CN104415661A - 一种生物大分子的分离技术及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种从凝胶块中分离生物大分子的分离装置,以及该分离装置的使用方法；进一步的,本发明提供了所述分离装置和分离方法在生物大分子分离中的应用,利用所述分离方法和装置,能够快速、高效地分离凝胶块中含有的生物大分子。

Description

一种生物大分子的分离技术及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域,具体涉及一种从凝胶块中分离生物大分子的分离装置、方法及其应用。

背景技术

电泳是指带电颗粒在电场的作用下,向着与其电性相反的电极移动的现象。利用带电粒子在电场中移动速度的不同,而使其得到分离的技术被称为电泳技术。1937年瑞典科学家蒂塞利乌斯首次设计制造了移动界面电泳仪,利用电泳技术对马血清中3种白蛋白进行了分离。

目前应用的电泳技术大致可分为显微电泳、自由界面电泳和区带电泳三类,其中又以区带电泳、尤其是琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用最为广泛。在生物大分子分离纯化过程中,琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳是两种最常见的电泳技术,用于分离纯化包括核酸、蛋白质和糖在内的多种生物大分子物质。在蛋白质或核酸分析过程中,经常需要将被分离的特定成分从凝胶中提取出来,用于后续的研究工作,因此获得经过凝胶分离的大分子物质不仅是一项常规的实验操作,也是核酸、蛋白质研究中的一项关键步骤。

从凝胶中获得经电泳分离的生物大分子是分子生物学实验中常用的技术手段和重要的操作步骤,常用的方案大体分为利用化学方法的样本纯化技术和利用物理方法的电洗脱技术。以Qiagen为代表的公司采用有机试剂溶解琼脂肪凝胶,可进一步分离纯化其中的核酸成分。虽然该类技术通过简单的有机试剂溶胶、纯化柱分离就能获得所需的核酸样本,但回收率较低,尤其是对分子量比较大的核酸分子,极大地制约了相关研究的发展；该技术的另一个缺陷是由于使用了高浓度的化学试剂,不适合活性蛋白质样本的纯化。

电洗脱技术是一项应用广泛的凝胶分离技术,可用于不同凝胶中多种生物大分子物质的分离。透析袋电洗脱法是其中最简单的一种技术方案,其步骤是首次将含有所待分离样本的凝胶区带切下,装入透析袋内并加入缓冲液浸泡,再将透析袋浸入缓冲液中进行电泳；凝胶中带电荷的生物大分子成分就会依其电性,分别向正、负电极方向迁移,离开凝胶进入透析袋内的缓冲液中,从而实现从凝胶中分离生物大分子成分的目的。虽然透析袋电洗脱法所需设备简单,但操作较为复杂,技术的稳定性不好,同时存在洗脱后样品体积较大,回收效率较低的缺陷。

为了简化电洗脱技术的操作难度、提高样本回收率,许多生物技术和仪器公司东开发了相关技术和产品,市场上具有代表性的产品有G-Biosciences公司的G-Capsule、Gerardbiotech公司的GeBAflex tube、Novagen公司的D-Tube、Whatman公司的Elutrap、以及Bio-Rad公司的Whole Gel Eluter and Mini Whole Gel Elute系统。这些设备通常依赖具有不同孔径的半透膜,除了价格昂贵以外,半透膜的切割和安装过程较为复杂,一旦失误易发生样本泄露。此外,与周围电解质溶液环境相比,凝胶样本的电阻较大；在相同的电场条件下,大多数电流会通过电阻率较低的周围电解质溶液传递,只有极少量的电流会流经凝胶,从而使得样品从凝胶中游离的速度非常缓慢。这一方面极大地延长了电洗脱时间,不利于生物大分子的活性保持,另一方面也影响了电洗脱效率,降低了样本的回收率。

因此,迫切需要建立一种快速、高效地从凝胶中回收生物大分子样本的电洗脱技术。

发明内容

从以上分析可以看出,现有电洗脱技术中最主要的问题是为了克服目前存在的洗脱时间长、回收效率低和操作繁琐的问题,本发明使含有待分离样本的凝胶在电场中形成一个能够完全阻挡电流通路的凝胶层,使所有电流均通过该凝胶层传递,从而极大地降低了电洗脱的时间,提高了样本的回收率。

