CN107446953A

CN107446953A - 一种利用pcr产物抑制昆虫基因表达的方法

Info

Publication number: CN107446953A
Application number: CN201710578602.9A
Authority: CN
Inventors: 杨广; 芮祥云; 陈金芝; 黄鹏榕; 尤民生
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2017-07-17
Filing date: 2017-07-17
Publication date: 2017-12-08
Anticipated expiration: 2037-07-17
Also published as: CN107446953B

Abstract

本发明公开了一种利用PCR产物抑制昆虫基因表达的方法，依次包括下述步骤：1）确定昆虫靶标基因，PCR扩增获得该基因的全基因序列并测序；2）根据步骤1）得到的DNA序列确定实验的DNA片段，PCR扩增并纯化DNA片段；3）将步骤2）得到的DNA片段利用微量注射的方法注射入昆虫体内；4）对步骤3）的昆虫进行RT‑qPCR的检测，确定其靶标基因的相对表达水平。

Description

一种利用PCR产物抑制昆虫基因表达的方法

技术领域

本发明涉及一种利用PCR产物抑制昆虫基因表达的方法，属于生物技术领域。

背景技术

同源依赖性基因沉默被广泛应用于分子生物学的研究，主要通过降低转录产物而减少蛋白的合成，从而使其丧失原有的功能。目前用于调控基因表达的同源片段大多数为反义RNA与双链RNA；随着研究的发现，DNA片段的导入也可引起基因的沉默，被称为DNA干扰（DNA interference）。

目前的研究指出，将铁线蕨内源基因的dsDNA片段引入配子体细胞可引起基因的沉默，使内源基因的表达量降低（Kawai-Toyooka H., Kuramoto C., Orui K., et al.DNA Interference: a Simple and Efficient Gene-Silencing System for High-Throughput Functional Analysis in the Fern Adiantum [J]. Plant and CellPhysiology, 2004, 45 (11): 1648-1657）；无启动子的基因在水蕨上也能导致合成叶绿素必需的镁螯合酶基因CrChlI以及CrFtsZ和CrUrod的基因沉默（Rutherford G,Tanurdzic M, HASEBE M, et al. A systemic gene silencing method suitable forhigh throughput, reverse genetic analyses of gene function in ferngametophytes [J]. BMC Plant Biology, 2004, 4(1): 6）；此外，在尾海鞘的胚胎中，导入纯化的PCR产物，也可使基因的表达量降低，且基因的5’UTR、3’UTR，以及外显子和内含子的导入都可引起基因的沉默（Omotezako T, Onuma T A, Nishida H. DNA interference:DNA-induced gene silencing in the appendicularian Oikopleura dioica [J].Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences, 2015, 282(1807):doi.org/10.1098/rspb. 2015.0435）；另外，将含有GFP基因全长cDNA序列的无启动子质粒转入整合有GFP基因的胰腺癌Panc-l细胞中，可观察到细胞中荧光的表达强度下降，且蛋白的表达也减少（任新瑜, 梁智勇, 师晓华, et al. 同源无启动子DNA片段抑制人胰腺癌细胞株整合基因的表达 [J]. 中华病理学杂志, 2007, 36(8):539-543）。

目前，虽然已在部分生物体内发现PCR产物抑制基因表达的现象，但是在昆虫中至今还未有报道。因此，我们结合这一现象设计了以下的试验，以求通过PCR产物来达到抑制小菜蛾基因的表达。

发明内容

针对上述问题，本发明公开了一种利用PCR产物抑制昆虫基因表达的方法。

本发明的技术方案如下：

一种利用PCR产物抑制昆虫基因表达的方法，依次包括下述步骤：

1）确定昆虫靶标基因，PCR扩增获得其DNA序列并测序；

2）根据步骤1）得到的DNA序列，确定外显子和内含子的DNA片段，分别PCR扩增并纯化得到实验所需的外显子与内含子DNA片段；

3）将步骤2）得到的外显子和内含子DNA片段利用微量注射的方法分别注射入昆虫体内；

4）对步骤3）的昆虫进行RT-qPCR的检测，确定其目的基因的相对表达水平。

步骤1）所述的靶标基因为小菜蛾鞣化激素α亚基基因（Bursα）（该基因mRNA的GenBank：KJ783481.1）。

步骤2）中设计的外显子DNA片段大小为122bp，内含子DNA片段大小为115bp。

步骤3）中的昆虫为福州敏感品系小菜蛾四龄幼虫。

步骤3）中用到的注射针是利用拉针仪，采用一步法所制得的毛细玻璃注射针。

步骤3）中注射的DNA片段浓度为100 - 400 ng/μL。

步骤4）中RT-qPCR检测的内参基因是核糖体蛋白L8基因。

步骤4）中基因的相对表达水平的计算采用2^-ΔΔCT方法。

本发明具有以下优点：

1．本发明提供的方法操作简单易行，DNA片段容易获得和保存。

2．本发明通过注射DNA可有效抑制基因表达。

3．本发明为昆虫的基因抑制提供了新思路和方向。

附图说明

图1为本发明具体实施例1注射PCR纯化产物后，鞣化激素α亚基基因的相对表达量。备注：在相同浓度下，相同字母间表示差异不显著，不同字母间表示差异显著。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明做进一步的详细说明，但不限定本发明。下述具体实施中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述具体实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。PCR所用的Taq酶购自厦门泰京生物技术有限公司，RNase-Free Water和qPCR反应试剂盒均购自普洛麦格生物技术有限公司，反转录试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，TRIzol试剂购自ambion公司，DNA合成与测序则在铂尚生物公司。

