CN104459152A - 一种基于胶体金免疫层析技术的精子浓度快速检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于胶体金免疫层析技术，采用竞争法检测原理，以精子顶体蛋白为检测标志物，将精液稀释于缓冲液中，使精子顶体蛋白从精子细胞中释放至缓冲液中，再与免疫层析试纸条反应，得到检测结果，具有特异性更高的优势，避免了在检测临界值状态下检测线若隐若现，结果不易判读的缺点。

Description

一种基于胶体金免疫层析技术的精子浓度快速检测方法
技术领域
本发明涉及一种精子浓度检测方法，具体是一种基于胶体金免疫层析技术的精子浓度快速检测方法。 
背景技术
现有的胶体金免疫层析技术的基本原理是将已知的特异性抗原或抗体固定于硝酸纤维素膜上某一区带作为检测带，在样品区滴加待测样品后，借助毛细作用，待测样品泳动至胶体金膜，胶体金膜上的金标复合物溶解，并与待测样品进行抗原抗体反应，形成复合物，继续泳动至包被膜的检测区；带有胶体金标记的复合物被检测区抗原或抗体捕获，呈现红色条带。若待测样品中没有待测抗原或抗体，则不发生结合，即不显色。在硝酸纤维素膜检测区附近一般再固定上针对金标结合物相应的抗原或抗体作为质控带，无论样品中有无待测物，质控线都应显示，若没有显示，则检测失败。整个过程一般在15分钟内完成，操作简单、快速，且不需任何仪器。 
与常规的检测方法相比，层析技术具有操作简便、不需其它任何仪器设备，无需专业人员，携带方便，可随时随地进行。单个测试条成本极低，可立刻拿到结果，不必等待。稳定性好，可长期保存的优势。但是存在定量问题和灵敏度问题的缺陷。 
现有技术中检测精子浓度的方法，主要有经典的显微计数法，需借助仪器设备以及专业的操作人员才可以进行；比色法，特异性低，且色差会影响判读结果；免疫层析双抗体夹心法，在检测临界值状态下检测线若隐若现，结果不易判读。 
发明内容
本发明提供了一种精子浓度快速检测方法，是基于胶体金免疫层析技术，采用竞争法检测原理，定性检测经过预处理后的精液样本中的ACRV1。 
为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现： 
一种基于胶体金免疫层析技术的精子浓度快速检测方法，以精子顶体蛋白为检测标志物，将精液稀释于缓冲液中，使精子顶体蛋白从精子细胞中释放至缓冲液中，再与免疫层析试纸条反应，得到检测结果。 
进一步的，所述待测精液与缓冲液的体积比为1:3-5。 
进一步的，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，所述缓冲液中含有表面活性剂，所述表面活性剂为聚乙二醇辛基苯基醚，所述表面活性剂与缓冲液的质量比为1:80-120。 
进一步的，所述免疫层析试纸条包括样品垫、胶体金膜、包被膜、吸收垫、塑料板，所述样品垫的尾端位于胶体金膜首端的上面，所述胶体金膜的尾端位于包被膜首端的上面，所述包被膜的尾端位于吸收垫首端的下面，所述塑料板位于层析试纸的下面；所述包被膜上包被检测带T和质控线C，所述检测带T靠近胶体金膜一端，所述质控线C靠近吸收垫一端。 
进一步的，所述检测线T处包被由大肠杆菌重组表达的ACRV1蛋白，包被量为0.6-0.8μl/cm，所述ACRV1蛋白浓度为100-500μg/m。 
进一步的，所述质控线C处包被抗小鼠IgG抗体，包被量为0.6-0.8μl/cm，所述抗小鼠IgG抗体浓度为500-1000μg/ml。 
进一步的，所述胶体金膜为玻璃纤维膜，膜上负载金标ACRV1单克隆抗体。 
进一步的，所述金标ACRV1单克隆抗体的制备方法为：在胶体金溶液中加入金标ACRV1单克隆抗体，混匀，静置5min，加入牛血清白蛋白溶液，混匀，静置5min；高速离心收集沉淀，将沉淀用缓冲液定容至原胶体金溶液体积的1/10，得到金标ACRV1单克隆抗体。 