本发明涉及以下按顺序编号的段落中定义的主题：

1、一种电分离槽,该电分离槽包括分离的阳极区域和阴极区域、以及设置在阳极区域和阴极区域之间的凝胶区域,阳极区域中装置有正电极,阴极区域中装置有负电极。

2、段落1所述的分离槽,其特征在于所述电分离槽阳极区域的容积为0.01-10mL。

3、段落1所述的电分离槽,其特征在于所述电分离槽由内、外两个嵌套的垂直套管组成,阳极区域位于外套管中,阴极区域位于内套管中,凝胶区域位于内套管中的与外套管交界的区域,内套管底部为可通透的。

4、段落1所述的电分离槽,其特征在于所述电分离槽由内、外两个嵌套的垂直套管组成,阳极区域位于内套管中,阴极区域位于外套管中,凝胶区域位于内套管中的与外套管交界的区域,内套管底部为可通透的。

5、段落1-4任一项所述的电分离槽,其特征在于所述电分离槽的凝胶区域为上宽下窄的漏斗形结构。

6、段落1-5任一项所述的电分离槽,其特征在于所述电分离槽的凝胶区域下端具有支持性的且不影响电流通过的结构。

7、段落1-6任一项所述的电分离槽,其特征在于所述电分离槽的述凝胶区域下端设置有可拆卸的封闭装置。

8、段落7所述的电分离槽,其特征在于所述的可拆卸的封闭装置为可拆除的锡箔纸。

9、段落1-8任一项所述的电分离槽,其特征在于所述的电分离槽还包括冷却装置。

10、一种电分离装置,其特征在于包括段落1-9任一项所述的电分离槽和电源系统。

11、一种从凝胶块中分离生物大分子的方法,该方法包括以下步骤：

1)获得段落1-9任一项所述的电分离槽；

2)获得含有待分离生物大分子的凝胶块,利用该凝胶块制备凝胶层,使其能够在电分离槽的阳极区域和阴极区域之间形成完整的分隔层,完全阻断阳极区域缓冲液和阴极区域缓冲液之间的接触；

3)使待分离的生物大分子在电场作用下从凝胶层中迁移出来；

4)收集分离的生物大分子。

12、段落11所述的方法,其特征在于步骤2中制备所述凝胶层的方法为：熔解含有待分离生物大分子的凝胶块,将凝胶熔液加入到电分离槽的凝胶区域中,凝固后形成所述凝胶层。

13、段落11所述的方法,其特征在于步骤2中制备所述凝胶层的方法为：将含有待分离生物大分子的凝胶块与一定量不含有生物大分子的凝胶熔液加入到电分离槽的凝胶区域中,使其共同凝固形成所述凝胶层。

14、段落11所述的方法,其特征在于所述凝胶块选自琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。

15、段落11所述的方法,其特征在于分离电压为5-50伏,优选为10-20伏。

16、段落11所述的方法,其特征在于分离电流为1-10mA,优选为2-4mA。

17、段落11所述的方法,其特征在于所述的待分离生物大分子选自核酸、蛋白质和多糖。

一方面,本发明提供了一种用于从凝胶中分离生物大分子的电分离槽,该电分离槽包括分离的阳极区域和阴极区域、以及设置在阳极区域和阴极区域之间的凝胶区域,阳极区域中装置有正电极,阴极区域中装置有负电极,其特征在于凝胶区域的凝胶能够在电分离槽的阳极区域和阴极区域之间形成完整的分隔层,完全阻断阳极区域缓冲液和阴极区域缓冲液之间的接触。本发明提供的电分离槽能够方面地实现本发明的技术效果,解决了现有技术中分离步骤繁琐的问题。

一方面,本发明所提供了一种使用于本发明提供的分离方法的电分离槽,该电分离槽的阳极区域的容积为0.01-10mL；优选的,电分离槽的阳极区域的容积为0.1-5mL。

