CN104480013A - 雨生红球藻细胞破壁方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于微藻生物技术领域，涉及富含生物活性物质——虾青素的雨生红球藻细胞破壁技术。本发明雨生红球藻细胞的破壁由三部分组成：1.雨生红球藻细胞的冷冻和冰晶化，并将其分散在0℃以下的流动液体中；2.冰晶化的藻细胞在破壁前，在其液体中加有保护雨生红球藻的生物活性成分，降低其破壁后被氧化分解的保护剂；3.用胶体磨碾磨均匀后，进行超高压均质纳米机超高压破壁。本发明的破壁工艺是在低温、冷链和封闭避光的条件下进行，利用超高压均质纳米机的纳米破碎的特点进行破壁，具有快速、高效、无异物加入和能有效保护生物活性成分的优点。

Description

雨生红球藻细胞破壁方法

技术领域

本发明属于微藻生物技术领域，具体涉及富含虾青素生物活性物质的雨生红球藻细胞的破壁技术。

背景技术

雨生红球藻是一种生活在淡水中的单细胞绿藻，在特定的条件下能积累大量的类胡萝卜素，其中80%以上为虾青素及酯类。虾青素具有抗氧化、抗肿瘤和增加免疫力等重要的生理和生物学功能。

雨生红球藻细胞具有纤维素性的细胞壁，细胞壁厚，一般都在3-5微米，质地坚韧。伴随着培养技术的进步，虾青素的含量大幅度增加，已经突破5%，甚至能达到6%以上，虾青素的理论产量已经成倍增加，但是虾青素含量越高，红球藻细胞为了更好保护自己，其细胞纤维素性越增加，细胞壁越厚越坚韧，已经达到6-8微米，更难于破碎，细胞的破碎率直接影响着虾青素的提取率，直接影响实际产量，若采用一般的破壁的方法，如冻融法、超声波法、生物酶解法、高压均质机、胶体磨等一种或多种汇合进行破壁，破壁率也只能达到80-85%，所以破壁技术已经严重制约着雨生红球藻的养殖规模化发展和后续虾青素产业链的拓展，现目前已经成为雨生红球藻开发技术最突破的核心问题。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供了一种雨生红球藻细胞破壁的方法，可以高效的实现破碎坚韧、硬的纤维素的细胞厚壁，提高雨生红球藻活性物质的生物利用，并进一步提高提取的效率，同时有效保护生物活性物质。

本发明采用的技术方案如下：

一种细胞破壁方法，包括如下步骤：

步骤（1），细胞在0℃以下进行冷冻和冰晶化，然后将其碎成粉末并分散于0℃以下的液体中；其中细胞固含量与液体的质量比为1:3~1:5；

步骤（2），向步骤（1）的液体中加入抗氧化剂，其中抗氧化剂的加入量为细胞固含量的0.1%~0.5%，得到料液；所述的抗氧剂的加入量符合国家标准；

步骤（3），将步骤（2）得到的料液经机械碾磨混合均匀后，用高压均质纳米机进行瞬间超高压破壁，即得到细胞破壁液料；所述的破壁过程在冷链低温和避光封闭的条件下进行。

进一步，优选的是所述的细胞为微藻细胞。

进一步，优选的是所述的微藻细胞为雨生红球藻细胞。

进一步，优选的是步骤（1）所述的冷冻和冰晶化温度为-4℃至-35℃。

进一步，优选的是步骤（1）所述的液体温度为-4℃至-50℃。

进一步，优选的是步骤（1）所述的液体为食用酒精的水溶液，食用酒精与水的质量比为10:90-60:40。该液体也可由其他食品添加剂与水组成，只要以液体状态存在即可。

