CN104480054A - 一种耐酸性高产琥珀酸的菌株及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种耐酸性高产琥珀酸的菌株及其制备方法，在确定产琥珀酸放线杆菌ATCC55618菌株生长的临界pH为4.5之后，对其进行紫外诱变，筛选出能够在pH4.3的固体平板上生长的菌株M1，对M1进行两轮紫外-亚硝基胍复合诱变，筛选出琥珀酸高产菌株AS-R2，该菌株在pH4.1条件下可以生长繁殖，但是在pH5.0条件下，产酸量仅为16.54g/L。本发明采用基因组改组技术对AS-R2进行3轮基因改组，获得了耐酸性高产菌株AS-F3-2，能够在pH3.2的从条件下生长繁殖，在pH5.0条件下，发酵36h，产琥珀酸产量达25.2g/L。

Description

一种耐酸性高产琥珀酸的菌株及其制备方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种耐酸性高产琥珀酸的菌株及其制备方法。
背景技术
琥珀酸(Succinic Acid)是一种二羧酸，是常见的天然有机酸，又名丁二酸，是三羧酸循环的产物之一，其在人体、动物、植物和微生物中广泛存在。琥珀酸作为一种C4平台化合物，用途极为广泛，目前在食品、农业、医药、化学等领域都有广泛应用。
现有琥珀酸的生产方法主要有化学合成法，但是化学合成法对石化材料和电耗需求大，石化材料不可再生，资源有限且会造成严重的环境污染；近年来，微生物发酵法成为关注的热点，但是目前琥珀酸生产菌株的产量仍是工业化生产的瓶颈问题。
发酵生产琥珀酸的微生物种类很多，目前主要报道的有大肠杆菌(Escherichia coli)、产琥珀酸厌氧螺菌(A.succiniproducens)、产琥珀酸放线杆菌(A.succiniproducens)、产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)、曼氏琥珀酸产生菌(Mannheimia succiniciproducen)和酵母等。其中，产琥珀酸放线杆菌被认为是目前最有潜力用于工业化发酵生产琥珀酸的菌种。密歇根大学和密歇根生物技术研究所筛选的兼性厌氧菌A.succiniproducens130Z(A.succiniproducens ATCC 55618)，产琥珀酸产量可达70g/L；Guettler等人以A.succiniproducens130Z作为出发菌株，采用诱变选育的技术筛选得到突变株，所得突变菌株的产琥珀酸量在最高时可以达到80g/L，该菌株生长和产酸的最佳pH均为6.8。韩国科学技术研究院研究组筛选曼氏琥拍酸杆菌报道的最高产琥 拍酸水平为52.4g/L。我国合肥工业大学的李兴江等人对A.succinogene(实验室筛得)采用60Co-γ辐照进行诱变，筛选得到了突变株HF417，其产乙酸的浓度由25.7g/L降低到了4.5g/L，而且产得的琥珀酸量由45g/L增加到了67g/L。南京工业大学姜岷等筛选了一株产琥珀酸放线杆菌(A.succiniproducens)NJ113(保藏编号为CGMCCNo.1716)，其发酵液最高产琥珀酸37℃发酵45小时后丁二酸产量可以达到45g/L，生长pH范围为5.0～8.0，最适产酸pH7.0。郑璞等从牛的瘤胃中筛选到一株产琥珀酸的野生菌株，通过菌种鉴定确认为产琥珀酸放线杆菌CGMCC1593，通过NTG诱变选育氟乙酸钠抗性突变株，得到产量提高的诱变菌株SF-9，发酵36h可积累琥珀酸40.5g/L，应用基因组改组技术选育到耐钠、氟乙酸钠抗性改组菌CGMCC 2653，5L发酵罐中补料分批发酵48h产琥珀酸53.96g/L，后来选育的CGMCC1593，采用补料分批发酵，48h产琥珀酸95.6g/L。但是这些菌株的耐酸性差，最适产酸pH均为中性左右，这就使发酵过程中必须采用碱中和维持菌株产酸的最适pH条件，导致产品分离提取过程中产生大量的盐，给环境带了一定的污染。耐酸性菌株在发酵产酸过程中需要中和碱的量少，分离提取产生的盐少，为此筛选耐酸性菌株成为目前人们研究的重点。刘璇等采用基因组改组技术选育耐酸性琥珀酸放线杆菌F3-21，其在5L发酵罐中补料分批发酵，控制pH在5.6～6.0时，48h积累琥珀酸38.1g/L。
现有琥珀酸的生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法，化学合成法对石化材料和电耗需求大，且会造成环境污染；微生物发酵又被菌株培养条件及产量所限制。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种耐酸性高产琥珀酸的菌株及其制备方法，旨在解决现有琥珀酸的生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法，化学合成法对石化材料和电耗需求大，且会造成环境污染；微生物发酵又被菌株培 养条件及产量所限制的问题。