一方面,本发明提供的电分离槽由内、外两个嵌套的垂直套管组成,阳极区域位于外套管中,阴极区域位于内套管中,凝胶区域位于内套管中的与外套管交界的区域。

一方面,本发明提供的电分离槽由内、外两个嵌套的垂直套管组成,阳极区域位于内套管中,阴极区域位于外套管中,凝胶区域位于内套管中的与外套管交界的区域。

一方面,本方面提供的电分离槽的凝胶区域为上宽下窄的漏斗形结构。

一方面,本方面提供的电分离槽的凝胶区域下端具有支持性的且不影响电流通过的结构。

一方面,本方面提供的电分离槽的凝胶区域下端设置有可拆卸的封闭装置。

一方面,本方面提供的电分离槽的凝胶区域下端设置有可拆卸的封闭装置为可拆除的锡箔纸。

一方面,本方面提供的电分离槽还包括冷却装置。所述冷却装置可以是循环水冷却系统、或预冷的可与被冷却部位密切结合的预冷的金属结构。

另一方面,本发明提供了一种电分离装置,其特征在于包括上述电分离槽和电源系统。优选的,本发明提供的电分离装置还包括冷却装置。

另一方面,本发明提供了一种从凝胶块中分离生物大分子的方法,包括以下步骤：1)获得一种电分离槽,该电分离槽包括分离的阳极区域和阴极区域、以及设置在阳极区域和阴极区域之间的凝胶区域,阳极区域中装置有正电极,阴极区域中装置有负电极；2)获得含有待分离生物大分子的凝胶块,利用该凝胶块制备凝胶层,使其能够在电分离槽的阳极区域和阴极区域之间形成完整的分隔层,完全阻断阳极区域缓冲液和阴极区域缓冲液之间的接触；3)使待分离的生物大分子在电场作用下从凝胶块中迁移出来；4)收集分离的生物大分子。本发明通过在电分离槽的阳极区域和阴极区域之间制备包含待分离生物大分子样本的凝胶层,并使该凝胶层在电分离槽的阳极区域和阴极区域之间形成完整的分隔层,完全阻断阳极区域缓冲液和阴极区域缓冲液之间的接触,从而将所有电流都应用于生物大分子的分离过程。这一改变克服了现有技术中仅有及少量电流实际用于生物大分子分离的缺陷,解决了电分离时间过长和回收效率过低的问题。

一方面,在本发明提供的从凝胶中分离生物大分子的方法中,一种制备步骤2中所述凝胶层的方法为：熔解含有待分离生物大分子的凝胶块,将凝胶熔液加入到电分离槽的凝胶区域中,凝固后形成所述凝胶层。该方法可用于分离具有温度稳定性或对完整性要求不高的生物大分子。

一方面,在本发明提供的从凝胶中分离生物大分子的方法中,一种制备步骤2中所述凝胶层的方法为：将含有待分离生物大分子的凝胶块与一定量不含有生物大分子的凝胶熔液加入到电分离槽的凝胶区域中,使其共同凝固形成所述凝胶层。具体操作可以是将含有生物大分子的凝胶块利用物理方法破碎,包括且不限于切碎、利用离心管进行破碎、挤压破碎等。随后,将破碎的含有生物大分子的凝胶碎块与一定量融化状态的不含有所述生物大分子的凝胶熔液一同、或先后加入到电分离槽的凝胶区域中,使其共同凝固形成所述凝胶层。所述不含有所述生物大分子的凝胶熔液优选为自琼脂糖凝胶熔液、制备聚丙烯酰胺凝胶的溶液、或其他常用的凝胶制备试剂。无论使用何种试剂或凝胶层形成方案,所形成的凝胶层应能够在电分离槽的阳极区域和阴极区域之间形成完整的分隔层,完全阻断阳极区域缓冲液和阴极区域缓冲液之间的接触。这个凝胶层制备方法可用于分离温度敏感的生物大分子,其中所述凝胶溶液加入时的温度应该低于能使所述待分离生物大分子变性或破坏其正常物理化学性质的温度。

一方面,本发明提供的从凝胶中分离生物大分子的方法中,所述凝胶块选自琼脂糖凝胶、聚丙烯酞胺凝胶、或其他在生物医学研究中常用的电泳或其他分离方法所使用的凝胶种类。

一方面,本发明提供的从凝胶中分离生物大分子的方法中,所述分离电压可以为1-100伏,优选为5-50伏,更优选为10-20伏。

一方面,本发明提供的从凝胶中分离生物大分子的方法中,所述分离电流为1-50mA,优选为1-10mA,更优选为2-4mA。

另一方面,本发明提供了所述电洗脱槽和所述电洗脱方法的应用。所述待分离的生物大分子可选自核酸、蛋白质、多糖、或其他适合本发明提供的方法进行分离的生物大分子。

与现有技术相比,本发明的有益效果是：1)电洗脱时间短,样本回收率高。由于将含有待分离样本的凝胶在电场中形成一个能够完全阻挡电流通路的凝胶层,使所有电流均通过该凝胶层传递,从而极大地缩短了电洗脱时间,提高了样本的回收率。2)操作步骤简单。简化了从凝胶中回收生物大分子的操作步骤,避免了有毒化学试剂的使用,同时也避免了蛋白质或核酸样品提取、切碎等步骤中的样品的失活和损失。3)技术简单,适合高通量地实现多种生物大分子成分的分离。