进一步，优选的是步骤（2）所述的抗氧化剂为维生素E、磷脂、丁基羟基茴香醚、没食子酸丙酯或特丁基对苯二酚，且均为食品级抗氧化剂。

进一步，优选的是步骤（3）所述的机械为胶体磨、砂轮磨或振荡磨。

进一步，优选的是步骤（3）所述的高压均质纳米机进行瞬间超高压破壁时，破壁压力为100mpa-180mpa，但不限于此，压力可以更高；破壁次数为至少一次。

进一步，优选的是步骤（3）所述的冷链低温的温度为20℃至-4℃，但不限于此，温度可以更低。

步骤（3）所述的避光密封的破壁条件为在不锈钢管路与机械连接的通道内进行。

进一步，优选的是所述的雨生红球藻细胞的破壁方法，包括如下步骤：

步骤（1），雨生红球藻细胞在-25℃至-45℃进行冷冻和冰晶化，然后将其碎成粉末并分散于-25℃至-45℃的质量浓度为30-45%的酒精水溶液中；其中雨生红球藻细胞固含量与液体的质量比为1:3.2~1:4；

步骤（2），向步骤（1）的液体中加入食品级抗氧化剂，其中食品级抗氧化剂的加入量为细胞固含量的0.2%~0.4%，得到料液；

步骤（3），将步骤（2）得到的料液经胶体磨碾磨混合均匀后，用高压均质纳米机进行瞬间超高压破壁，破壁压力为120mpa-130mpa，即得到细胞破壁液料；所述的破壁过程在冷链低温和避光封闭的条件下进行。

采用本发明方法可用于雨生红球藻细胞以外的其他微藻类细胞及其植物、生物的细胞进行破壁。

本发明的基本思路是通过把雨生红球藻细胞冷冻，使细胞冰晶化。由于低温使雨生红球藻细胞内的水分结冰，形成反膨胀，使细胞壁脆化，冷冻温度越低，效果越好，细胞壁越脆，然后用胶体磨或其他机械碾磨除去细胞壁表面上的绒毛，使细胞壁完全裸露出来，然后用纳米破碎技术，采用超高压均质纳米机，把冰晶化的雨生红球藻细胞破碎成纳米级颗粒，从而完成细胞破壁，同时在破壁过程中防止有效活性成分的氧化分解，加入抗氧化剂保护其活性物质。

本发明的基本理论，是根据伯努利定律（理想液体平稳流动时的能量守恒定律），超高压均质纳米机根据这一定律，用机械能使活塞高频率运动，获得比高压均质机更稳定液流，在超高压均质纳米机内的封闭管路内产生超高压力，并在出料口设置（封闭管路一头处）一个模块小口，装有调节缝隙大小的阻挡块和挡圈，液料在超高压的条件下以极快的速度通过下口缝隙，瞬间释放而失压，细胞内部产生向外的膨胀力而爆炸，使细胞壁破碎，同时液料以极快速度通过小口模块与阻挡块间的缝隙，产生了很大摩擦剪切力，并冲击着挡圈产生强烈的冲撞力，在这三种力同时作用下，把雨生红球藻细胞破碎成纳米颗粒，完成破壁。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

本发明的破壁工艺是在低温、冷链和封闭避光的条件下进行，利用超高压均质纳米机的纳米破碎的特点进行破壁，具有快速、高效、无异物加入和能有效保护生物活性成分的优点。

本发明方法能流程化连续生产，快速高效破壁，破壁在96%以上。

附图说明：

图1为雨生红球藻未经破壁的细胞显微镜图；

图2为本发明实施例1雨生红球藻藻泥破壁后显微镜图；

图3为本发明实施例2雨生红球藻藻粉破壁后显微镜图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

实施例1

雨生红球藻细胞破壁方法，包括如下步骤：

步骤（1），取压滤后的雨生红球藻湿藻泥50kg，其固含量为60%，得固含物质30kg，放入冷冻室于-25℃冷冻12小时后，测得湿藻泥温度为-18℃，敲碎成粉末状；

取食用酒精45kg与水55kg配成质量浓度为45%酒精溶液100kg，放在冷冻室，于-35℃冷冻12小时后测得酒精溶液为-25℃；然后将-18℃的藻泥湿粉，分散在其中；

