CN104450804B - 一种削弱丙酮酸分解代谢强化丙酮酸积累的方法 - Google Patents

一种削弱丙酮酸分解代谢强化丙酮酸积累的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104450804B
CN104450804B CN201410665313.9A CN201410665313A CN104450804B CN 104450804 B CN104450804 B CN 104450804B CN 201410665313 A CN201410665313 A CN 201410665313A CN 104450804 B CN104450804 B CN 104450804B
Authority
CN
China
Prior art keywords
glabrata
hph
lat1
lipolytica
acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201410665313.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104450804A (zh
Inventor
陈坚
周景文
郭洪伟
吕永坤
堵国成
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Original Assignee
Jiangnan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University filed Critical Jiangnan University
Priority to CN201410665313.9A priority Critical patent/CN104450804B/zh
Priority to US14/583,260 priority patent/US9518275B2/en
Publication of CN104450804A publication Critical patent/CN104450804A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104450804B publication Critical patent/CN104450804B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01012—Dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase (2.3.1.12)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种削弱丙酮酸分解代谢强化丙酮酸积累的方法，属于代谢工程领域。本发明通过过表达二氢硫辛酰胺乙酰转移酶或其保守活性位点突变的突变体，不仅使丙酮酸脱氢酶催化活力下降，削弱丙酮酸经三羧酸循环分解代谢；而且在不致死细胞的前提下，有效强化了丙酮酸的积累。因此，过量表达活性位点突变二氢硫辛酰胺乙酰转移酶突变体是一种强化丙酮酸积累的有效手段。

Description

一种削弱丙酮酸分解代谢强化丙酮酸积累的方法
技术领域
本发明涉及一种削弱丙酮酸分解代谢强化丙酮酸积累的方法，尤其是一种削弱丙酮酸脱氢酶催化活力降低丙酮酸分解代谢的方法，属于代谢工程领域。
背景技术
丙酮酸作为微生物细胞内三羧酸循环(TCA)途径中重要中间产物之一，参与微生物细胞的多种代谢活动。不仅是三羧酸循环中的关键节点，在生物体内参与氨基酸、蛋白质、维生素的合成以及能量代谢，与三羧酸循环中其他代谢中间产物相比，丙酮酸在微生物细胞内代谢积累受到多种调控作用。因此，揭示丙酮酸在微生物细胞内代谢积累及调控机制具有重要的研究意义，并对强化细胞内其他三羧酸循环中代谢产物积累具有指导意义。丙酮酸是重要的化工合成中间体，在氨基酸、维生素和其它小分子物质合成，在医药、有机合成、营养强化剂等领域都有着重要的应用前景。传统化学合成法生产该有机酸因合成线路长，反应过程复杂，而且利用氰化物等对人体有毒害化合物阻止了化学合成法生产的丙酮酸在医药和食品等高附加值产品中的应用。利用微生物法发酵生产丙酮酸不仅能减少对化石能源供应的依赖，并且以可再生的生物质为原料具有环境友好，经济可以持续性等优点。
微生物法生产丙酮酸过程中存在目标代谢产物浓度低、生产强度低等不利因素。在严格耗氧微生物细胞中，丙酮酸处于能量代谢供应的关键位置，采用基因敲除技术对中心代谢途径的改造存在着影响微生物细胞生长甚至致死的风险。本发明在不致死微生物细胞的前提下，通过降低丙酮酸分解代谢，有效强化了丙酮酸的积累。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种削弱丙酮酸分解强化丙酮酸积累的方法，通过在宿主菌株细胞中表达二氢硫辛酰胺乙酰转移酶或其保守活性位点发生突变的突变体，得到丙酮酸脱氢酶活力降低的重组菌，重组菌丙酮酸分解代谢降低，丙酮酸积累得到强化。
所示宿主菌株是酵母或其他真菌。
在本发明的一种实施方式中，过量表达二氢硫辛酰胺乙酰转移酶，改变丙酮酸脱氢酶系天然组装化学计量学平衡，干扰丙酮酸脱氢酶和二氢硫辛酰胺脱氢酶与二氢硫辛酰胺乙酰转移酶组装，使得重组菌株细胞内的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶活力上升，而细胞内的丙酮酸脱氢酶催化活力下降，从而强化丙酮酸积累。
在本发明的一种实施方式中，将二氢硫辛酰胺乙酰转移酶的保守活性组氨酸和天冬氨酸 残基分别突变成丙氨酸残基，改变这些位点与底物之间相互作用的作用力，使得丙酮酸脱氢酶的催化活力下降，使菌株积累的丙酮酸含量大幅增加。
在本发明的一种实施方式中，将解脂亚洛酵母的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶的保守活性组氨酸和天冬氨酸残基分别突变成丙氨酸残基，得到丙酮酸积累增强的重组菌。