具体实施方式

下面结合具体实施例及附图,进一步阐述本发明。应当理解,这些实施例仅用于说明本发明而不能用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。

附图说明

图1、内套管和包括凝胶层的内套管示意图。

图2、外套管和电分离槽整体结构示意图。

实施例一、电分离槽的组成和使用方法

电洗脱装置的组装：电分离槽内套管及包括凝胶层的内套管示意图见图1,电分离槽外套管和电分离槽整体结构示意图见图2。按照图1和图2的指示、以及说明书的相关内容,组装用于后续试验的电泳槽。

从凝胶中分离生物大分子的试验方法具体如下：1)获得电分离槽；2)以暂时性的封闭装置如Parafilm膜暂时性封闭图1所示的电泳槽内套管的底部；3)获得包含待分离生物大分子的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶块；4)用手术刀片将琼脂糖凝或聚丙烯酰胺凝胶块切成1mm大小的凝胶碎块,与预先熔解并降温至60℃左右的1％琼脂糖凝胶熔液混合,加入到的电泳槽内套管下部的凝胶区；5)使凝胶碎块和琼脂糖凝胶熔液共同凝固,在电泳槽内套管的下部凝胶区形成凝胶层,该凝胶层在电分离槽的阳极区域和阴极区域之间形成完整的分隔层,能够完全阻断阳极区域缓冲液和阴极区域缓冲液之间的接触；6)分别在电泳槽的阳极区域和阴极区域加入适量的TAE缓冲液,按图2所示的方式组装电分离槽,在电分离槽的阴极区域加入少量核酸或蛋白电泳上样缓冲液,该上样缓冲液下沉至凝胶层的顶部,在电分离过程中由阴极向阳极方向迁移；7)将电分离槽的正极和负极分别与电泳仪的相应电极连接,在3mA恒流条件下进行电泳；8)电泳过程中,原来位于电泳槽阴极区域底部的上样缓冲液会在电场作用下进入凝胶层,向电泳槽的阳极区域迁移,当上样缓冲液中的染料条带均由凝胶层中迁移到电泳槽的阳极区域后,停止电泳；9)以适合的方式分离纯化分布于电分离槽阳极区缓冲液中的被分离的生物大分子。

实施例二、从琼脂糖凝胶中回收不同分子量的DNA片段

为了研究本发明提供的分离技术对不同大小DNA片段的分离效率,我们从Promega公司购置了PCR Markers(#G3161),利用琼脂糖凝胶电泳对不同大小的DNA片段进行分离,随后用本发明提供的分离技术将不同大小的DNA片段从凝胶中分离出来,计算分离效率。实验步骤和结果具体如下。

步骤一：琼脂糖凝胶电泳。制备含有EB的1.2％的琼脂糖凝胶,将10uL购置于Promega公司的PCR Markers上样后进行电泳分离,电泳缓冲液为TAE,电泳条件为恒压4V／cm。

步骤二：DNA条带的分离纯化。电泳后共获得6条DNA条带,分别为1000bp,750bp,500bp,300bp,150bp和50bp DNA条带。将凝胶移至紫外灯下,用高压灭菌过的无菌手术刀片迅速分离每个DNA条带,按照实施例一所述的方法从这些凝胶块中分别获得其中含有的DNA分子。阳极缓冲液为TAE,阳极区域的缓冲液的体积为0.5mL。

步骤三：分离DNA的定量。利用Qiagen公司的PCR产物纯化试剂盒(#28104),回收阳极缓冲液中分离的DNA,将纯化后的DNA溶于50uL去离子水。

步骤四：对照实验。为了鉴定从凝胶中回收DNA分子的准确效率,我们将10uL PCRMarkers直接加到0.5mLTAE缓冲液中,利用步骤三中描述的方法,对其中的DNA分子进行了分离纯化,将获得的DNA溶于300uL去离子水。