本发明实施例是这样实现的，一种耐酸性高产琥珀酸的菌株，该耐酸性高产琥珀酸的菌株以一株产琥珀酸放线杆菌为原始菌株，通过紫外线和亚硝基胍诱变，再经基因组改组筛选，获得耐酸性强且琥珀酸产量高的突变株AS-F3-2；产琥珀酸放线杆菌AS-F3-2，由原始菌株产琥珀酸放线杆菌ATCC 55618经复合诱变和基因组改组后筛选获得，已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No. 9099。
所述菌株是以一株产琥珀酸放线杆菌(A.succiniproducens)为原始菌株，通过紫外线(UV)和亚硝基胍(NTG)诱变，分别通过pH4.1和溴甲酚绿平板筛选获得耐酸和产量提高菌株AS-UV1，AS-UV2，AS-NTG1和AS-NTG2；分别将上述4株突变菌株进行原生质体制备，并等量混匀后均分为2份，一份采用加热灭活，另一份采用紫外灭活，然后混合进行原生质体融合、再生，并在pH3.8和溴甲酚绿平板筛选获得耐酸和产量提高F1代突变菌株AS-F1-8；然后将F1代菌株制备原生质体，进行第二轮基因组改组，连续经3轮基因组改组后筛选，获得耐酸性强且琥珀酸产量高的突变株AS-F3-2(CGMCC9099)，该菌株在pH3.2条件下可以生长繁殖，在pH5.0条件下，产酸量25.2g/L。
本发明实施例的另一目的在于提供一种耐酸性高产琥珀酸的菌株制备方法，该耐酸性高产琥珀酸的菌株制备方法包括以下步骤：
步骤一，菌株诱变，对产琥珀酸放线杆菌菌株AS-R2分别进行紫外线诱变和亚硝基胍诱变；
步骤二，诱变菌株的筛选，在耐酸平板上筛选出经紫外线诱变和亚硝基胍诱变后耐酸性最强的菌落，刮到生理盐水中，梯度稀释，涂布于溴甲酚绿平板，厌氧培养箱内37℃下培养3～5d；挑选变色圈较大的菌落，记号笔做标记，分别挑取一环变色圈较大的菌落于发酵培养基中培养，并测琥珀酸产量；产量高 的菌株继续用于基因组改组；
步骤三，第一轮基因组改组，以诱变筛选得到的多株突变株为出发菌株，制备原生质体，并对所制备的原生质体灭活，再融合，最后筛选F1代突变株；
步骤四，第二轮基因组改组，以第一轮基因组改组得到的融合子为出发菌株，继续原生质体制备、灭活与融合，并筛选F2代突变株；
步骤五，第三轮基因组改组，以第二轮基因组改组得到的融合子为出发菌株，继续原生质体制备、灭活与融合，并筛选F3代突变株；
步骤六，对获得的F3代突变株传代10次，验证遗传稳定性，获得耐酸性强且琥珀酸产量高的突变株AS-F3-2。
进一步，在步骤一中，菌株诱变的方法包括：
第一步，紫外线诱变：挑取原始菌株－－产琥珀酸放线杆菌于装有活化培养基的试管中，活化24h，以3％接种量接种于装有活化培养基的试管中进行二次活化，活化24h，再以3％接种量接种于装有发酵培养基的三角瓶中，培养至对数期，取5ml于已灭菌的培养皿中，放入灭菌的磁力搅拌棒，紫外灯下30cm处于磁力搅拌器上紫外照射50s，时间到，关闭磁力搅拌器，取1ml诱变菌液于9ml生理盐水，梯度稀释至10-7，取梯度为10-5、10-6及10-7的菌液涂布于pH4.1平板上，每个梯度涂10个平板，于厌氧培养箱内37℃下避光培养3～5d；
第二步，亚硝基胍诱变：出发菌株培养至对数期，取4.75ml菌液，加入0.25ml亚硝基胍母液，终浓度为500μg/mL，于37℃保温90min，以冷的生理盐水稀释100倍，终止反应，生理盐水梯度稀释至10-7，取梯度为10-5、10-6及10-7的菌液涂布于pH 4.1平板平板上，每个梯度涂10个平板，于厌氧培养箱内37℃下避光培养3～5d。
进一步，在步骤三中，出发菌株原生质体的制备方法：
挑取多株突变株各一环于活化培养基中活化一代，培养24h，按3％接种量二次活化于活化培养基中，培养24h，然后以3％接种量接种到含0～2.5％甘氨酸的发酵培养基中，培养2～14h，取10ml培养液于已灭菌的离心管中，以转速8000r/min离心15min，倒出上清液，菌体沉淀重悬于10ml渗透压稳定液中，离心洗涤菌体2次，菌体沉淀继续重悬于10ml渗透压稳定液中，摇匀后，加入终浓度为0.02～0.14mg/ml的溶菌酶溶液，在18～47℃水浴锅中恒温酶解20～80min；酶解完成后，从水浴锅中取出并以转速6000r/min离心15min，得到的沉淀以渗透压稳定液洗涤2次，沉淀重悬于10ml渗透压稳定液中，得到的悬液就是原生质体悬液。
进一步，原生质体灭活方法：将各株突变株酶解得到的原生质体悬液等量混合均匀，再均分为两份，一份采取热灭活方式灭活，另一份采取紫外灭活方式灭活；
热灭活：将用于热灭活的原生质体悬液放于60℃水浴锅中，避光恒温灭活10～60min；紫外灭活：将用于紫外灭活的原生质体悬液均分，每份含原生质体悬液10ml，倒入已灭菌的培养皿中，放入灭菌的磁力搅拌棒，紫外灯下30cm处于磁力搅拌器上紫外照射15～40min。
进一步，原生质体融合方法：取热灭活和紫外灭活后的原生质体悬液等体积混合均匀，加入40％聚乙二醇PEG 6000，在20℃条件下保温6min，以促融灭活的原生质体；融合完成后，从水浴锅中取出并以转速6000r/min离心15min，得到的沉淀以渗透压稳定液洗涤2次，沉淀重悬于渗透压稳定液中，所得到的悬液就是原生质体融合后的融合子悬液。