实验方法：

1．DNA片段的设计及扩增：选择靶标基因，PCR扩增得到基因全长，并将其送去测序获得基因序列；根据测序得到的DNA序列选取实验的片段，设计PCR引物，扩增后纯化待用。

2．注射：拉针并将针安装到Nanoliter2010 纳升微量注射泵上，吸取溶解成一定浓度的DNA片段并对实验昆虫进行注射。

3．取样：注射后24h取样，将样品用液氮保存后待用。

4．基因表达水平检测：提取保存样品的RNA，并反转录得到cDNA，利用qPCR试剂盒检测靶标基因的相对表达量。

实施例1

1. 确定小菜蛾鞣化激素α亚基基因为靶标基因，以小菜蛾基因组数据库中的小菜蛾鞣化激素α亚基基因为模板，设计一对引物。

上游引物01F：5＇- GATTTAACTGTTTGTCAAATGCA -3＇

上游引物01R：5＇- ACACTGATCAAGAGATTTATTATAGT -3＇

用上述引物进行PCR，得到大约750bp（包括部分5’UTR和3’UTR）的PCR产物。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后送于铂尚公司测序，测序结果表明PCR产物的核苷酸序列如SEQ IDNO. 1所示。

2. 小菜蛾精鞣化激素α亚基基因第二段外显子和第二段内含子扩增引物如下，PCR扩增并纯化后，稀释得到的产物（外显子SEQ ID NO. 2，内含子SEQ ID NO. 3）。稀释浓度为100 ng/μL，170 ng/μL，280 ng/μL，400ng/μL。

上游引物Exon2-F：5＇- AGGTTTCGGGAAGTAAAATCTG -3＇

上游引物Exon2-R：5＇- TTCGAAACTTCTTATCTTCACTTTTGG -3＇

上游引物Intron2-F：5＇- GTATCATCATCATCAGCCTATAGC -3＇

上游引物Intron2-R：5＇- AATGATGAGTTGCAGAAAGG -3＇

3. 利用拉针仪，采用一步法（温度设置在65℃）将毛细玻璃管制成微量注射针，180℃干燥灭菌2小时。

选取福州小菜蛾敏感品系四龄小菜蛾幼虫为供试虫体。

将已开口并灌入硅油的针安装到Nanoliter2010 纳升微量注射泵上，然后利用注射泵的控制装置将硅油打出，之后再吸取注射溶液入注射针中，确定注射针可以工作后，一手轻压虫体头部，一手持注射装置将针头从虫体背部接近尾部的地方插入，脚踩控制器两次，注射完成后拔出针头，再对另一只供试虫进行同样的操作，实验中，水与EGFP处理对照组组以及其他处理组的注射操作均参照上述的描述。

4. 将注射后的虫体按处理组分，放在不同的盒子内饲养。饲养温度26±1℃，饲养湿度60%-80%，每天供应新鲜的萝卜叶。

注射后的第24小时进行取样，每个处理三次生物学重复，每个重复取5头试虫。所有取出的样品用液氮冷冻后，于-80℃保存待用。

5. 用TRIzol试剂提取样品的RNA，再用反转录试剂盒将其反转录得到cDNA。根据小菜蛾核糖体蛋白L8基因序列（GenBank：XM_011559216）和小菜蛾鞣化激素α亚基基因序列（SEQ ID NO. 1），分别设计qPCR所需的引物对qRPL8-F/qRPL8-R和qBursα-F / qBursα-R。