步骤五：DNA分离效果验证。制备一块含有EB的1.2％的琼脂糖凝胶,将步骤三中获得的分离的DNA样本进行混合,总体积为300uL,取其中的60uL上样到一个加样孔中；同样取步骤四中的DNA溶液60uL上样到另一个加样孔中。在4V／cm恒压条件下进行电泳,电泳缓冲液为TAE。电泳结束后,利用紫外凝胶成像仪对DNA条带成像,用图像分析软件分别获得每个DNA条带的灰度值,并进行定量。

实验结果及分析：为了准确计算从凝胶中分离获得的DNA量,需要从分离后的阳极缓冲液中进一步获得待分离的DNA分子,这个过程中的DNA分离效率会直接影响到计算结果。为了排除这个影响,我们在对照试验中,将同样量的DNA Markers直接加入到同样剂量的TAE溶液中,利用同样的试剂盒对其中的DNA进行分离纯化。以对照试验中获得的DNA条带的灰度值为参照,我们对步骤二从凝胶中分离DNA的效果进行了计算,每条DNA条带的分离效率如下：从凝胶中分离1000bp DNA条带的效率为95％,分离750bp DNA条带的效率为97％,分离500bp DNA条带的效率为99％,分离300bp DNA条带的效率为96％,分离150bp DNA条带的效率为95％,分离50bp DNA条带的效率为95％。从试验结果可以看出,本发明提供的技术方案可以有效分离不同长度的DNA片段。

实施例三、从琼脂糖凝胶中回收DNA片段样本并进行PCR扩增

为了研究本发明提供的技术方案对分离的DNA性质的影响,我们对被分离的DNA进行了PCR扩增实验。

步骤一：获得包含人类Actin基因cDNA序列的质粒,将200ng质粒上样到含有EB的1.2％的琼脂糖凝胶中电泳,按照上述实施例的方法切割质粒电泳条带所在位置的凝胶块,用本发明提供的技术方案分离凝胶块中的质粒DNA,将获得的质粒DNA溶于50uL去离子水。

步骤二：针对人Actin基因序列,设计一对PCR扩增引物,序列分别为上游引物5′-CCTCGCCTTTGCCGATCC和下游引物5′-GGATCTTCATGAGGTAGTCAGTC。使用天根生化科技公司的HotMaster Taq DNA polymerase(cat#：ET106-01-01)对分离的质粒DNA中的目标片段进行扩增,具体方法按产品说明书进行,步骤如下：取0.5uL分离的质粒DNA溶液,加入2.5uL10×HotMaster Taq Buffer,0.5uL(10uM)上游引物,0.5uL(10uM)下游引物,1uL dNTP混合物(各2.5uM),1uL SYBR Green(5×),0.2uL HotMaster Taq DNA polymerase(2.5u／ul),最后加入17.3uL ddH₂O,反应总体积为25μL。混匀后短暂离心,置于Eppendorf PCR仪中进行PCR扩增反应,反应参数为95℃预变性2分钟,95℃变性15秒,58℃退火15秒,72℃延伸30秒；循环次数为40个循环。每个反应设置3个重复。

步骤三：取PCR产物2uL,上样到含有EB的1.2％的琼脂糖凝胶中,在4V／cm电压条件下电泳30分钟,电泳缓冲液为TAE。电泳结束后,用紫外凝胶成像仪对DNA条带进行成像。

实验结果及分析：以本发明提供的技术方案分离的质粒DNA为模板进行PCR扩增,能够获得预期长度的扩增片段,说明本发明提供的分离方案不影响被分离DNA的扩增性质。

实施例四、从琼脂糖凝胶中回收DNA片段样本并进行亚克隆

为了进一步研究本发明提供的技术方案对分离的DNA性质的影响,我们对被分离的DNA样本进行了克隆实验。

步骤一：获得实施例三步骤四中的PCR产物,将400ng PCR产物上样到含有EB的1.2％的琼脂糖凝胶中电泳,按照上述实施例的方法切割质粒电泳条带所在位置的凝胶块,用本发明提供的技术方案分离凝胶块中的质粒DNA,将获得的PCR产物溶于50uL去离子水。

步骤二：利用Promega的T载体克隆试剂盒,按照说明书的方案,将本实施例步骤一中获得的PCR产物克隆到T载体中,然后按照分子克隆的实验方案将PCR与T载体的连接产物导入E.Coli感受态细胞,随后进行克隆培养。