进一步，融合子筛选方法：对所得到的融合子悬液梯度稀释，涂布于再生平板，厌氧培养箱内37℃下避光培养3～5d；再生培养基上长出的菌落全都刮到生理盐水中，稀释，F1，F2和F3代融合子分别涂布于pH3.8，3.5和3.2平 板，厌氧培养箱内37℃下培养3～5d；耐酸平板上长出的菌落再刮到生理盐水中，梯度稀释涂布溴甲酚绿平板，厌氧培养箱内37℃下培养3～5d，挑选变色圈较大的菌落，并用记号笔做标记；分别将选定的变色圈较大的菌落各挑取一环于发酵培养基中，厌氧培养箱内37℃下培养，并测琥珀酸产量。
进一步，发酵培养基的制备方法：葡萄糖30g/L，酵母浸粉10g/L，Na2HPO40.3g/L，NaH2PO49.6g/L，K2HPO43g/L，MgCl20.4g/L，1mol/L NaOH溶液调pH，121℃灭菌20min；耐酸平板培养基：发酵培养基的组分上，0.01mol/L盐酸溶液调至目的pH值，与琼脂添加量为2％的等体积蒸馏水分开灭菌后混合，121℃灭菌20min；溴甲酚绿平板培养基：发酵培养基的组分上，溴甲酚绿0.1％，琼脂1.5％，1mol/LNaOH溶液调至pH 7.0，121℃灭菌20min。
进一步，活化培养基的制备方法：TSA培养基，配方为：胰蛋白胨15g/L，大豆蛋白胨5g/L，NaC15g/L，pH自然，121℃灭菌20min；亚硝基胍母液：取1g亚硝基胍加入10ml丙酮作为助溶剂，取1ml亚硝基胍丙酮溶液加入9ml磷酸盐缓冲液；渗透压稳定液：顺丁烯二酸2.33g/L，MgCl·6H2O 4.07g/L，蔗糖171.13g/L，pH 7.0，121℃灭菌20min；溶菌酶溶液：称取0.1g溶菌酶，将其溶解于10mL渗透压稳定液中，配制成10mg/mL的酶液，膜滤除菌，于4℃条件下保存备用；
再生双层培养基下层为发酵培养基再加入渗透压稳定液和2％琼脂；上层与下层相同，琼脂添加量改为0.5％。
进一步，产琥珀酸放线杆菌AS-F3-2在pH5.0条件下，发酵36h，产琥珀酸产量达25.2g/L。
本发明提供的耐酸性高产琥珀酸的菌株及其制备方法采用基因组改组技术获得了耐酸性高产菌株AS-F3-2，在pH3.2条件下可以生长繁殖，在pH5.0条件下，发酵36h，产琥珀酸产量达25.2g/L。
附图说明
图1是本发明实施例提供的耐酸性高产琥珀酸的菌株制备方法流程图；
图2是本发明实施例提供的pH5.0条件下原始菌株、诱变突变株及改组菌株产酸量比较示意图。AS-R2为原始菌株ATCC55618经紫外和亚硝基胍诱变后菌株；AS-UV1，2为AS-R2紫外线诱变后突变菌株；AS-NTG1，2为AS-R2亚硝基胍诱变后突变菌株；AS-F1-1-8为第一轮基因组改组后的8株突变株；AS-F2-1-4为第二轮基因组改组后的4株突变株；AS-F3-1-3为第三轮基因组改组后的3株突变株.
图3是本发明实施例提供的第三轮改组菌株遗传稳定性示意图；
图中：(a)为耐酸稳定性，图中□为第一代菌株；■为第10代菌株；(b)为产量稳定性，图中□为第一代菌株；■为第10代菌株。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
本发明实施例的耐酸性高产琥珀酸的菌株以一株产琥珀酸放线杆菌(A.succiniproducens)为原始菌株，通过紫外线(UV)和亚硝基胍(NTG)诱变，再经基因组改组筛选，获得耐酸性强且琥珀酸产量高的突变株AS-F3-2(CGMCC9099)；产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)AS-F3-2，由原始菌株产琥珀酸放线杆菌ATCC 55618经复合诱变和基因组改组后筛选获得，已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No. 9099。
保藏人王玉华于2014年4月28日，向中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提出保藏申请，保藏编号：CGMCC No.9099；中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院生物研究所；请求保藏 的参考生物材料：AS-F3-2，建议的分类命名：产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)，该生物材料已于2014年04月28日由本保藏中心收到，并登记入册，由2014年04月28日起保存三十年，在期满前收到提供生物样品的请求后再延续保存五年；该生物材料的存活性经本保藏中心于2014年04月28日检测，结果为存活。
如图1所示，本发明实施例的耐酸性高产琥珀酸的菌株制备方法包括以下步骤：
S101：菌株诱变，对产琥珀酸放线杆菌菌株AS-R2分别进行紫外线(UV)诱变和亚硝基胍(NTG)诱变；
S102：诱变菌株的筛选，在耐酸平板上筛选出经紫外线(UV)诱变和亚硝基胍(NTG)诱变后耐酸性最强的菌落，刮到生理盐水中，梯度稀释，涂布于溴甲酚绿平板，厌氧培养箱内37℃下培养3～5d；挑选变色圈较大的菌落，记号笔做标记，分别挑取一环变色圈较大的菌落于发酵培养基中培养，并测其琥珀酸产量；产量高的菌株继续用于基因组改组；
S103：第一轮基因组改组，以诱变筛选得到的多株突变株为出发菌株，制备其原生质体，并对所制备的原生质体灭活，再融合，最后筛选F1代融合子；