步骤（2），向步骤（1）的酒精溶液中加入食品级抗氧化剂维生素E，加入量为90g，得到料液；

步骤（3），将步骤（2）得到的料液经胶体磨碾磨混合均匀后，用高压均质纳米机进行瞬间超高压破壁一次，压力为120-130mpa，得雨生红球藻细胞破壁液料；所述的破壁过程在冷链低温和避光封闭的条件下进行。

经显微镜检测，其破壁率在96%以上，如图2所示。

实施例2

雨生红球藻细胞破壁方法，包括如下步骤：

步骤（1），取食用酒精32kg与水48kg配成质量浓度为40%酒精溶液80kg，放在冷冻室，于-35℃冷冻10小时后测得酒精溶液为-25℃；然后取干燥的雨生红球藻粉末藻粉20kg分散在其中；

步骤（2），向步骤（1）的酒精溶液中加入食品级抗氧化剂磷脂，加入量为20g，得到料液；

步骤（3），将步骤（2）得到的料液经胶体磨碾磨混合均匀后，用高压均质纳米机进行瞬间超高压破壁一次，压力为120-130mpa，得雨生红球藻细胞破壁液料；所述的破壁过程在冷链低温和避光封闭的条件下进行。

经显微镜检测，其破壁率在96%以上，如图3所示。

实施例3

雨生红球藻细胞破壁方法，包括如下步骤：

步骤（1），取食用酒精24kg与水56kg配成质量浓度为30%的酒精溶液80kg，放在冷冻室，于-35℃冷冻18小时后测得酒精溶液为-30℃；然后取干燥的雨生红球藻片状藻粉25kg分散在其中；

步骤（2），向步骤（1）的酒精溶液中加入食品级抗氧化剂丁基羟基茴香醚，加入量为60g，得到料液；

步骤（3），将步骤（2）得到的料液经胶体磨碾磨混合均匀后，用高压均质纳米机进行瞬间超高压破壁一次，压力为120-130mpa，得雨生红球藻细胞破壁液料；所述的破壁过程在冷链低温和避光封闭的条件下进行。

经显微镜检测，其破壁率在96%以上。

实施例4

雨生红球藻细胞破壁方法，包括如下步骤：

步骤（1），取压滤后的雨生红球藻湿藻泥50kg，其固含量为60%，得固含物质30kg，放入冷冻室于-4℃冷冻50小时后，测得湿藻泥温度为-4℃，破碎成粉末状；

取食用酒精15kg与水135kg配成质量浓度为10%酒精溶液150kg，放在冷冻室，于-20℃冷冻3小时后测得酒精溶液为-4℃；然后将-4℃的藻泥湿粉，分散在其中；

步骤（2），向步骤（1）的酒精溶液中加入食品级抗氧化剂没食子酸丙酯，加入量为150g得到料液；

步骤（3），将步骤（2）得到的料液经胶体磨碾磨混合均匀后，用高压均质纳米机进行瞬间超高压破壁一次，压力为180-200mpa，得雨生红球藻细胞破壁液料；所述的破壁过程在冷链低温和避光封闭的条件下进行。冷链低温的温度为20℃至-4℃。

经显微镜检测，其破壁率在96%以上。

实施例5

雨生红球藻细胞破壁方法，包括如下步骤：

步骤（1），取压滤后的雨生红球藻湿藻泥50kg，其固含量为60%，得固含物质30kg，放入冷冻室于-35℃冷冻20小时后，测得湿藻泥温度为-30℃，敲碎成粉末状；

取食用酒精54kg与水36kg配成质量浓度为60%酒精溶液90kg，放在冷冻室，于-50℃冷冻72小时后测得酒精溶液为-50℃；然后将-30℃的藻泥湿粉，分散在其中；

步骤（2），向步骤（1）的酒精溶液中加入食品级抗氧化剂特丁基对苯二酚，加入量为120g得到料液；

步骤（3），将步骤（2）得到的料液经砂轮磨碾磨混合均匀后，用高压均质纳米机进行瞬间超高压破壁5次，压力为100-125mpa，得雨生红球藻细胞破壁液料；所述的破壁过程在冷链低温和避光封闭的条件下进行。冷链低温的温度为8℃至-5℃。