进一步的，所述胶体金溶液中按照30μg/ml的比例加入ACRV1抗体。 
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明首次采用免疫胶体金竞争法原理检测精子浓度，与比色法检测原理相比，特异性更高。与双抗体夹心法原理相比，通过对比检测线与质控线条带颜色的强弱进行结果判定，避免了在检测临界值状态下检测线若隐若现，结果不易判读的缺点。 
结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。 
附图说明
图1本发明的用于检测精子浓度的胶体金免疫层析试纸的结构图。 
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下将结合附图和实施例，对本发明作进一步详细说明。 
本发明以精子顶体蛋白为检测标志物，所述精子顶体蛋白10(Acrosomal Protein SP-10)，又名顶体泡蛋白1(Acrosomal vesicle protein 1，ACRV1)，是一种在成熟精子的顶体特异 性表达的蛋白，该蛋白在几乎所有人类精子样本中都能被检测到，且表达量稳定。在较温和的条件下，即可与精子细胞发生解离，以可溶状态存在于溶液中，是一种理想的检测精子浓度的免疫诊断标志物。本发明将固定体积的精液稀释于固定体积的含表面活性剂的缓冲液中进行预处理，使ACRV1蛋白从精子细胞中充分释放至缓冲液中，与层析试纸条反应，从而达到定性检测精子浓度的目的，应用于优生优育领域。 
所述待测精液与缓冲液的体积比为1:3-5，优选为1:4，所述缓冲液选用磷酸盐缓冲液，所述缓冲液中含有表面活性剂TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)，所述表面活性剂与缓冲液的质量比为1:80-120，优选为1:100。 
本发明依托层析试纸进行检测，如图1所示，所述层析试纸包括样品垫1、胶体金膜2、包被膜3、吸收垫4、塑料板5组成，所述样品垫的尾端位于胶体金膜首端的上面，所述胶体金膜的尾端位于包被膜首端的上面，所述包被膜的尾端位于吸收垫首端的下面，所述塑料板位于层析试纸的下面，用于支撑整个层析试纸；所述包被膜上包被检测带T6和质控线C7，所述检测带T靠近胶体金膜一端，所述质控线C靠近吸收垫一端。图中箭头方向为液体层析方向。 
所述样品垫为吸水纸；所述胶体金膜为玻璃纤维膜，膜上负载金标ACRV1单克隆抗体，为流动带；所述包被膜为硝酸纤维反应膜，所述检测线T处包被由大肠杆菌重组表达的ACRV1蛋白，包被量为0.6-0.8μl/cm，所述ACRV1蛋白浓度为100-500μg/ml；所述质控线C处包被抗小鼠IgG抗体，包被量为0.6-0.8μl/cm，所述抗小鼠IgG抗体浓度为500-1000μg/ml；所述吸收垫为吸水纸。 
本发明的金标ACRV1单克隆抗体的制备方法具体为：在胶体金溶液中按照30μg/ml的比例加入ACRV1单克隆抗体，即每1000mL胶体金溶液需加入重量为30mg的ACRV1单克隆抗体，混匀，静置5分钟，然后加入终体积为1％的牛血清白蛋白(BSA)溶液，混匀，静置5分钟；高速离心收集沉淀，将沉淀用缓冲液定容至原胶体金溶液体积的1/10。 
将制备好的金标ACRV1单克隆抗体通过喷金仪以5-10μL/cm的量均匀喷淋至玻璃纤维素上，干燥后即得胶体金膜。 
检测时，将待测样本滴加到样品垫1上，通过层析作用，待测样本中的ACRV1与胶体金膜2上负载的金标ACRV1单克隆抗体结合，结合物层析到达包被膜3沿硝酸纤维素膜移动，与检测线T上的重组ACRV1蛋白结合，出现红色反应线。 
当待测样本中ACRV1浓度高时，金标ACRV1单克隆抗体上的抗原识别位点大部分或全部被封闭，结合物层析到达检测线T时，将没有或有少部分的金标ACRV1单克隆抗体与检测线T上的重组ACRV1蛋白结合，因此在检测带T处不会出现条带或出现颜色较弱的条 带。 