S104：第二轮基因组改组，以第一轮基因组改组得到的融合子为出发菌株，继续原生质体制备、灭活与融合，并筛选F2代融合子；
S105：第三轮基因组改组，以第二轮基因组改组得到的融合子为出发菌株，继续原生质体制备、灭活与融合，并筛选F3代融合子；
S106：对获得的F3代突变株传代10次，验证其遗传稳定性。
在步骤S101中，菌株诱变的方法包括：
第一步，紫外线诱变(UV)：挑取原始菌株－－产琥珀酸放线杆菌(A. succinogenes)于装有活化培养基的试管中，活化24h，以3％接种量接种于装有活化培养基的试管中进行二次活化，活化24h，再以3％接种量接种于装有发酵培养基的三角瓶中，培养至对数期，取5ml于已灭菌的培养皿中，放入灭菌的磁力搅拌棒，紫外灯下30cm处于磁力搅拌器上紫外照射50s，时间到，关闭磁力搅拌器，取1ml诱变菌液于9ml生理盐水，梯度稀释至10-7，取梯度为10-5、10-6及10-7的菌液涂布于耐pH 5.1～3.9平板上，每个梯度涂10个平板，于厌氧培养箱内37℃下避光培养3～5d；
第二步，亚硝基胍(NTG)诱变：出发菌株培养至对数期，取4.75ml菌液，加入0.25ml亚硝基胍(NTG)母液(终浓度为500μg/mL)，于37℃保温90min，以冷的生理盐水稀释100倍，终止反应，生理盐水梯度稀释至10-7，取梯度为10-5、10-6及10-7的菌液涂布于耐pH 5.1～3.9平板上，每个梯度涂10个平板，于厌氧培养箱内37℃下避光培养3～5d。
在步骤S103中，出发菌株原生质体的制备方法：
挑取多株突变株各一环于活化培养基中活化一代(培养24h)，按3％接种量二次活化于活化培养基中(培养24h)，然后以3％接种量接种到含0～2.5％甘氨酸的发酵培养基中，培养2～14h，取10ml培养液于已灭菌的离心管中，以转速8000r/min离心15min，倒出上清液，菌体沉淀重悬于10ml渗透压稳定液中，离心洗涤菌体2次，菌体沉淀继续重悬于10ml渗透压稳定液中，摇匀后，加入终浓度为0.02～0.14mg/ml的溶菌酶溶液，在18～47℃水浴锅中恒温酶解20～80min；酶解完成后，从水浴锅中取出并以转速6000r/min离心15min，得到的沉淀以渗透压稳定液洗涤2次，沉淀重悬于10ml渗透压稳定液中，得到的悬液就是原生质体悬液。
原生质体灭活方法是：将各株突变株酶解得到的原生质体悬液等量混合均匀，再均分为两份，一份采取热灭活方式灭活，另一份采取紫外灭活方式灭活； (1)热灭活：将用于热灭活的原生质体悬液放于60℃水浴锅中，避光恒温灭活10～60min；(2)紫外灭活：将用于紫外灭活的原生质体悬液均分，每份含原生质体悬液10ml，倒入已灭菌的培养皿中，放入灭菌的磁力搅拌棒，紫外灯下30cm处于磁力搅拌器上紫外照射15～40min。
原生质体融合方法：取热灭活和紫外灭活后的原生质体悬液等体积混合均匀，加入40％聚乙二醇PEG 6000，在20℃条件下保温6min，以促融灭活的原生质体；融合完成后，从水浴锅中取出并以转速6000r/min离心15min，得到的沉淀以渗透压稳定液洗涤2次，沉淀重悬于渗透压稳定液中，所得到的悬液就是原生质体融合后的融合子悬液；
融合子筛选：对所得到的融合子悬液梯度稀释，涂布于再生平板，厌氧培养箱内37℃下避光培养3～5d；再生培养基上长出的菌落全都刮到生理盐水中，稀释涂布于耐pH3.8～3.2平板，厌氧培养箱内37℃下培养3～5d；耐酸平板上长出的菌落再刮到生理盐水中，梯度稀释涂布溴甲酚绿平板，厌氧培养箱内37℃下培养3～5d，挑选变色圈较大的菌落，并用记号笔做标记；分别将选定的变色圈较大的菌落各挑取一环于发酵培养基中，厌氧培养箱内37℃下培养，并测琥珀酸产量。
在步骤S102中，发酵培养基：葡萄糖30g/L，酵母浸粉10g/L，Na2HPO40.3g/L，NaH2PO49.6g/L，K2HPO43g/L，MgCl20.4g/L，1mol/L NaOH溶液调至pH 7.0，121℃灭菌20min；耐酸平板培养基：发酵培养基(配方上)，0.01mol/L盐酸溶液调至目的pH值，与琼脂添加量为2％的等体积蒸馏水分开灭菌后混合，121℃灭菌20min；溴甲酚绿平板培养基：发酵培养基(配方上)，溴甲酚绿0.1％，琼脂1.5％，1mol/L NaOH溶液调至pH 7.0，121℃灭菌20min。
活化培养基：TSA培养基，配方为：胰蛋白胨15g/L，大豆蛋白胨5g/L，NaCl 5g/L，pH自然，121℃灭菌20min；亚硝基胍(NTG)母液：取1g亚硝 基胍(NTG)加入10ml丙酮作为助溶剂，取1ml亚硝基胍(NTG)丙酮溶液加入9ml磷酸盐缓冲液；渗透压稳定液：顺丁烯二酸2.33g/L，MgCl·6H2O4.07g/L，蔗糖171.13g/L，pH 7.0，121℃灭菌20min；溶菌酶溶液：称取0.1g溶菌酶，将其溶解于10mL渗透压稳定液中，配制成10mg/mL的酶液，膜滤除菌，于4℃条件下保存备用。
再生双层培养基：下层为发酵培养基再加入渗透压稳定液和2％琼脂；上层与下层相同，琼脂添加量改为0.5％。
本发明的产琥珀酸放线杆菌(A.succinogenes)AS-F3-2在pH5.0条件下，发酵36h，产琥珀酸产量达25.2g/L。