在本发明的一种实施方式中，所述的来源于解脂亚洛酵母二氢硫辛酰胺乙酰转移酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，将其第409的组氨酸和第413的天冬氨酸残基分别突变为丙氨酸，得到丙酮酸积累增强的重组菌。
在本发明的一种实施方式中，将光滑球拟酵母的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶的保守活性组氨酸和天冬氨酸残基分别突变成丙氨酸残基，得到丙酮酸积累增强的重组菌。
在本发明的一种实施方式中，所述的来源于光滑球拟酵母二氢硫辛酰胺乙酰转移酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示，将其第442的组氨酸和第446的天冬氨酸残基分别突变为丙氨酸，得到丙酮酸积累增强的重组菌。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种丙酮酸积累增强的解脂亚洛酵母重组菌，是通过在解脂亚洛酵母中过表达二氢硫辛酰胺乙酰转移酶或保守活性位点发生突变的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶得到。
在本发明的一种实施方式中，所述解脂亚洛酵母重组菌是以解脂亚洛酵母WSH-Z06CCTCC NO：M20714为出发菌株。
在本发明的一种实施方式中，所述的来源于解脂亚洛酵母二氢硫辛酰胺乙酰转移酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，通过在解脂亚洛酵母中过表达保守活性位点第409位组氨酸突变成丙氨酸的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶得到重组菌。
在本发明的一种实施方式中，通过在解脂亚洛酵母中过表达保守活性位点第413位天冬氨酸突变成丙氨酸的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶得到重组菌。
在本发明的一种实施方式中，所述解脂亚洛酵母重组菌的构建方法主要包括以下步骤：(1)构建表达目的基因所用的整合型表达载体：扩增潮霉素磷酸转移酶hph基因，hph基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，利用限制性内切酶Stu I与Hind III同时处理扩增得到的hph基因和p0质粒，并连接两酶切产物得到含有潮霉素转磷酸移酶为筛选标记的整合型表达载体p0(hph)；(2)构建重组整合型表达质粒：根据NCBI公开的序列，全化学合成编码来源于解脂亚洛酵母二氢硫辛酰胺乙酰转移酶编码基因LAT1的开放阅读框序列，分别利用限制内切酶Bam HI和Eco RI切割LAT1的开放阅读框整合型表达载体p0(hph)，连接获得重组表 达质粒p0(hph)-LAT1；(3)分别设计突变引物对H409A-F/H409A-R和D413A-F/D413A-R对LAT1编码的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶的第409组氨酸残基和第413天冬氨酸残基突变为丙氨酸残基，分别获得p0(hph)-409A和p0(hph)-413A整合型质粒；(4)将所得的p0(hph)-LAT1、p0(hph)-409A和p0(hph)-413A质粒转化Y.lipolytica WSH-Z06：利用电穿孔转化方法将被限制性内切酶Avr II线性化的重组整合型表达质粒转化野生型Y.lipolytica WSH-Z06，验证筛选阳性转化子，分别获得Y.lipolytica-K、Y.lipolytica-409A和Y.lipolytica-413A菌株。
质粒p0的构建方法参见文献：Swennen D,Paul MF,Vernis L,Beckerich JM,Fournier A,Gaillardin C.Secretion of active anti-Ras single-chain Fv antibodyby the yeasts Yarrowia lipolytica and Kluyveromyces lactis.Microbiology-Sgm,2002.148:41-50。
所述解脂亚洛酵母WSH-Z06从中国典型培养物保藏中心CCTCC获得，菌种保藏编号为CCTCC NO：M20714。
与野生型Y.lipolytica WSH-Z06菌株相比，表达原始二氢硫辛酰胺乙酰转移酶的菌株Y.lipolytica-K细胞内丙酮酸脱氢酶催化活力是出发菌株的86.5％，其细胞外积累的丙酮酸含量上升至24.5g/L；过量表达第409位组氨酸突变为丙氨酸的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶突变体的重组菌株Y.lipolytica-409A的生物量下降至出发菌株的22.0％，细胞内丙酮酸脱氢酶催化活力下降35.2％，此时细胞外积累的丙酮酸从20.5g·L-1上升至38.6g·L-1；过量表达第413位天冬氨酸突变为丙氨酸的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶突变体的重组菌株Y.lipolytica-413A的的生物量下降至出发菌株的26.2％，细胞内丙酮酸脱氢酶催化活力下降32.2％，细胞外积累的丙酮酸从20.5g·L-1上升至39.9g·L-1。
本发明要解决的第三个技术问题是提供一种丙酮酸积累增强的光滑球拟酵母重组菌，是通过在光滑球拟酵母中过表达二氢硫辛酰胺乙酰转移酶或保守活性位点发生突变的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶得到。