当待测样本中ACRV1浓度低时，金标ACRV1单克隆抗体上的抗原识别位点只有小部分被封闭，结合物层析到达检测线T时，将与检测线T上的重组ACRV1蛋白结合，出现较深红色条带。 
无论待测样本中ACRV1浓度高或低，当结合物继续层析至包被有抗小鼠IgG抗体的质控线C时，均会出现一条红色条带。如果检测线T没有显色，或显色弱于质控线C，或显色与质控线C颜色相近时，则提示阳性结果，说明被测者精子浓度达到正常标准。如果检测线T颜色深于质控线C，则提示阴性结果，说明被测者精子浓度未达到正常标准。如果质控线C不显色，无论检测线T显色与否，说明产品自身或操作过程存在问题，该次检测结果无效。检验结果的解释如下表所示，质控线C显色时，检测线T显色越弱，说明精子浓度越高。若C线没有显色，说明检测失败或产品失效。 
本发明首次采用免疫免疫胶体金竞争法原理检测精子浓度，在临床验证过程中共测定了209份样本，其中阳性样本78份，阴性样本131份，检测的灵敏度、特异性和总符合率均超过98％。 
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。 

Claims (9)

1.一种基于胶体金免疫层析技术的精子浓度快速检测方法，其特征在于：以精子顶体蛋白为检测标志物，将精液稀释于缓冲液中，使精子顶体蛋白从精子细胞中释放至缓冲液中，再与免疫层析试纸条反应，得到检测结果。
2.根据权利要求1所述的一种基于胶体金免疫层析技术的精子浓度快速检测方法，其特征在于：所述待测精液与缓冲液的体积比为1:3-5。
3.根据权利要求1所述的一种基于胶体金免疫层析技术的精子浓度快速检测方法，其特征在于：所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，所述缓冲液中含有表面活性剂，所述表面活性剂为聚乙二醇辛基苯基醚，所述表面活性剂与缓冲液的质量比为1:80-120。
4.根据权利要求1所述的一种基于胶体金免疫层析技术的精子浓度快速检测方法，其特征在于：所述免疫层析试纸条包括样品垫、胶体金膜、包被膜、吸收垫、塑料板，所述样品垫的尾端位于胶体金膜首端的上面，所述胶体金膜的尾端位于包被膜首端的上面，所述包被膜的尾端位于吸收垫首端的下面，所述塑料板位于层析试纸的下面；所述包被膜上包被检测带T和质控线C，所述检测带T靠近胶体金膜一端，所述质控线C靠近吸收垫一端。
5.根据权利要求4所述的一种基于胶体金免疫层析技术的精子浓度快速检测方法，其特征在于：所述检测线T处包被由大肠杆菌重组表达的ACRV1蛋白，包被量为0.6-0.8μl/cm，所述ACRV1蛋白浓度为100-500μg/m。
6.根据权利要求4所述的一种基于胶体金免疫层析技术的精子浓度快速检测方法，其特征在于：所述质控线C处包被抗小鼠IgG 抗体，包被量为0.6-0.8μl/cm，所述抗小鼠IgG 抗体浓度为500-1000μg/ml。
7.根据权利要求4所述的一种基于胶体金免疫层析技术的精子浓度快速检测方法，其特征在于：所述胶体金膜为玻璃纤维膜，膜上负载金标ACRV1单克隆抗体。
8.根据权利要求7所述的一种基于胶体金免疫层析技术的精子浓度快速检测方法，其特征在于：所述金标ACRV1单克隆抗体的制备方法为：在胶体金溶液中加入金标ACRV1单克隆抗体，混匀，静置5min，加入牛血清白蛋白溶液，混匀，静置5min；高速离心收集沉淀，将沉淀用缓冲液定容至原胶体金溶液体积的1/10，得到金标ACRV1单克隆抗体。
9.根据权利要求8所述的一种基于胶体金免疫层析技术的精子浓度快速检测方法，其特征在于：所述胶体金溶液中按照30μg/ml的比例加入ACRV1抗体。
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