本发明的具体步骤包括：
步骤一，菌株诱变：
对产琥珀酸放线杆菌(A.succiniproducens)AS-R2分别进行紫外线(UV)诱变和亚硝基胍(NTG)诱变；
紫外线诱变(UV)：挑取原始菌株－－产琥珀酸放线杆菌（Ａ.succiniproducens)AS-R2于装有活化培养基的试管中，活化24h，以3％接种量接种于装有活化培养基的试管中进行二次活化，活化24h，再以3％接种量接种于装有发酵培养基的三角瓶中，培养至对数期，取5ml于已灭菌的培养皿中，放入灭菌的磁力搅拌棒，紫外灯下30cm处于磁力搅拌器上紫外照射50s，时间到，关闭磁力搅拌器，取1ml诱变菌液于9ml生理盐水，梯度稀释至10-7，取梯度为10-5、10-6及10-7的菌液涂布于耐pH 5.1、pH 4.8、pH 4.5、pH 412及pH3.9平板上，每个梯度涂10个平板，于厌氧培养箱内37℃下避光培养3～5d；
亚硝基胍(NTG)诱变：出发菌株培养至对数期，取4.75ml菌液，加入0.25ml亚硝基胍(NTG)母液(终浓度为500μg/mL)，于37℃保温90min，以冷的生理盐水稀释100倍，终止反应，生理盐水梯度稀释至10-7，取梯度为10-5、10-6 及10-7的菌液涂布于耐pH 5.1、pH 4.8、pH 4.5、pH 4.2及pH 3.9平板上，每个梯度涂10个平板，于厌氧培养箱内37℃下避光培养3～5d；
步骤二，诱变菌株的筛选：
在耐酸平板上筛选出经紫外线(UV)诱变和亚硝基胍(NTG)诱变后耐酸性最强的菌落，刮到生理盐水中，梯度稀释，涂布于溴甲酚绿平板，厌氧培养箱内37℃下培养3～5d；挑选变色圈较大的菌落，记号笔做标记，分别挑取一环变色圈较大的菌落于发酵培养基中培养，并测其琥珀酸产量；产量高的菌株继续用于基因组改组；
步骤三，基因组改组：
第一轮基因组改组：
以诱变筛选得到的多株突变株为出发菌株，制备其原生质体，并对所制备的原生质体灭活，再融合，最后筛选F1代融合子；
出发菌株原生质体的制备：
挑取多株突变株各一环于活化培养基中活化一代(培养24h)，按3％接种量二次活化于活化培养基中(培养24h)，然后以3％接种量接种到含0～2.5％甘氨酸的发酵培养基中，培养2～14h，取10ml培养液于已灭菌的离心管中，以转速8000r/min离心15min，倒出上清液，菌体沉淀重悬于10ml渗透压稳定液中，离心洗涤菌体2次，菌体沉淀继续重悬于10ml渗透压稳定液中，摇匀后，加入终浓度为0.02～0.14mg/ml的溶菌酶溶液，在18～47℃水浴锅中恒温酶解20～80min；酶解完成后，从水浴锅中取出并以转速6000r/min离心15min，得到的沉淀以渗透压稳定液洗涤2次，沉淀重悬于10ml渗透压稳定液中，得到的悬液就是原生质体悬液；
原生质体灭活：
将各株突变株酶解得到的原生质体悬液等量混合均匀，再均分为两份，一份采取热灭活方式灭活，另一份采取紫外灭活方式灭活；
热灭活：将用于热灭活的原生质体悬液放于60℃水浴锅中，避光恒温灭活10～60min；
紫外灭活：将用于紫外灭活的原生质体悬液均分，每份含原生质体悬液10ml，倒入已灭菌的培养皿中，放入灭菌的磁力搅拌棒，紫外灯下30cm处于磁力搅拌器上紫外照射15～40min，时间到，关闭磁力搅拌器；
以上所述灭活过程都要避光进行；
原生质体融合：
取热灭活和紫外灭活后的原生质体悬液等体积混合均匀，加入40％聚乙二醇PEG 6000，在20℃下保温6min，以促融灭活的原生质体；融合完成后，从水浴锅中取出并以转速6000r/min离心15min，得到的沉淀以渗透压稳定液洗涤2次，沉淀重悬于渗透压稳定液中，所得到的悬液就是原生质体融合后的融合子悬液；
融合子筛选： 
对所得到的融合子悬液梯度稀释，涂布于再生平板，厌氧培养箱内37℃下避光培养3～5d；再生培养基上长出的菌落全都刮到生理盐水中，稀释涂布于耐pH3.8平板，厌氧培养箱内37℃下培养3～5d；耐酸平板上长出的菌落再刮到生理盐水中，梯度稀释涂布溴甲酚绿平板，厌氧培养箱内37℃下培养3～5d，挑选变色圈较大的菌落，并用记号笔做标记；分别将选定的变色圈较大的菌落各挑取一环于发酵培养基中，厌氧培养箱内37℃下培养，并测琥珀酸产量；筛选产量高的融合子，这就是第一轮基因组改组得到的F1代突变株；
第二轮基因组改组：
以第一轮基因组改组得到的融合子为出发菌株，继续原生质体制备、灭活与融合，方法与第一轮基因组改组时相同，并筛选F2代融合子：
第二轮基因组改组的融合子筛选：
对所得到的融合子悬液梯度稀释，涂布于再生平板，厌氧培养箱内37℃下避光培养3～5d；再生培养基上长出的菌落全都刮到生理盐水中，稀释涂布于耐pH3.5平板，厌氧培养箱内37℃下培养3～5d；耐酸平板上长出的菌落再刮到生理盐水中，梯度稀释涂布溴甲酚绿平板，厌氧培养箱内37℃下培养3～5d，挑选变色圈较大的菌落，并用记号笔做标记；分别将选定的变色圈较大的菌落各挑取一环于发酵培养基中，厌氧培养箱内37℃下培养，并测琥珀酸产量；筛选产量高的融合子，这就是第二轮基因组改组得到的F2代突变株；
第三轮基因组改组：
以第二轮基因组改组得到的融合子为出发菌株，继续原生质体制备、灭活与融合，方法与第一轮基因组改组时相同，并筛选F3代融合子；