在本发明的一种实施方式中，通过在光滑球拟酵母中过表达保守活性位点第442位组氨酸突变成成丙氨酸的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶得到重组菌。
在本发明的一种实施方式中，通过在光滑球拟酵母中过表达保守活性位点第446位天冬氨酸突变成丙氨酸的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶得到重组菌。
在本发明的一种实施方式中，所述的来源于光滑球拟酵母二氢硫辛酰胺乙酰转移酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述光滑球拟酵母重组菌的构建方法主要包括以下步骤：(1)根据NCBI公开的序列，全化学合成编码来源于光滑球拟酵母二氢硫辛酰胺乙酰转移酶 编码基因LAT1的开放阅读框序列，分别利用限制内切酶Spe I和Bam HI切割LAT1的开放阅读框和整合型表达载体pRS306TEF1，连接获得重组表达质粒pRS306TEF1-LAT1；(2)分别设计突变引物对H442A-F/H442A-R和D446A-F/D446A-R对LAT1编码的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶的第442组氨酸残基和第446天冬氨酸残基突变为丙氨酸残基，分别获得pRS306TEF1-442A和pRS306TEF1-446A整合型质粒；(4)将所得的pRS306TEF1-LAT1、pRS306TEF1-442A和pRS306TEF1-446A质粒转化T.glabrata CCTCC M202019△ura3，在YNB培养基平板中筛选原养型细胞，验证筛选阳性转化子，分别获得T.glabrata-C、T.glabrata-442A和T.glabrata-446A菌株。
所述光滑球拟酵母从中国典型培养物保藏中心CCTCC获得，菌种保藏编号为CCTCCM202019。该野生型酵母URA3编码基因被敲除后，得到一株尿嘧啶营养缺陷型菌株T.glabrata CCTCC M202019△ura3。
与出发菌株相比：表达野生型二氢硫辛酰胺乙酰转移酶的T.glabrata-C菌株，生物量下降至出发菌株的81.5％，细胞内丙酮酸脱氢酶催化活力下降了21.2％，细胞外积累的丙酮酸从49.4g·L-1上升至56.8g·L-1；表达第442位组氨酸突变为丙氨酸的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶突变体的重组菌株T.glabrata-442A，生物量下降至出发菌株的30.2％，细胞内丙酮酸脱氢酶催化活力下降48.2％，此时细胞外积累的丙酮酸从49.4g·L-1上升至68.6g·L-1；过量表达第446位天冬氨酸突变为丙氨酸的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶突变体的重组菌株T.glabrata-446A，细胞生长下降至出发菌株的36.3％，细胞内丙酮酸脱氢酶催化活力下降51.8％，细胞外积累的丙酮酸从49.4g·L-1上升至74.3g·L-1。
本发明要解决的第四个技术问题是提供一种发酵生产丙酮酸的方法，是以过表达二氢硫辛酰胺乙酰转移酶或保守活性位点发生突变的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶的重组菌为生产菌株。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌是以解脂亚洛酵母为出发菌株，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶的第409位的组氨酸或第413的天冬氨酸残基分别突变为丙氨酸后，在解脂亚洛酵母中过表达得到。
以上述重组解脂亚洛酵母发酵生产丙酮酸时，采用的种子培养基含有：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KH2PO4 1g/L，调pH为5.5；采用的发酵培养基含有：甘油100g/L，(NH4)2SO4 3g/L，KH2PO4 3g/L，MgSO4·7H2O 1.2g/L，NaCl 0.5g/L，K2HPO40.1g/L，盐酸硫胺素2×10-7g/L，调pH为5.0后再加入20g/L CaCO3。将所得重组菌接种至种子培养基中，28℃、200rpm，培养16-18小时；按10％的接种量从种子培养基中接种到含有1.5L发酵培养基的3L发酵罐中，培养温度为28℃、搅拌转数为200rpm，培养144小时。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌是以光滑球拟酵母为出发菌株，将氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶的第442位的组氨酸或第446的天冬氨酸分别突变为丙氨酸后，在光滑球拟酵母中过表达得到。
以上述重组光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸时，采用的种子培养基含有：葡萄糖20g·L-1，蛋白胨10g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5g·L-1，KH2PO4 1g·L-1，调pH为5.5；采用的发酵培养基含有：葡萄糖100g·L-1，NH4Cl7g·L-1，KH2PO4 5g·L-1，MgSO4·7H2O 0.8g·L-1，乙酸钠6g·L-1，烟酸4mg·L-1，盐酸硫胺素30μg·L-1，烟酸吡哆醇100μg·L-1，生物素10μg·L-1，核黄素50μg·L-1，培养基初始pH5.0，维生素液过滤除菌后加入。将所得重组光滑球拟酵母接种至含有25mL种子培养基的250mL三角摇瓶中，28℃、200rpmin，培养24小时；按10％(v/v)的接种量接入3L发酵罐中，发酵培养基装液量为1.5L，发酵罐培养条件为通气量4vvm，搅拌转速400r/min，温度30℃，通过自动流加泵流加浓度为8mol·L-1 NaOH和2mol·L-1 HCl维持培养基pH控制在稳定范围内，培养80小时。