步骤三：利用实施例三步骤二中的PCR扩增引物和扩增条件,对本实施例步骤二种获得的阳性克隆进行验证。

实验结果及分析：实验结果表明,所有检测的5个阳性克隆中均包含预期插入的PCR产物,说明本发明提供的技术方案不影响被分离DNA片段的可克隆性质。

实施例五、从琼脂糖凝胶中回收RNA样本并进行RT-PCR扩增

为了进一步研究本发明提供的技术方案对被分离的RNA转录本的影响,我们对被分离的RNA样本进行了RT-PCR扩增研究。

步骤一：获得Hela细胞来源的总RNA样本,进行定量。

步骤二：18S rRNA片段的电分离。取10ug总RNA样本,按照分子克隆的方法,进行1％的变性琼脂糖凝胶电泳。按照上述实施例所描述的方法,获得包含18S rRNA转录本的凝胶块。用本发明提供的技术方案分离凝胶块中的RNA转录本,将获得的18S rRNA转录本溶于50uL RNase-free的去离子水。

步骤三：18S rRNA的逆转录和实时荧光定量PCR扩增：利用针对人18S rRNA设计的正向引物5′-AAACGGCTACCACATCCAAG和反向引物5′-CCTCCAATGGATCCTCGTTA,对分离的18S rRNA转录本进行RT-PCR扩增。具体步骤如下：

1)RNA逆转录：使用天根生化科技公司的逆转录试剂盒(TIANScript M-MLV,cat：ER104-03)进行RNA样本的逆转录反应,具体按照试剂盒说明书的方法进行,步骤如下：取1uL18S rRNA样本,加入2uL(10uM)6碱基随机逆转录引物,2uLdNTP(10mM),混匀后置70℃水浴变性5分钟；冰上放置3分钟后取出,加入4uL5×First-Strand Buffer,0.5uL RNase inhibitor(40U／uL),1uL M-MLV(200U／uL),总体积为20μL；混匀后短暂离心,置于Eppendorf PCR仪中进行逆转录反应,反应参数为25℃,10分钟；42℃,50分钟；95℃,5分钟；随后置于4℃保存。其中,RNase inhibitor(cat#N211)为Promega公司的产品。

2)实时荧光定量PCR：使用天根生化科技公司的的HotMaster Taq DNA polymerase(cat#：ET106-01-01)对样本中目标转录本的含量进行测定,具体方法按产品说明书进行,步骤如下：取2uL逆转录产物,加入2.5uL10×HotMaster Taq Buffer,0.5uL(10uM)上游引物,0.5uL(10uM)下游引物,1uL dNTP混合物(各2.5uM),1uLSYBR Greenl(5×),0.2uL HotMaster Taq DNA polymerase(2.5u／uL),最后加入17.3uLddH₂O,反应总体积为25μL。混匀后短暂离心,置于Eppendorf PCR仪中进行PCR扩增反应,反应参数为95℃预变性2分钟,95℃变性15秒,58℃退火15秒,72℃延伸30秒；循环次数为40个循环。每个反应设置3个重复。

步骤四：18S rRNA转录本的扩增产物分析。取2uL扩增产物,上样到含有EB的1.2％的琼脂糖凝胶中进行电泳,电泳30分钟后,在紫外凝胶成像仪下检测扩增片段的大小。

实验结果及分析：实验结果表明,以电分离的人源18S rRNA转录本为模板,能够获得预期的扩增片段,说明本发明提供的技术方案不影响被分离RNA片段的RT-PCR扩增性质。

实施例六、从琼脂糖凝胶中回收蛋白样本并研究分离过程对蛋白质免疫原性的影响

为了研究本发明提供的技术方案对被分离蛋白质性质的影响,我们利用该技术对胰凝乳蛋白酶原进行了电分离,并对分离的胰凝乳蛋白酶原的免疫原性进行了检测。

步骤一：按照《分子克隆》的方法,配制用于蛋白质分离的琼脂糖凝胶,将5mg购自Sigma的胰凝乳蛋白酶原(1500U／mg,货号C4879)溶解在上样缓冲液中,上样后在100伏电压条件下进行琼脂糖电泳。电泳结束后取出凝胶,利用其他样本孔的考马斯亮蓝染色标志,获得含有经电泳分离但未经染色的胰凝乳蛋白酶原的凝胶块。