经显微镜检测，其破壁率在96%以上。

实施例6

雨生红球藻细胞破壁方法，包括如下步骤：

步骤（1），取压滤后的雨生红球藻湿藻泥50kg，其固含量为60%，得固含物质30kg，放入冷冻室于-45℃冷冻18小时后，测得湿藻泥温度为-36℃，敲碎成粉末状；

取食用酒精25kg与水75kg配成质量浓度为25%酒精溶液100kg，放在冷冻室，于-35℃冷冻32小时后测得酒精溶液为-33℃；然后将-36℃的藻泥湿粉，分散在其中；

步骤（2），向步骤（1）的酒精溶液中加入食品级抗氧化剂维生素E，加入量为90g，得到料液；

步骤（3），将步骤（2）得到的料液经振荡磨碾磨混合均匀后，用高压均质纳米机进行瞬间超高压破壁3次，压力为160-180mpa，得雨生红球藻细胞破壁液料；所述的破壁过程在冷链低温和避光封闭的条件下进行。冷链低温的温度为5℃至-10℃。

经显微镜检测，其破壁率在96%以上。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定                                                 。

Claims (10)

1.一种细胞破壁方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤（1），细胞在0℃以下进行冷冻和冰晶化，然后将其碎成粉末并分散于0℃以下的液体中；其中细胞固含量与液体的质量比为1:3~1:5；

步骤（2），向步骤（1）的液体中加入抗氧化剂，其中抗氧化剂的加入量为细胞固含量的0.1%~0.5%，得到料液；

步骤（3），将步骤（2）得到的料液经机械碾磨混合均匀后，用高压均质纳米机进行瞬间超高压破壁，即得到细胞破壁液料；所述的破壁过程在冷链低温和避光封闭的条件下进行。

2.根据权利要求1所述的细胞破壁方法，其特征在于所述的细胞为微藻细胞。

3.根据权利要求2所述的细胞破壁方法，其特征在于所述的微藻细胞为雨生红球藻细胞。

4.根据权利要求3所述的细胞破壁方法，其特征在于步骤（1）所述的冷冻和冰晶化温度为-4℃至-35℃。

5.根据权利要求3所述的细胞破壁方法，其特征在于步骤（1）所述的液体温度为-4℃至-50℃。

6.根据权利要求3所述的细胞破壁方法，其特征在于步骤（1）所述的液体为食用酒精的水溶液，食用酒精与水的质量比为10:90-60:40。

7.根据权利要求3所述的细胞破壁方法，其特征在于步骤（2）所述的抗氧化剂为维生素E、磷脂、丁基羟基茴香醚、没食子酸丙酯或特丁基对苯二酚，且均为食品级抗氧化剂。

8.根据权利要求3所述的细胞破壁方法，其特征在于步骤（3）所述的机械为胶体磨、砂轮磨或振荡磨。

9.根据权利要求3所述的细胞破壁方法，其特征在于步骤（3）所述的高压均质纳米机进行瞬间超高压破壁时，破壁压力为100mpa-180mpa；破壁次数为至少一次；所述的冷链低温的温度为20℃至-4℃。

10.根据权利要求9所述的细胞破壁方法，其特征在于所述的雨生红球藻细胞的破壁方法，包括如下步骤：

步骤（1），雨生红球藻细胞在-25℃至-45℃进行冷冻和冰晶化，然后将其碎成粉末并分散于-25℃至-45℃的质量浓度为30-45%的酒精水溶液中；其中雨生红球藻细胞固含量与液体的质量比为1:3.2~1:4；

步骤（2），向步骤（1）的液体中加入食品级抗氧化剂，其中食品级抗氧化剂的加入量为细胞固含量的0.2%~0.4%，得到料液；

步骤（3），将步骤（2）得到的料液经胶体磨碾磨混合均匀后，用高压均质纳米机进行瞬间超高压破壁，破壁压力为120mpa-130mpa，即得到细胞破壁液料；所述的破壁过程在冷链低温和避光封闭的条件下进行。