本发明的有益之处：本发明通过过量表达二氢硫辛酰胺乙酰转移酶保守活性位点突变突体，不仅避免了切断微生物细胞能量供应，降低了微生物细胞内丙酮酸脱氢酶催化活力，削弱了丙酮酸分解代谢，致使细胞外积累的丙酮酸明显提高。
附图说明
图1表达二氢硫辛酰胺乙酰转移酶突变体的重组菌株生长变化。(A)解脂亚洛酵母重组菌株生长变化，Y.lipolytica-WSHZ06(□)，Y.lipolytica-K(○)，Y.lipolytica-409A(△)，Y.lipolytica-413A(▽)；(B)光滑球拟酵母重组菌株生长变化，T.glabrata CCTCCM202019△ura3(□)，T.glabrata-C(○)，T.glabrata-442A(△)，T.glabrata-446A(▽)。
图2表达二氢硫辛酰胺乙酰转移酶突变体的重组菌株丙酮酸脱氢酶催化活力变化。(A)解脂亚洛酵母重组菌株细胞内丙酮酸脱氢酶活性；(B)解脂亚洛酵母重组菌株细胞内二氢硫辛酰胺乙酰转移酶活性；(C)光滑球拟酵母菌株细胞内丙酮酸脱氢酶活性；(D)光滑球拟酵母菌株细胞内二氢硫辛酰胺乙酰转移酶活性。
图3解脂亚洛酵母重组菌株发酵产丙酮酸含量变化。(A)Y.lipolytica WSH-Z06(B)Y lipolytica-K；(C)Y.lipolytica-409A；(D)Y.lipolytica-413A。菌体干重(□)，甘油(○)，丙酮酸(△)。
图4光滑球拟酵母重组菌株发酵产丙酮酸含量变化。(A)T.glabrata CCTCCM202019△ura3；(B)T.glabrata-C；(C)T.glabrata-442A；(D)T.glabrata-442A。菌体干重(□)，葡萄 糖(○)，丙酮酸(△)。
具体实施方式
YPD培养基(g·L-1)：蛋白胨10，酵母浸膏5，葡萄糖10，固体培养基另加20g·L-1琼脂。解脂亚洛酵母转化子筛选时加入潮霉素B至终浓度为400mg·L-1。
YNB培养基(g·L-1)：葡萄糖10，(NH4)2SO4 0.67，pH6。
解脂亚洛酵母种子培养基(g·L-1)：葡萄糖20，蛋白胨10，MgSO4·7H2O 0.5，KH2PO41.0。用稀盐酸调pH至5.5，115℃维持15min灭菌。固体斜面另添加20g·L-1琼脂粉。
解脂亚洛酵母发酵培养基(g·L-1)：甘油100，(NH4)2SO4 3，KH2PO4 3，MgSO4·7H2O1.2，NaCl 0.5，K2HPO4 0.1，盐酸硫胺素2×10-7，pH＝4.5。115℃，灭菌15min。接种前加入121℃灭菌30min的CaCO3至含量为20g·L-1。
光滑球拟酵母种子培养基(g·L-1)：葡萄糖20g·L-1，蛋白胨10g·L-1，MgSO4·7H2O0.5g·L-1，KH2PO4 1g·L-1，调pH为5.5，115℃维持15min灭菌。固体斜面另添加20g·L-1琼脂粉。
光滑球拟酵母发酵培养基(g·L-1)：葡萄糖120g·L-1，NH4Cl 7g·L-1，KH2PO45g·L-1，MgSO4·7H2O 0.8g·L-1，乙酸钠6g·L-1，烟酸4mg·L-1，盐酸硫胺素30μg·L-1，烟酸吡哆醇100μg·L-1，生物素10μg·L-1，核黄素50μg·L-1。培养基初始pH5.0。维生素液过滤除菌后加入。接种前加入121℃灭菌30min的CaCO3至含量为20g·L-1。
解脂亚洛酵母Y.lipolytica WSH-Z06从中国典型培养物保藏中心CCTCC获得，菌种编号为CCTCC NO：M20714。光滑球拟酵母从典型培养物保藏中心CCTCC获得，菌种编号为CCTCC NO：M202019。
生物量测定方法：在570nm处用分光光度计测定其吸光光度值，单位体积内菌体干重计算如下：
OD570:菌体干重(g·L-1)＝1:0.223
丙酮酸脱氢酶催化活力测定：离心收集处于指数生长期的细胞，用0.9％生理盐水洗涤，用10mL 0.1M KH2PO4-K2HPO4 1mM EDTA 0.01mM DTT pH 7.5缓冲液悬浮细胞，在4℃条件下，加入酸洗玻璃珠研磨5min，13000×g离心10min，上清液用于丙酮酸脱氢酶催化活力测定测定。将0.5ml细胞破碎上清液，加入至含有50mM HEPES、0.1％曲拉通X-100、1.0mMMgCl2、5.0mM丙酮酸、0.2mM焦磷酸硫胺素、2.0mM NAD+、0.1mM CoA,pH＝7.4的反应混合液中至总体积为3mL，在30℃，340nm条件下检测NADH含量变化，1U的丙酮酸脱氢酶催化活力定义为：单位时间内生成1μmol的NADH所需要的酶量。
二氢硫辛酰胺乙酰转移酶催化活力测定：取一定量的细胞破碎上清液，加入至含有1.19 mM Tris-HCL缓冲液pH 8.0、0.07mM乙酰磷酸、0.042mM二氢硫辛酰胺的95％乙醇溶液，0.07μM CoA、7U磷酸乙酰转移酶、0.83M乙酸钠的3mL溶液中，在240nm处监测吸光值变化，1U的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶催化活力定义为：单位时间内生成1μmol S-acetydihydrolipoamide所需要的酶量。
细胞外丙酮酸：将发酵培养液13000×g离心，取适量上清液，用超纯水稀释50倍，过过0.22μm滤膜，用于HPLC分析。HPLC条件：Aminex HPX-87H ion exchange column；流动相：5mmol·L-1硫酸溶液(550μL浓硫酸定容到2L)，用0.22μm孔径的微滤膜抽滤并脱气；柱温：35℃；进样量：10μL；流速：0.6mL·min-1。紫外检测器检测：波长210nm。
