二醇(i)的合成。
将聚乙二醇双胺(xi)(6.0k,100mg,0.017mmol)溶解于20mL无水CH2Cl2,然后加入6.8uL三乙醇胺(TEA)。在氩气下,加入碳酸,5,6-(二氢-11,12-二脱氢-二苯并[a,e]环辛烯-5-基酯,4-硝基苯基酯(x)(如上文实施例6中所示制备)(25mg,0.067mmol)。在24小时之后,将溶剂真空去除并加入水以溶解产物并透析水,其中截留MW为1000。将产物然后冻干以得到呈白色粉末的二苄基环辛炔聚乙二醇(i)(80mg,80%)。反应产物(i)的1H NMR谱附加为图9。1H NMR的结果如下:1H NMR(500MHz,CDCl3):δ=7.51–7.23(16H,芳烃),5.51(2H,dd,J=3.9,15.3Hz,CHOH),3.70-3.60(~550H,s,OCH2CH2O),3.40(4H,d,J=6.4Hz,CH2NH),3.20(dd,2H,J=3.9,15.3Hz,CH2),2.91(dd,2H,J=3.9,15.3Hz,CH2)。
实施例8
三臂PEG叠氮化物(ii)的合成。
将聚氧乙基甘油醚(4.67g 4.67mmol)溶解于100mL无水CH2Cl2,然后加入TEA(4.35mL,31.9mmol)。然后在氩气下于冰浴中经由注射器将甲磺酰氯(2.40mL,31.1mmol)逐滴加入溶液。在1小时之后,将溶液从冰浴移除并使其升温至室温保持24小时。经由过滤去除盐并将溶液真空浓缩。加入水(100mL)以萃取所需化合物。将碳酸钠加入至含水层直至pH=8。加入叠氮化钠(1.82g,28.0mmol)并将反应在85℃加热24小时。将溶剂真空去除,用5×100mL CH2Cl2萃取并经Na2SO4干燥。将所需化合物用在中性氧化铝上的CH2Cl2:甲醇(15:1)洗脱以得到呈无色油状物的三臂PEG叠氮化物(ii)(2.1g,45%)。反应产物(ii)的1H NMR谱附加为图10。1H NMR的结果如下:1H NMR(500MHz,CDCl3):δ=3.70-3.63(~84H,s,OCH2CH2O),3.60-3.52(5H,m,CH2CHCH2),3.40(t,6H,J=5.0Hz,CH2N3)。
实施例9
根据本发明的至少一个实施方案制得的水凝胶的交联。
为了显示两种前体在水溶液中的胶凝化,将DIBO-官能化PEG的化学计量混合物溶解于50uL超纯水中,基于DIBO基团和叠氮基团的计算的1:1摩尔比率,将1.1mg聚氧乙基甘油醚三叠氮化物溶解于50uL超纯水并将这两种溶液混合。5分钟内,当轻轻搅动时溶液胶凝(图11)。冷冻干燥的水凝胶的FTIR证实图11中叠氮基团消失。
实施例10
根据本发明的至少一个实施方案制得的水凝胶的剪切流变学分析。
为了评估凝胶是否适于可注射的凝胶应用,进行振荡剪切流变学实验以研究在应用的机械力下的胶凝化动力学。参见,图3。在24℃用配备有8mm平行板的TA InstrumentsARES-G2流变仪并且使用10rad/s(1.6Hz)的频率和10%的应变幅度进行振荡剪切测量。简而言之,将100μL 20重量%的DIBO-PEG溶液加入板,随后加入100μL 2.56重量%的聚氧乙基甘油醚三叠氮化物溶液。立即进行振荡剪切测量。
为了在实验期间保持水凝胶样品的水合,下夹板装置品包括充满DIBO-PEG和聚氧乙基甘油醚三叠氮化物(1:1)的水溶液的溶剂阱。有时小于600s的数据中的大的分散是在实现足够的交联之前溶液的非常低的粘度的结果。因此,转矩值太低而不能从力转换器获得可靠的读数。参见图3。然而,在600s之后,转矩大小足够高时,G’(复合模量的弹性部分,G*)和G”(G*的粘性组分)随时间的推移指数增长。
在实验开始时,溶液为粘性液体并且预期G”>G’。接近t~1000的G’和G”的交叉表示凝胶点,其中在材料从粘性液体变换至粘弹固体时已经充分地进行交联反应。在约2.5h之后,动态模达到平衡值,表明交联反应完成。在整个实验中凝胶完全水合,在反应结束时凝胶含有96.1%水和平台区模量,GN’为~0.8kPa。这对应于8.6mol/m3的交联密度,这使用橡胶弹性的经典理论计算。损耗因数tanδ(G”/G’)在反应结束时从~1的数值(其为典型的粘性液体)降低至~0.25的数值,这与粘弹固体的形成相一致(对于弹性固体,tanδ为零)。该反应也示出应变敏感性。