第三轮基因组改组的融合子筛选：
对所得到的融合子悬液梯度稀释，涂布于再生平板，厌氧培养箱内37℃下避光培养3～5d；再生培养基上长出的菌落全都刮到生理盐水中，稀释涂布于耐pH3.2平板，厌氧培养箱内37℃下培养3～5d；耐酸平板上长出的菌落再刮到生理盐水中，梯度稀释涂布溴甲酚绿平板，厌氧培养箱内37℃下培养3～5d，挑选变色圈较大的菌落，并用记号笔做标记；分别将选定的变色圈较大的菌落各挑取一环于发酵培养基中，厌氧培养箱内37℃下培养，并测琥珀酸产量；筛选产量高的融合子，这就是第三轮基因组改组得到的F3代突变株；
对获得的F3代突变株传代10次，验证其遗传稳定性；
本发明的具体实施例：
实施例1
原生质体制备条件：
挑取多株突变株各一环于活化培养基中活化一代(培养24h)，按3％接种量二次活化于活化培养基中(培养24h)，然后以3％接种量接种到含1.0％甘氨酸的发酵培养基中，培养6h，取10ml培养液于已灭菌的离心管中，以转速8000r/min离心15min，倒出上清液，菌体沉淀重悬于10ml渗透压稳定液中，离心洗涤菌体2次，菌体沉淀继续重悬于10ml渗透压稳定液中，摇匀后，加入终浓度为0.08mg/ml的溶菌酶溶液，在37℃水浴锅中恒温酶解40min；酶解完成后，从水浴锅中取出并以转速6000r/min离心15min，得到的沉淀以渗透压稳定液洗涤2次，沉淀重悬于10ml渗透压稳定液中，得到的悬液就是原生质体悬液。
实施例2
原生质体灭活：
将各株突变株酶解得到的原生质体悬液等量混合均匀，再均分为两份，一份采取热灭活方式灭活，另一份采取紫外灭活方式灭活；
热灭活：将用于热灭活的原生质体悬液放于60℃水浴锅中，避光恒温灭活30min；
紫外灭活：将用于紫外灭活的原生质体悬液均分，每份含原生质体悬液10ml，倒入已灭菌的培养皿中，放入灭菌的磁力搅拌棒，紫外灯下30cm处于磁力搅拌器上紫外照射35min，时间到，关闭磁力搅拌器；
以上所述灭活过程都要避光进行；
实施例3
基因组改组： 
(1)菌株诱变： 
对产琥珀酸放线杆菌(A.succiniproducens)AS-R2分别进行紫外线(UV)诱变和亚硝基胍(NTG)诱变(具体方法如上文所述)；
(2)诱变菌株的筛选：
在耐酸平板上筛选出经紫外线(UV)诱变和亚硝基胍(NTG)诱变后耐酸性最强的菌落，刮到生理盐水中，梯度稀释，涂布于溴甲酚绿平板，厌氧培养箱内37℃下培养3～5d；挑选变色圈较大的菌落，记号笔做标记，分别挑取一环变色圈较大的菌落于发酵培养基中培养，并测其琥珀酸产量；产量高的菌株继续用于基因组改组；
(3)基因组改组 
第一轮基因组改组：
以诱变筛选得到的多株突变株为出发菌株，以实例1所述的制备条件制备其原生质体，并对所制备的原生质体以实例2所述条件进行灭活；取热灭活和紫外灭活后的原生质体悬液等体积混合均匀，加入40％聚乙二醇PEG 6000，在20℃下保温6min，以促融灭活的原生质体；融合完成后，从水浴锅中取出并以转速6000r/min离心15min，得到的沉淀以渗透压稳定液洗涤2次，沉淀重悬于渗透压稳定液中，所得到的悬液就是原生质体融合后的融合子悬液；
对所得到的融合子悬液梯度稀释，涂布于再生平板，厌氧培养箱内37℃下 避光培养3～5d；再生培养基上长出的菌落全都刮到生理盐水中，稀释涂布于耐pH3.8平板，厌氧培养箱内37℃下培养3～5d；耐酸平板上长出的菌落再刮到生理盐水中，梯度稀释涂布溴甲酚绿平板，厌氧培养箱内37℃下培养3～5d，挑选变色圈较大的菌落，并用记号笔做标记；分别将选定的变色圈较大的菌落各挑取一环于发酵培养基中，厌氧培养箱内37℃下培养，并测琥珀酸产量；筛选产量高的融合子，这就是第一轮基因组改组得到的F1代突变株；
第二轮基因组改组：
以第一轮基因组改组得到的融合子为出发菌株，继续原生质体制备、灭活与融合，方法与第一轮基因组改组时相同，得到融合子悬液；
对所得到的融合子悬液梯度稀释，涂布于再生平板，厌氧培养箱内37℃下避光培养3～5d；再生培养基上长出的菌落全都刮到生理盐水中，稀释涂布于耐pH3.5平板，厌氧培养箱内37℃下培养3～5d；耐酸平板上长出的菌落再刮到生理盐水中，梯度稀释涂布溴甲酚绿平板，厌氧培养箱内37℃下培养3～5d，挑选变色圈较大的菌落，并用记号笔做标记；分别将选定的变色圈较大的菌落各挑取一环于发酵培养基中，厌氧培养箱内37℃下培养，并测琥珀酸产量；筛选产量高的融合子，这就是第二轮基因组改组得到的F2代突变株；
第三轮基因组改组：
以第二轮基因组改组得到的融合子为出发菌株，继续原生质体制备、灭活与融合，方法与第一轮基因组改组时相同，得到融合子悬液；
对所得到的融合子悬液梯度稀释，涂布于再生平板，厌氧培养箱内37℃下避光培养3～5d；再生培养基上长出的菌落全都刮到生理盐水中，稀释涂布于耐pH3.2平板，厌氧培养箱内37℃下培养3～5d；耐酸平板上长出的菌落再刮到生理盐水中，梯度稀释涂布溴甲酚绿平板，厌氧培养箱内37℃下培养3～5d，挑选变色圈较大的茵落，并用记号笔做标记；分别将选定的变色圈较大的菌落 各挑取一环于发酵培养基中，厌氧培养箱内37℃下培养，并测琥珀酸产量；筛选产量高的融合子，这就是第三轮基因组改组得到的F3代突变株；