步骤二：利用上述实施例描述的方法,对凝胶块中的胰凝乳蛋白酶进行电分离,对其中的蛋白成分用考马斯亮蓝G-250染色法进行定量,计算回收率。

步骤三：免疫血清的制备。获得约9周龄的雄性C57小鼠,体重约22-25g。用去离子水将步骤二制备的胰凝乳蛋白酶和未经处理的胰凝乳蛋白酶稀释到0.3ug／uL,0.22uM除菌滤膜过滤。将两种蛋白分子分别和免疫佐剂(QucikAntibody-Mouse5W,北京康碧泉生物科技有限公司,货号：KX0210041,1ml／支)1：1混合后,小鼠后肢肌肉注射,每组6只,20uL/只；对照组注射生理盐水与佐剂1：1混合液,3只,同样方式注射。

2周后,重复注射加强免疫一次。首次注射后4周后,摘眼球取血。取血清后,室温放置2h,4℃过夜,3000rpm离心15分钟后,小心取血清,-80℃冻存备用。

步骤四：免疫原性分析。从上海恒斐生物公司购置小鼠a1抗胰糜蛋白酶(AACT)酶联免疫分析试剂盒。按照试剂盒说明书的要求,对经本技术方案处理的胰凝乳蛋白酶原和未处理的胰凝乳蛋白酶原的免疫原性进行检测。

实验结果及分析：实验结果表明生理盐水处理组小鼠无抗体产生,电分离处理组与未处理组小鼠产生的抗体水平相当,统计结果无显著性差异,说明经本发明技术处理不会影响蛋白质的空间构象及免疫原性。胰凝乳蛋白酶原的回收率为92％。

实施例七、从PAGE凝胶中回收DNA片段样本并进行PCR扩增

为了进一步研究本发明提供的技术方案对PAGE凝胶中分离的DNA的性质的影响,我们开展了被分离的DNA样本的PCR扩增实验。

步骤一：获得实施例三步骤二中的PCR扩增产物400ng,按照《分子克隆》所记载的实验方案配置5％的PAGE DNA凝胶,将获得的DNA上样电泳,用上述实施例的方法切割DNA电泳条带所在位置的凝胶块,用本发明提供的技术方案分离凝胶块中的DNA样本,将获得的质粒DNA溶于50uL去离子水。

步骤二：利用上游引物5′-CCTCGCCTTTGCCGATCC和下游引物

5′-GGATCTTCATGAGGTAGTCAGTC对分离的DNA样本进行扩增,以检测该分离过程对被分离样本可扩增想的影响,具体如下。使用天根生化科技公司的HotMaster Taq DNApolymerase(cat#：ET106-01-01)对分离的质粒DNA中的目标片段进行扩增,具体方法按产品说明书进行,步骤如下：取0.5uL分离的质粒DNA溶液,加入2.5uL10×HotMasterTaq Buffer,0.5uL(10uM)上游引物,0.5uL(10uM)下游引物,1uL dNTP混合物(各2.5uM),1uL SYBR Green(5×),0.2uL HotMaster Taq DNA polymerase(2.5u／ul),最后加入17.3uLddH₂O,反应总体积为25μL。混匀后短暂离心,置于Eppendorf PCR仪中进行PCR扩增反应,反应参数为95℃预变性2分钟,95℃变性15秒,58℃退火15秒,72℃延伸30秒；循环次数为40个循环。每个反应设置3个重复。

步骤三：取PCR产物2uL,上样到含有EB的1.2％的琼脂糖凝胶中,在4V／cm电压条件下电泳30分钟,电泳缓冲液为TAE。电泳结束后,用紫外凝胶成像仪对DNA条带进行成像。

实验结果及分析：步骤三的PCR扩增得到了预期长度的DNA片段,说明本发明提供的分离方案不影响从PAGE凝胶中分离的DNA样本的可扩增性质。

实施例八、从PAGE凝胶中回收蛋白样本并研究分离过程对蛋白质免疫原性的影响

为了研究本发明提供的生物大分子分离技术方案对从PAGE凝胶中分离的蛋白质的性质的影响,我们利用该技术对胰凝乳蛋白酶原进行了电分离,并对分离的胰凝乳蛋白酶原的免疫原性进行了检测。