实施例11
用人间充质干细胞的生物相容性测定
使用人间充质干细胞(hMSC)以测试水凝胶交联对细胞活力的影响。将hMSC(传代5,500,000个细胞,Lonza,Basel,Switzerland)悬浮于含25μL 20重量%的DIBO-PEG的α-MEM基础培养基(Lonza)中。将含25μL 2.56重量%的聚氧乙基甘油醚三叠氮化物的α-MEM基础培养基加入细胞悬浮液。将样品经由轻轻吸打混合并置于模具中以固化。在5分钟之后,将水凝胶通过药刀转移至12-孔板中并在37℃,5%CO2培养箱中于α-MEM基础培养基中培养24h。进行存活死亡测定(Invitrogen,Carlsbad,CA)。将1.5μL 1mg/mL Calcein AM和0.1μL2mM乙啡啶同源二聚体-1以每mL的培养基加入并将样品孵育10分钟。然后将样品用培养基洗涤并在1×81x显微镜(Olympus,Center Valley,PA)上观察。细胞的包封和培养基添加剂的存在不会影响胶凝化过程。在培养24h之后来自存活/死亡细胞染色中的存活细胞的主要绿色荧光显示这些水凝胶的极好的生物相容性(>95%)。未转化成叠氮化物的三臂分子未如预期进行胶化并且与单独组分混合的hMSC在相同浓度条件下未显示出毒性(数据未示出)。
Claims (40)
1.一种共价交联的水凝胶,其包含8-元环炔官能化聚乙二醇或聚丙二醇和水溶性3-臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物的应变诱导的反应产物。
2.根据权利要求1所述的共价交联的水凝胶,其中所述8-元环炔官能化聚乙二醇或聚丙二醇的分子质量为500Da至12000Da。
3.根据权利要求1所述的共价交联的水凝胶,其中所述8-元环炔官能化聚乙二醇或聚丙二醇为二苄基环辛炔官能化聚乙二醇。
4.根据权利要求3所述的共价交联的水凝胶,其中所述8-元环炔官能化聚乙二醇或聚丙二醇为包含1%至40%重量百分比的二苄基环辛炔官能化聚乙二醇的水溶液。
5.根据权利要求2所述的共价交联的水凝胶,其中所述8-元环炔官能化聚乙二醇或聚丙二醇为包含11重量百分比的二苄基环辛炔官能化聚乙二醇的水溶液。
6.根据权利要求1所述的共价交联的水凝胶,其中所述3-臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物为包含1%至40%重量百分比的3-臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物的水溶液。
7.根据权利要求1所述的共价交联的水凝胶,其中所述3-臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物为包含3%重量百分比的3-臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物的水溶液。
8.根据权利要求3所述的共价交联的水凝胶,其中所述共价交联的水凝胶通过所述二苄基环辛炔官能化聚乙二醇和所述3-臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物的所述应变诱导的环加成形成。
9.根据权利要求1所述的共价交联的水凝胶,其中所述共价交联的水凝胶通过二苄基环辛炔官能化聚乙二醇和3-臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物的所述应变诱导的环加成形成。
10.根据权利要求3所述的共价交联的水凝胶,其中所述二苄基环辛炔官能化聚乙二醇的质量平均分子量为1,000至20,000。
11.根据权利要求1所述的共价交联的水凝胶,其交联密度为2至300mol/m3。
12.根据权利要求1所述的共价交联的水凝胶,其交联密度为8.6mol/m3。
13.根据权利要求1所述的共价交联的水凝胶,其损耗因数(tanδ)为0.10至0.50。