所得原始菌株、诱变突变株及改组菌株产酸量比较图与琥珀酸标品及菌株AS-F3-2发酵液中琥珀酸高效液相色谱图见说明书附图；
对获得的F3代突变株传代10次，在pH5.0条件下发酵36h分析其生长量和产酸量，验证其遗传稳定性；结果表明改组菌株AS-F3-2和AS-F3-3具有稳定的遗传性。
本发明在确定产琥珀酸放线杆菌ATCC55618菌株生长的临界pH为4.5之后，对其进行紫外诱变，筛选出能够在pH4.3的固体平板上生长的菌株M1，对M1进行两轮紫外-亚硝基胍复合诱变，筛选出琥珀酸高产菌株AS-R2，该菌株在pH4.1条件下可以生长繁殖，但是在pH5.0条件下，产酸量仅为16.54g/L。目前，本发明采用基因组改组技术获得了耐酸性高产菌株AS-F3-2，在pH3.2条件下可以生长繁殖，在pH5.0条件下，产琥珀酸产量达25.2g/L。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种耐酸性高产琥珀酸的菌株，其特征在于，该耐酸性高产琥珀酸的菌株以一株产琥珀酸放线杆菌为原始菌株，通过紫外线和亚硝基胍诱变，再经基因组改组筛选，获得耐酸性强且琥珀酸产量高的突变株AS-F3-2；产琥珀酸放线杆菌AS-F3-2，由原始菌株产琥珀酸放线杆菌ATCC 55618经复合诱变和基因组改组后筛选获得，已经保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CGMCC9099。
2.如权利要求1所述的耐酸性高产琥珀酸的菌株，其特征在于，所述菌株是以一株产琥珀酸放线杆菌ATCC55618为原始菌株，通过紫外线和亚硝基胍诱变，分别通过pH4.1和溴甲酚绿平板筛选获得耐酸和产量提高菌株AS-UV1，AS-UV2，AS-NTG1和AS-NTG2；分别将上述4株突变菌株进行原生质体制备，并等量混匀后均分为2份，一份采用加热灭活，另一份采用紫外灭活，然后混合进行原生质体融合、再生，并在低pH和溴甲酚绿平板筛选获得耐酸和产量提高F1代突变菌株AS-F1-8；然后将F1代菌株制备原生质体，进行第二轮基因组改组，连续经3轮基因组改组后筛选，获得耐酸性强且琥珀酸产量高的突变株AS-F3-2，该菌株在pH3.2条件下能够生长繁殖，在pH5.0条件下发酵36小时，产酸量为25.2g/L。
3.一种耐酸性高产琥珀酸的菌株制备方法，其特征在于，该耐酸性高产琥珀酸的菌株制备方法包括以下步骤：
步骤一，菌株诱变，对产琥珀酸放线杆菌菌株AS-R2分别进行紫外线诱变和亚硝基胍诱变；
步骤二，诱变菌株的筛选，在pH4.1的平板上筛选出经紫外线诱变和亚硝基胍诱变后耐酸性最强的菌落，刮到生理盐水中，梯度稀释，涂布于溴甲酚绿平板，厌氧培养箱内37℃下培养3～5d；挑选变色圈较大的菌落，记号笔做标记，分别挑取一环变色圈较大的菌落于发酵培养基中培养，并测琥珀酸产量；产量高的菌株继续用于基因组改组；
步骤三，第一轮基因组改组，以诱变筛选得到的多株突变株为出发菌株，制备原生质体，并对所制备的原生质体灭活，再融合，最后筛选F1代融合子；
第一轮基因组改组的融合子筛选：
对所得到的融合子悬液梯度稀释，涂布于再生平板，厌氧培养箱内37℃下避光培养3～5d，再生培养基上长出的菌落全都刮到生理盐水中，稀释涂布于pH3.8平板，厌氧培养箱内37℃下培养3～5d，耐酸平板上长出的菌落再刮到生理盐水中，梯度稀释涂布溴甲酚绿平板，厌氧培养箱内37℃下培养3～5d，挑选变色圈较大的菌落，并用记号笔做标记，分别将选定的变色圈较大的菌落各挑取一环于发酵培养基中，厌氧培养箱内37℃下培养，并测琥珀酸产量，筛选产量高的融合子是第一轮基因组改组得到的F1代突变株；
步骤四，第二轮基因组改组，以第一轮基因组改组得到的F1代突变株为出发菌株，继续原生质体制备、灭活与融合，并筛选F2代融合子；
第二轮基因组改组的融合子筛选：
对所得到的融合子悬液梯度稀释，涂布于再生平板，厌氧培养箱内37℃下避光培养3～5d，再生培养基上长出的菌落全都刮到生理盐水中，稀释涂布于pH3.5平板，厌氧培养箱内37℃下培养3～5d，耐酸平板上长出的菌落再刮到生理盐水中，梯度稀释涂布溴甲酚绿平板，厌氧培养箱内37℃下培养3～5d，挑选变色圈较大的菌落，并用记号笔做标记，分别将选定的变色圈较大的菌落各挑取一环于发酵培养基中，厌氧培养箱内37℃下培养，并测琥珀酸产量，筛选产量高的融合子是第二轮基因组改组得到的F2代突变株；
步骤五，第三轮基因组改组，以第二轮基因组改组得到的F2代突变株为出发菌株，继续原生质体制备、灭活与融合，并筛选F3代融合子；
第三轮基因组改组的融合子筛选：
对所得到的融合子悬液梯度稀释，涂布于再生平板，厌氧培养箱内37℃下避光培养3～5d；再生培养基上长出的菌落全都刮到生理盐水中，稀释涂布于耐pH3.2平板，厌氧培养箱内37℃下培养3～5d；耐酸平板上长出的菌落再刮到生理盐水中，梯度稀释涂布溴甲酚绿平板，厌氧培养箱内37℃下培养3～5d，挑选变色圈较大的菌落，并用记号笔做标记；分别将选定的变色圈较大的菌落各挑取一环于发酵培养基中，厌氧培养箱内37℃下培养，并测琥珀酸产量；筛选产量高的融合子，这是第三轮基因组改组得到的F3代突变株；
步骤六，对获得的F3代突变株传代10次，验证遗传稳定性，获得耐酸性强且琥珀酸产量高的突变株AS-F3-2。