酵母转化方法：将在YPD培养基上长出的新鲜酵母单菌落转接至液体YPD培养基中，28℃，200rpm，过夜培养。按10％接种量转接至新鲜的液体YPD培养基中28℃，200rpm培养至OD600＝1.2左右，离心收集细胞，于30℃用8mL 100mmol·L-1 LiAc,10mmol·L-1 DTT,0.6mol·L-1 sorbitol 10mmol·L-1 Tris-HCL，pH＝7.5缓冲液处理8×108细胞。离心收集细胞，用5mL预冷的1mol·L-1的sorbitol洗涤细胞三次，并用1mol·L-1的sorbitol悬浮细胞至1010细胞·mL-1。加入1μg整合型载体至细胞悬浮液中，置于冰上温孕5分钟，将该混合物转移至预冷的0.2cm电转杯中，电击，电击条件为2.5KV，25μF，200Ω，立即加入1mL预冷的1mol·L-1 sorbitol,室温静置1小时，将0.2mL电击产物涂布筛选平板上。解脂亚洛酵母电击产物涂布于含有400mg·L-1的潮霉素B的YPD培养基的平板中，光滑球拟酵母电击产物涂布于YNB培养基的平板中。于28℃培养48-72小时。将筛选平板中的转化子接种于含有25ml的YPD培养基中，并提取培养物基因组用于阳性转化子筛选。分别用引物对VBFVBK、VTB/VTC对解脂亚洛酵母和光滑球拟酵母进行验证。
表1 本发明中用到的引物
实施例1 表达二氢硫辛酰胺乙酰转移酶突变体对菌体细胞生长影响
(1)构建表达目的基因所用的整合型表达载体：扩增潮霉素磷酸转移酶hph基因，hph基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，利用限制性内切酶Stu I与Hind III同时处理扩增得到的hph基因和p0质粒，并连接两酶切产物得到含有潮霉素转磷酸移酶为筛选标记的整合型表达载体p0(hph)；(2)构建重组整合型表达质粒：根据NCBI公开的序列，全化学合成编码来源于解脂亚洛酵母二氢硫辛酰胺乙酰转移酶编码基因LAT1的开放阅读框序列，分别利用限制内切酶Bam HI和Eco RI切割LAT1的开放阅读框和整合型表达载体p0(hph)，连接获得重组表达质粒p0(hph)-LAT1；(3)以p0(hph)-LAT1为模版，分别设计突变引物对H409A-F/H409A-R和D413A-F/D413A-R，将LAT1编码的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶的第409组氨酸残基和第413天冬氨酸残基突变为丙氨酸残基，分别获得p0(hph)-409A和p0(hph)-413A整合型质粒；(4)将所得的p0(hph)-LAT1、p0(hph)-409A和p0(hph)-413A质粒转化Y.lipolytica WSH-Z06：利用电穿孔转化方法将被限制性内切酶AvrII线性化的重组整合型表达质粒转化野生型Y.lipolytica WSH-Z06，在含有400mg·L-1的潮霉素B的筛选平板上挑选转化子，提取转化子的基因组DNA用于整合型表达的验证。利用含有上述转化子的基因组DNA为模板，并以验证引物对VBF/VBK(表1)验证筛选阳性转化子，分别获得Y.lipolytica-K、Y.lipolytica-409A和Y.lipolytica-413A菌株。
质粒pUB4-CRE的构建方法参见文献Fickers P,Le Dall MT,Gaillardin C,Thonart P,Nicaud JM.New disruption cassettes for rapid gene disruption andmarker rescue in the yeast Yarrowia lipolytica.Journal of MicrobiologicalMethods,2003.55(3):727-737。
质粒p0的构建方法参见文献Swennen D,Paul MF,Vernis L,Beckerich JM,Fournier A,Gaillardin C.Secretion of active anti-Ras single-chain Fv antibodyby the yeasts Yarrowia lipolytica and Kluyveromyces lactis.Microbiology-Sgm,2002.148:41-50。
将野生型Y.lipolytica WSH-Z06菌株、重组菌株Y.lipolytica-K细胞、Y.lipolytica-409A和Y.lipolytica-413A同时接种于含有0.2ml YPD培养基的96孔板中，在28℃，200rpm条件下培养，对比菌株生长情况。经过10h培养，与Y.lipolytica WSH-Z06菌株细胞相比，重组菌株Y.lipolytica-K和Y.lipolytica-409A生物量分别下降至出发菌株的86.2％和22.0％；过量 表达二氢硫辛酰胺乙酰转移酶第413天冬氨酸活性氨基酸缺失突变体的重组菌株Y.lipolytica-413A细胞生长下降至出发菌株的26.2％。(图1中A)。
用相同的转化方法将来源于光滑球拟酵母的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶及其第442组氨酸残基和第446天冬氨酸残基突变为丙氨酸残基的突变体转化尿嘧啶营养缺陷型菌株T.glabrata CCTCC M202019△ura3，提取在YNB平板上的原养型细胞的基因组，并上述转化子的基因组DNA为模板，并以验证引物对VTB/VTC(表1)验证筛选阳性转化子，分别获得T.glabrata-C、T.glabrata-442A和T.glabrata-446A菌株。
光滑球拟酵母尿嘧啶缺陷型菌株的构建方法参见文献Zhou J,Dong Z,Liu L,DuG,Chen J.A reusable method for construction of non-marker large fragmentdeletion yeast auxotroph strains:A practice in Torulopsis glabrata.Journal ofMicrobiological Methods.2009；76:70-74.