qRPL8-F：5＇- CGGTCGTGCCTACCACAAATACA -3＇；

qRPL8-R：5＇- CGTGAGGATGCTCCACAGGGT -3＇；

qBursα-F：5＇- CCTGAGAGAGCGGATAGT -3＇；

qBursα-R：5＇- ATCATAGCAAACTCCTCC -3＇；

用qPCR反应试剂盒检测各样品cDNA中鞣化激素α亚基基因和核糖体L8基因的表达情况，然后采用2^-ΔΔCT方法计算精氨酸激酶基因的相对表达量。

6. 注射不同浓度纯化PCR产物后，对小菜蛾蛹期Bursα的表达量进行了检测，经单因素方差分析和S-N-K多重比较，发现不同浓度处理组组间存在显著差异。当注射浓度为100 ng/μL时，不同处理间基因表达量存在差异（F=4.385，df ₁=3，df ₂=8，P=0.042），且两处理组间基因的表达量无显著差异，但与水处理组间存在显著差异，分别下降了30.0%（注射外显子PCR产物，序列见SEQ ID NO. 2）和27.5%（注射内含子PCR产物，序列见SEQ ID NO. 3）。当注射浓度为170 ng/μL时，不同处理间基因表达量存在差异（F=14.684，df ₁=3，df ₂=8，P=0.001），且与水对照组相比，处理组Bursα的表达量分别下降了57.0%（注射外显子PCR产物）和68.0%（注射内含子PCR产物）；注射浓度为280 ng/μL时，不同处理间基因表达具有显著差异（F=19.035，df ₁=3，df ₂=8，P=0.001），且与水对照组相比，处理组Bursα的表达量分别下降了37.5%（注射外显子PCR产物）和58.3%（注射内含子PCR产物）；当注射浓度为400 ng/μL时，不同处理间基因表达具有显著差异（F=5.423，df ₁=3，df ₂=8，P=0.025），小菜蛾蛹期Bursα的表达量与水对照组相比明显被抑制，Bursα的表达量分别下降了57.0%（注射外显子PCR产物）和45.0%（注射内含子PCR产物）。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一种利用PCR产物抑制昆虫基因表达的方法

<130> 13

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 637

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgactccag taattcacgt gttacaacat cctggttgtg ttccaaagcc aataccttca 60

tttgcatgta tcggaaaatg tacaagctat gttcaggtac atttctgtac ttaacataat 120

tatcatgtgt tccatacacc tttctacata atatctaggt actctgtatg attcaattaa 180

caattttttt tttctaggtt tcgggaagta aaatctggca aatggagcgc acttgcaact 240

gttgtcaaga atctggagag cgagaagcta ccgtggtctt attttgccca aaggccaaaa 300

gtgaagataa gaagtttcga aaggtaaata aaatacaaat aagtaatgtg ttcaagttca 360

taagtatcat catcatcagc ctatagcagt ctgcagctgg acgtaggcct ctccaaaagc 420

acgcaatatt tcacggttat tgtcctagat tagcttattt tccctttctg caactcatca 480

ttactatgac ttttttcagg tttcaacaaa agctcccctt gagtgtatgt gtcgtccttg 540

tagtactatt gaagaaaacg ccataatgcc acaggaatta gccgcatatc ccgaggaatc 600

accacttcac aaccattata gaaaaacatt caactaa 637

<210> 2

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aggtttcggg aagtaaaatc tggcaaatgg agcgcacttg caactgttgt caagaatctg 60

gagagcgaga agctaccgtg gtcttatttt gcccaaaggc caaaagtgaa gataagaagt 120

ttcgaa 126

<210> 3

<211> 119

<212> DNA

<213> 人工序列

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gtatcatcat catcagccta tagcagtctg cagctggacg taggcctctc caaaagcacg 60

caatatttca cggttattgt cctagattag cttattttcc ctttctgcaa ctcatcatt 119

<210> 4

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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acactgatca agagatttat tatagt 26

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aggtttcggg aagtaaaatc tg 22

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<213> 人工序列

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ttcgaaactt cttatcttca cttttgg 27

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gtatcatcat catcagccta tagc 24

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<212> DNA

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<400> 9

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cggtcgtgcc taccacaaat aca 23

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<212> DNA

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<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

atcatagcaa actcctcc 18

Claims

1.一种利用PCR产物抑制昆虫基因表达的方法，其特征在于，依次包括下述步骤：

1）确定昆虫靶标基因，PCR扩增获得该基因的全基因序列并测序；

2）根据步骤1）得到的全基因序列，在外显子和内含子上分别确定PCR扩增区域，并PCR扩增和纯化得到实验所需的外显子与内含子DNA片段；

3）将步骤2）得到的外显子和内含子DNA片段，利用微量注射的方法分别注射入昆虫体内；

4）对步骤3）的昆虫进行RT-qPCR的检测，确定其靶标基因的相对表达水平。

2.根据权利要求1所述的一种利用DNA的PCR产物抑制昆虫基因表达的方法，其特征在于，步骤1）所述的靶标基因为小菜蛾鞣化激素α亚基基因。

3.根据权利要求1所述的一种利用PCR产物抑制基因表达的方法，其特征在于，步骤2）中设计的外显子DNA片段大小为122bp，内含子DNA片段大小为115bp。

4.根据权利要求1所述的一种利用PCR产物抑制昆虫基因表达的方法，其特征在于，步骤3）中的昆虫为福州敏感品系小菜蛾四龄幼虫。

5.根据权利要求1所述的一种利用PCR产物抑制昆虫基因表达的方法，其特征在于，步骤3）中用到的注射针是利用拉针仪，采用一步法所制得的毛细玻璃注射针。

6.根据权利要求1所述的一种利用PCR产物抑制昆虫基因表达的方法，其特征在于，步骤3）中注射的DNA片段浓度为100 - 400 ng/μL。

7.根据权利要求1所述的一种利用PCR产物抑制昆虫基因表达的方法，其特征在于，步骤4）中RT-qPCR检测的内参基因是核糖体蛋白L8基因。

8.根据权利要求1所述的一种利用PCR产物抑制昆虫基因表达的方法，其特征在于，步骤4）中基因的相对表达水平的计算采用2^-ΔΔCT。