4.如权利要求3所述的耐酸性高产琥珀酸的菌株制备方法，其特征在于，在步骤一中，菌株诱变的方法包括：
第一步，紫外线诱变：挑取原始菌株——产琥珀酸放线杆菌于装有活化培养基的试管中，活化24h，以3％接种量接种于装有活化培养基的试管中进行二次活化，活化24h，再以3％接种量接种于装有发酵培养基的三角瓶中，培养至对数期，取5ml于已灭菌的培养皿中，放入灭菌的磁力搅拌棒，紫外灯下30cm处于磁力搅拌器上紫外照射50s，时间到，关闭磁力搅拌器，取1ml诱变菌液于9ml生理盐水，梯度稀释至10-7，取梯度为10-5、10-6及10-7的菌液涂布于pH4.1平板上，每个梯度涂10个平板，于厌氧培养箱内37℃下避光培养3～5d；
第二步，亚硝基胍诱变：出发菌株培养至对数期，取4.75ml菌液，加入0.25ml亚硝基胍母液，终浓度为500μg/mL，于37℃保温90min，以冷的生理盐水稀释100倍，终止反应，生理盐水梯度稀释至10-7，取梯度为10-5、10-6及10-7的菌液涂布于耐pH 4.1平板上，每个梯度涂10个平板，于厌氧培养箱内37℃下避光培养3～5d。
5.如权利要求3所述的耐酸性高产琥珀酸的菌株制备方法，其特征在于，在步骤三中，出发菌株原生质体的制备方法：
挑取多株突变株各一环于活化培养基中活化一代，培养24h，按3％接种量二次活化于活化培养基中，培养24h，然后以3％接种量接种到含0～2.5％甘氨酸的发酵培养基中，培养2～14h，取10ml培养液于已灭菌的离心管中，以转速8000r/min离心15min，倒出上清液，菌体沉淀重悬于10ml渗透压稳定液中，离心洗涤菌体2次，菌体沉淀继续重悬于10ml渗透压稳定液中，摇匀后，加入终浓度为0.02～0.14mg/ml的溶菌酶溶液，在18～47℃水浴锅中恒温酶解20～80min；酶解完成后，从水浴锅中取出并以转速6000r/min离心15min，得到的沉淀以渗透压稳定液洗涤2次，沉淀重悬于10ml渗透压稳定液中，得到的悬液就是原生质体悬液。
6.如权利要求3所述的耐酸性高产琥珀酸的菌株制备方法，其特征在于，原生质体灭活方法：将各株突变株酶解得到的原生质体悬液等量混合均匀，再均分为两份，一份采取热灭活方式灭活，另一份采取紫外灭活方式灭活；
热灭活：将用于热灭活的原生质体悬液放于60℃水浴锅中，避光恒温灭活10～60min；紫外灭活：将用于紫外灭活的原生质体悬液均分，每份含原生质体悬液10ml，倒入已灭菌的培养皿中，放入灭菌的磁力搅拌棒，紫外灯下30cm处于磁力搅拌器上紫外照射15～40min。
7.如权利要求3所述的耐酸性高产琥珀酸的菌株制备方法，其特征在于，原生质体融合方法：取热灭活和紫外灭活后的原生质体悬液等体积混合均匀，加入40％聚乙二醇PEG 6000，在20℃条件下保温6min，以促融灭活的原生质体；融合完成后，从水浴锅中取出并以转速6000r/min离心15min，得到的沉淀以渗透压稳定液洗涤2次，沉淀重悬于渗透压稳定液中，所得到的悬液就是原生质体融合后的融合子悬液。
8.如权利要求3所述的耐酸性高产琥珀酸的菌株制备方法，其特征在于，融合子筛选方法：对所得到的融合子悬液梯度稀释，涂布于再生平板，厌氧培养箱内37℃下避光培养3～5d；再生培养基上长出的菌落全都刮到生理盐水中，稀释涂布于pH3.2平板，厌氧培养箱内37℃下培养3～5d；耐酸平板上长出的菌落再刮到生理盐水中，梯度稀释涂布溴甲酚绿平板，厌氧培养箱内37℃下培养3～5d，挑选变色圈较大的菌落，并用记号笔做标记；分别将选定的变色圈较大的菌落各挑取一环于发酵培养基中，厌氧培养箱内37℃下培养，并测琥珀酸产量。
9.如权利要求3所述的耐酸性高产琥珀酸的菌株制备方法，其特征在于，发酵培养基的制备方法：葡萄糖30g/L，酵母浸粉10g/L，Na2HPO40.3g/L，NaH2PO49.6g/L，K2HPO43g/L，MgCl20.4g/L，1mol/LNaOH溶液调至pH 7.0，121℃灭菌20min；耐酸平板培养基：发酵培养基的组分上，0.01mol/L盐酸溶液调至目的pH值，与琼脂添加量为2％的等体积蒸馏水分开灭菌后混合，121℃灭菌20min；溴甲酚绿平板培养基：发酵培养基的组分上，溴甲酚绿0.1％，琼脂1.5％，1mol/LNaOH溶液调至pH 7.0，121℃灭菌20min。
10.如权利要求3所述的耐酸性高产琥珀酸的菌株制备方法，其特征在于，活化培养基的制备方法：TSA培养基，配方为：胰蛋白胨15g/L，大豆蛋白胨5g/L，NaCl 5g/L，pH自然，121℃灭菌20min；亚硝基胍母液：取1g亚硝基胍加入10ml丙酮作为助溶剂，取1ml亚硝基胍丙酮溶液加入9ml磷酸盐缓冲液；渗透压稳定液：顺丁烯二酸2.33g/L，MgCl·6H2O 4.07g/L，蔗糖171.13g/L，pH 7.0，121℃灭菌20min；溶菌酶溶液：称取0.1g溶菌酶，将其溶解于10mL渗透压稳定液中，配制成10mg/mL的酶液，膜滤除菌，于4℃条件下保存备用；
再生双层培养基下层为发酵培养基再加入渗透压稳定液和2％琼脂；上层与下层相同，琼脂添加量改为0.5％。
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