将T.glabrata CCTCC M202019△ura3、T.glabrata-C、T.glabrata-442A和T.glabrata-446A菌株同时接种于含有0.2ml YPD培养基的96孔板中，在28℃，200rpm条件下培养，对比菌株生长情况。经过10h培养，与出发菌株细胞相比，表达野生型二氢硫辛酰胺乙酰转移酶的T.glabrata-C和重组菌株T.glabrata-442A生物量分别下降至出发菌株的81.5％和30.2％；过量表达二氢硫辛酰胺乙酰转移酶第446天冬氨酸活性氨基酸缺失突变体的重组菌株T.glabrata-446A细胞生长下降至出发菌株的36.3％。(图1中B)。
实施例2 表达二氢硫辛酰胺乙酰转移酶突变体降低丙酮酸脱氢酶催化活力
将野生型Y.lipolytica WSH-Z06菌株、重组菌株Y.lipolytica-K、Y.lipolytica-409A和Y.lipolytica-413A同时接种至含有20ml YPD培养基的250ml三角瓶中，在28℃，200rpm条件下培养，离心分离处于指数生长期的细胞，按之前所述的方法测定三菌株细胞内的丙酮酸脱氢酶催化活力。与Y.lipolytica WSH-Z06细胞相比，重组菌株Y.lipolytica-K、Y.lipolytica-409A细胞内的丙酮酸脱氢酶催化活力从30.4U/mg蛋白下降至26.3U/mg蛋白和19.7U/mg蛋白；突变二氢硫辛酰胺乙酰转移酶第413天冬氨酸活性氨基酸使其细胞内丙酮酸脱氢酶催化活力从30.4U/mg protein下降至20.6U/mg protein(图2中A)。重组菌株Y.lipolytica-K、Y.lipolytica-409A和Y.lipolytica-413A细胞内的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶活力分别为87.2U/mg蛋白、22.7U/mg蛋白和21.8U/mg蛋白，分别是出发菌株的156.2％、40.7％和39.1％(图2中B)。由于过量表达二氢硫辛酰胺乙酰转移酶，改变了丙酮酸脱氢酶系天然组装化学计量学平衡，干扰了丙酮酸脱氢酶和二氢硫辛酰胺脱氢酶与二氢硫辛酰胺乙酰转移酶组装，因此，重组菌株Y.lipolytica-K细胞内的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶活力上升了，而细胞内的丙酮酸脱氢酶催化活力却下降了。
将T.glabrata CCTCC M202019△ura3、T.glabrata-C、T.glabrata-442A和T.glabrata-446A菌株同时接种至含有20ml YPD培养基的250ml三角瓶中，在28℃，200rpm条件下培养，离心分离处于指数生长期的细胞，按之前所述的方法测定四菌株细胞内的丙酮酸脱氢酶催化活力。与出发菌株相比，表达野生型二氢硫辛酰胺乙酰转移酶的T.glabrata-C重组菌株细胞内的丙酮酸脱氢酶催化是17.8U/mg蛋白，为出发菌株的78.8％，突变二氢硫辛酰胺乙酰转移酶第442组氨酸残基为丙氨酸使丙酮酸脱氢酶催化活力从22.6U/mg蛋白下降至11.7U/mg蛋白；突变二氢硫辛酰胺乙酰转移酶第446天冬氨酸活性氨基酸使其细胞内丙酮酸脱氢酶催化活力从22.6U/mg蛋白下降至10.9U/mg蛋白(图2中C)。同时监测细胞内的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶活力，T.glabrata-C、T.glabrata-442A和T.glabrata-446A菌株细胞内的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶活力分别是67.1U/mg蛋白、18.8U/mg蛋白和20.7U/mg蛋白，分别是出发菌株的151.5％、42.3％和46.7％(图2中D)。
实施例3 过量表达活性位点缺失的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶突变体增强丙酮酸积累
按之前所述生产丙酮酸的方法将野生型Y.lipolytica WSH-Z06菌株、Y.lipolytica-K、Y.lipolytica-409A和Y.lipolytica-413A同时接种于含有1.5L发酵培养基的3L发酵罐中，在28℃，200rpm条件下发酵144h，对比细胞外积累的丙酮酸积累。对比发现：表达野生型二氢硫辛酰胺乙酰转移酶后，重组菌株Y.lipolytica-K细胞外积累的丙酮酸轻微上涨至野生型菌株的119.5％。由于二氢硫辛酰胺乙酰转移酶活性位点突变，细胞内丙酮酸脱氢酶催化活力下降，丙酮酸经TCA循环代谢分解量下降，发酵结束时，与Y.lipolytica WSH-Z06菌株相比，Y.lipolytica-409A和Y.lipolytica-413A细胞外积累的丙酮酸分别从20.5g·L-1分别上升至38.6g·L-1和39.9g·L-1(图3)。由于过量表达二氢硫辛酰胺乙酰转移酶，改变了丙酮酸脱氢酶系天然组装化学计量学平衡，干扰了丙酮酸脱氢酶和二氢硫辛酰胺脱氢酶与二氢硫辛酰胺乙酰转移酶组装，因此，重组菌株Y.lipolytica-K细胞内的丙酮酸脱氢酶催化活力下降了，细胞外积累的丙酮酸有所提高。
与此类似，将T.glabrata CCTCC M202019△ura3、T.glabrata-C、T.glabrata-442A和T.glabrata-446A同时接种含有1.5L发酵培养基的3L发酵罐中，在28℃，200rpm条件下发酵80h。发酵结束时，重组菌株T.glabrata-C细胞外积累的丙酮酸从49.4g·L-1上升至56.8g·L-1；表达二氢硫辛酰胺乙酰转移酶第442组氨酸活性氨基酸突变的T.glabrata-442A重组菌株和第446天冬氨酸活性氨基酸突变体的重组菌株T.glabrata-446A的细胞外积累的丙酮酸从49.4g·L-1分别上升至68.6g·L-1和74.3g·L-1(图4)。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (4)

1.一种丙酮酸积累增强的解脂亚洛酵母重组菌，其特征在于，是通过解脂亚洛酵母中过表达二氢硫辛酰胺乙酰转移酶或保守活性位点发生突变的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶得到；所述二氢硫辛酰胺乙酰转移酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示；所述保守活性位点发生突变是将第409位 组氨酸突变为丙氨酸，或将第413位 天冬氨酸突变为丙氨酸；