步骤一：按照《分子克隆》的方法,配制用于蛋白质分离的SDS-PAGE凝胶,将5mg购自Sigma的胰凝乳蛋白酶原(1500U／mg,货号C4879)溶解在上样缓冲液中,进行PAGE凝胶电泳。电泳结束后取出凝胶,利用其他样本孔的胰凝乳蛋白酶原电泳样本的考马斯亮蓝染色标志,获得含有经电泳分离但未经染色的胰凝乳蛋白酶原的凝胶块。

步骤二：利用上述实施例描述的方法,对凝胶块中的胰凝乳蛋白酶进行电分离,对其中的蛋白成分用考马斯亮蓝G-250染色法进行定量,计算回收率。

步骤三：免疫血清的制备。获得约9周龄的雄性C57小鼠,体重约22-25g。用去离子水将步骤二制备的胰凝乳蛋白酶和未经处理的胰凝乳蛋白酶稀释到0.3ug／uL,0.22uM除菌滤膜过滤。将两种蛋白分子分别和免疫佐剂(QucikAntibody-Mouse5W,北京康碧泉生物科技有限公司,货号：KX0210041,1ml／支)1：1混合后,小鼠后肢肌肉注射,每组6只,20uL／只；对照组注射生理盐水与佐剂1：1混合液,3只,同样方式注射。

2周后,重复注射加强免疫一次。首次注射后4周后,摘眼球取血。取血清后,室温放置2h,4℃过夜,3000rpm离心15分钟后,小心取血清,-80℃冻存备用。

步骤四：免疫原性分析。从上海恒斐生物公司购置小鼠a1抗胰糜蛋白酶(AACT)酶联免疫分析试剂盒。按照试剂盒说明书的要求,对经本技术方案处理的胰凝乳蛋白酶原和未处理的胰凝乳蛋白酶原的免疫原性进行检测。

实验结果及分析：实验结果表明生理盐水处理组小鼠无抗体产生,电分离处理组与未处理组小鼠产生的抗体水平相当,统计结果无显著性差异,说明经本发明技术处理不会影响蛋白质的空间构象及生物学活性。胰凝乳蛋白酶原的回收率为94％。

Claims (10)

1.一种电分离槽,该电分离槽包括分离的阳极区域和阴极区域、以及设置在阳极区域和阴极区域之间的凝胶区域,阳极区域中装置有正电极,阴极区域中装置有负电极。

2.权利要求1所述的分离槽,其特征在于所述电分离槽阳极区域的容积为0.01-10mL。

3.权利要求1所述的电分离槽,其特征在于所述电分离槽由内、外两个嵌套的垂直套管组成,阳极区域位于外套管中,阴极区域位于内套管中,凝胶区域位于内套管中的与外套管交界的区域,内套管底部为可通透的。

4.权利要求1所述的电分离槽,其特征在于所述电分离槽由内、外两个嵌套的垂直套管组成,阳极区域位于内套管中,阴极区域位于外套管中,凝胶区域位于内套管中的与外套管交界的区域,内套管底部为可通透的。

5.权利要求1-4任一项所述的电分离槽,其特征在于所述电分离槽的凝胶区域为上宽下窄的漏斗形结构。

6.权利要求1-5任一项所述的电分离槽,其特征在于所述电分离槽的述凝胶区域下端设置有可拆卸的封闭装置,所述可拆卸的封闭装置优选为可拆除的锡箔纸。

7.一种从凝胶块中分离生物大分子的方法,该方法包括以下步骤：

1)获得权利要求1-6任一项所述的电分离槽；

2)获得含有待分离生物大分子的凝胶块,利用该凝胶块制备凝胶层,使其能够在电分离槽的阳极区域和阴极区域之间形成完整的分隔层,完全阻断阳极区域缓冲液和阴极区域缓冲液之间的接触；

3)使待分离的生物大分子在电场作用下从凝胶层中迁移出来；

4)收集分离的生物大分子。

8.权利要求7所述的方法,其特征在于步骤2中制备所述凝胶层的方法为：熔解含有待分离生物大分子的凝胶块,将凝胶熔液加入到电分离槽的凝胶区域中,凝固后形成所述凝胶层。

9.权利要求7所述的方法,其特征在于步骤2中制备所述凝胶层的方法为：将含有待分离生物大分子的凝胶块与一定量不含有生物大分子的凝胶熔液加入到电分离槽的凝胶区域中,使其共同凝固形成所述凝胶层。

10.权利要求7所述的方法,其特征在于所述的待分离生物大分子选自核酸、蛋白质和多糖。