14.根据权利要求1所述的共价交联的水凝胶,其损耗因数(tanδ)为0.25。
15.根据权利要求1所述的共价交联的水凝胶,其还包含选自以下的添加剂:细胞、胶原、脱细胞组织、明胶及其组合。
16.根据权利要求15所述的共价交联的水凝胶,其中所述添加剂用所述共价交联的水凝胶包封。
17.根据权利要求15所述的共价交联的水凝胶,其中所述添加剂为人间充质干细胞。
18.根据权利要求16所述的共价交联的水凝胶,其中所述添加剂为人间充质干细胞。
19.根据权利要求1所述的共价交联的水凝胶,其中所述共价交联的水凝胶含有40%至99.9%的水。
20.根据权利要求1所述的共价交联的水凝胶,其中所述共价交联的水凝胶含有96.1%的水。
21.根据权利要求3所述的共价交联的水凝胶,其中所述二苄基环辛炔官能化聚乙二醇具有下式:
其中n为6至300的整数。
22.根据权利要求21所述的共价交联的水凝胶,其中n为6或7。
23.根据权利要求1所述的共价交联的水凝胶,其中所述3-臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物具有下式:
其中n为8至30的整数。
24.根据权利要求1所述的共价交联的水凝胶,其具有下式:
其中n为8至30的整数。
25.一种制备共价交联的水凝胶的方法,其包括:
A.制备含有8-元环炔官能化聚乙二醇或聚丙二醇的水溶液;
B.制备含有水溶性3-臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物的水溶液;
C.将步骤A的所述溶液与步骤B的所述溶液组合;以及
D.将应变应用至步骤C的混合物直至所述8-元环炔官能化聚乙二醇或聚丙二醇和所述水溶性3-臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物之间形成共价交联。
26.根据权利要求25所述的方法,其中所述8-元环炔官能化聚乙二醇或聚丙二醇为环炔官能化的聚乙二醇。
27.根据权利要求25所述的方法,其中所述8-元环炔官能化聚乙二醇或聚丙二醇为二苄基环辛炔官能化聚乙二醇。
28.根据权利要求25所述的方法,其中步骤A的所述水溶液含有1%至40%重量百分比的所述8-元环炔官能化聚乙二醇或聚丙二醇。
29.根据权利要求25所述的方法,其中步骤A的所述水溶液含有11重量百分比的所述8-元环炔官能化聚乙二醇或聚丙二醇。
30.根据权利要求25所述的方法,其中步骤B的所述水溶液含有1%至40%重量百分比的所述水溶性3-臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物。
31.根据权利要求25所述的方法,其中步骤B的所述水溶液含有3%重量百分比的所述水溶性3-臂聚氧乙基甘油醚三叠氮化物。
32.根据权利要求27所述的方法,其中所述二苄基环辛炔官能化聚乙二醇的质量平均分子量为1,000至20,000。
33.根据权利要求25所述的方法,其中步骤C的所述混合物为粘性液体。
34.根据权利要求25所述的方法,其中步骤C的所述混合物的损耗因数(tanδ)大于或等于1.0。
35.根据权利要求25所述的方法,其中步骤C的所述混合物的损耗因数(tanδ)为1.0。
36.根据权利要求25所述的方法,还包括将选自以下的添加剂加入至步骤A的所述水溶液或步骤B的所述水溶液的所述步骤:细胞、胶原、脱细胞组织、明胶及其组合。
37.根据权利要求36所述的方法,其中所述添加剂用所述共价交联的水凝胶包封。
38.根据权利要求36所述的方法,其中所述添加剂为人间充质干细胞。
39.根据权利要求37所述的方法,其中所述添加剂为人间充质干细胞。
40.根据权利要求25所述的方法,其中在步骤D中应用的所述应变为5%至15%的振荡剪切应变。
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Legal Events
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Granted publication date: 20171010 Termination date: 20190731 |