构建所述解脂亚洛酵母重组菌的方法，主要包括以下步骤：(1)构建表达目的基因所用的整合型表达载体：扩增潮霉素磷酸转移酶hph基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，利用限制性内切酶Stu I与Hind III同时处理扩增的到的hph基因和p0质粒，并连接两酶切产物得到含有潮霉素磷酸转移酶为筛选标记的整合型表达载体p0(hph)；(2)构建重组整合型表达质粒；根据NCBI公开的序列，全化学合成编码来源于解脂亚洛酵母潮霉素磷酸转移酶编码基因LAT1的开放阅读框序列，分别利用限制性内切酶Bam HI和Eco RI切割LAT1的开放阅读框整合型表达载体p0(hph)，连接获得重组表达质粒p0(hph)-LAT1；(3)分别设计突变引物对H409A-F/H409A-R和D413A-F/D413A-R，将LAT1编码的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶的第409组氨基酸残基和第413天冬氨酸残基突变为丙氨酸残基，分别获得p0(hph)-409A和p0(hph)-413A整合性质粒；(4)将所得的p0(hph)-LAT1、p0(hph)-409A和p0(hph)-413A质粒转化Y.lipolytica WSH-Z06：利用电穿孔转化法将被限定内切酶Avr II线性化的重组整合型质粒转化野生型Y.lipolytica WSH-Z06，验证筛选阳性转化子，分别获得Y.lipolytica-K、Y.lipolytica-409A和Y.lipolytica-413A菌株。
2.权利要求1所述解脂亚洛酵母重组菌在丙酮酸生产中的应用。
3.一种丙酮酸积累增强的光滑球拟酵母重组菌，其特征在，是通过在光滑球拟酵母中过表达二氢硫辛酰胺乙酰转移酶或保守活性位点发生突变的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶得到；所述二氢硫辛酰胺乙酰转移酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示；所述保守活性位点发生突变是将442位组氨酸突变成丙氨酸，或将第446位天冬氨酸个突变为丙氨酸；
构建所述光滑球拟酵母重组菌的方法，主要包括以下步骤：(1)根据NCBI公开的序列，全化学合成编码来源于光滑球拟酵母二氢硫辛酰胺乙酰转移酶编码基因LAT1的开放阅读框序列，分别利用限制内切酶Spe I和Ban HI切割LAT1的开放阅读框和整合型表达载体pRS306TEF1，连接获得重组表达质粒p RS06TEF1-LAT1；(2)分别设计突变引物对H442A-F/H442A-R和D446A-F/D446A-R，将LAT1编码的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶的第442组氨基酸残基和第446天门冬氨酸残基突变为丙酮酸残基，分别获得pRS06TEF1-LAT1、pRS06TEF1-442A和pRS06TEF1-446A质粒转化T.glabrata CCTCC M202019△ura3，在YNB培养基平板中筛选原养型细胞，验证筛选阳性转化子，分别获得T.glabrata-C、T.glabrata-442A和T.glabrata-446A菌株。
4.权利要求3所述光滑球拟酵母重组菌在丙酮酸生产中的应用。
CN201410665313.9A 2014-11-19 2014-11-19 一种削弱丙酮酸分解代谢强化丙酮酸积累的方法 Active CN104450804B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410665313.9A CN104450804B (zh) 2014-11-19 2014-11-19 一种削弱丙酮酸分解代谢强化丙酮酸积累的方法
US14/583,260 US9518275B2 (en) 2014-11-19 2014-12-26 Method for decreasing pyruvate catabolism and increasing the accumulation of pyruvate in microbes

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410665313.9A CN104450804B (zh) 2014-11-19 2014-11-19 一种削弱丙酮酸分解代谢强化丙酮酸积累的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104450804A CN104450804A (zh) 2015-03-25
CN104450804B true CN104450804B (zh) 2019-05-17

Family

ID=52897551

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410665313.9A Active CN104450804B (zh) 2014-11-19 2014-11-19 一种削弱丙酮酸分解代谢强化丙酮酸积累的方法

Country Status (2)

Country Link
US (1) US9518275B2 (zh)
CN (1) CN104450804B (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104450804B (zh) * 2014-11-19 2019-05-17 江南大学 一种削弱丙酮酸分解代谢强化丙酮酸积累的方法
CN105368884B (zh) * 2015-12-10 2019-01-04 江南大学 一种丙酮酸生产强度提高的重组菌及其应用
CN106635852B (zh) * 2016-12-07 2019-11-26 江南大学 一种联产丙酮酸和α-酮戊二酸的重组光滑球拟酵母
CN110499259B (zh) * 2019-07-22 2021-07-27 浙江工业大学 一种解酯耶氏酵母yw100-1及其应用
KR102281369B1 (ko) * 2021-04-07 2021-07-22 씨제이제일제당 (주) 신규한 디히드로리포일 아세틸기전이효소 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103087950A (zh) * 2013-01-10 2013-05-08 江南大学 一株高产丙酮酸的大肠杆菌菌株的构建及应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104450804B (zh) * 2014-11-19 2019-05-17 江南大学 一种削弱丙酮酸分解代谢强化丙酮酸积累的方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103087950A (zh) * 2013-01-10 2013-05-08 江南大学 一株高产丙酮酸的大肠杆菌菌株的构建及应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Functional analysis of the domains of dihydrolipoamide acetyltransferase from Saccharomyces cerevisiae.;Lawson JE等;《Biochemistry》;19911126;11249-54
Overexpresseion and mutagenesis of the catalytic domain of dihydrolipoamide acetyltransferase from Saccharomyces cerevisiae.;Niu XD等;《Biochemistry》;19900918;第29卷(第37期);8614-9
Structure-Function Relationships in Dihydrolipoamide Acyltransferases;Lester J.Reed、Marvin L.Hackert;《The Journal of Biological Chemistry》;19900605;第265卷(第16期);8971-8974

Also Published As

Publication number Publication date
US9518275B2 (en) 2016-12-13
CN104450804A (zh) 2015-03-25
US20160138054A1 (en) 2016-05-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104450804B (zh) 一种削弱丙酮酸分解代谢强化丙酮酸积累的方法
CN108220175B (zh) 酿酒酵母高密度培养方法及其pH调控方法
Kiers et al. Regulation of alcoholic fermentation in batch and chemostat cultures of Kluyveromyces lactis CBS 2359
KR100878050B1 (ko) 피루베이트를 생산하는 효모 균주
KR102015829B1 (ko) 온라인 산소 소비율과 전도율의 통합 제어를 기반으로 한 코엔자임 q10 발효 생산 공정
CN103403155B (zh) 新型酿酒酵母菌株
CN105483167B (zh) 一种基于电化学系统调控细胞内还原力再生发酵产丁二酸的方法
AU2016361425A1 (en) Genetically modified yeasts and fermentation processes using genetically modified yeasts
CN105950529B (zh) 产3-羟基丙酸的重组谷氨酸棒杆菌、其构建方法及应用
Yang et al. Production of erythritol from glucose by an osmophilic mutant of Candida magnoliae
Bai et al. Strain improvement and metabolic flux analysis in the wild‐type and a mutant Lactobacillus lactis strain for l (+)‐lactic acid production
DK2256184T3 (en) Mutants of Saccharomyces cerevisiae as well as the process for the preparation of yeast with high RNA content using the mutants
CN103361289B (zh) 一株产l-赖氨酸的菌株及其生产l-赖氨酸的方法
CN113980813A (zh) 一种耐高温解脂亚罗酵母变异菌株的选育方法及其在赤藓糖醇发酵中的应用
CN107267422A (zh) 睾丸酮丛毛单胞菌hhala‑001及采用该菌株生产l‑丙氨酸的方法
CN105368884B (zh) 一种丙酮酸生产强度提高的重组菌及其应用
CN105925519A (zh) 一种在辅酶q10生产菌株sz中降低或消除副产物d的方法、辅酶q10高产菌株及其应用
Moeller et al. Citric acid production from sucrose by recombinant Yarrowia lipolytica using semicontinuous fermentation
CN112300953B (zh) 枯草芽孢杆菌及其在发酵生产腺苷酸脱氨酶中的应用
CN105483190B (zh) 酿酒酵母基因工程改造提高s-腺苷-l-蛋氨酸产量的方法
CN103484391B (zh) 一种胞外α-酮戊二酸产量提高的解脂亚洛酵母基因工程菌
CN105462868B (zh) 一种提高丙酮酸产量和生产强度的方法
CN103923847A (zh) 一种强化前体供应增强α-酮戊二酸合成的解脂亚洛酵母
CN105062981A (zh) 一种酶活性提高的丙酮酸羧化酶突变体n315f及其应用
CN105132388B (zh) 一种酶活性提高的丙酮酸羧化酶突变体r485p及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant