CN104413145A - 一种抑制杨梅青霉和灰霉病菌菌落生长的方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于公开一种抑制杨梅青霉和灰霉病菌菌落生长的方法，其通过加入茶多酚溶液对杨梅进行处理；与现有技术相比，茶多酚溶液能够有效地抑制抑制杨梅青霉和灰霉病菌菌落生长，且茶多酚溶液对杨梅青霉和灰霉混合真菌不仅有抑菌作用，且有杀菌作用，既达到抑菌目的，又可节约成本，用茶多酚溶液来浸泡果实，能达到防腐保鲜的目的，实现本发明的目的。

Description

一种抑制杨梅青霉和灰霉病菌菌落生长的方法

技术领域

本发明涉及一种抑制病菌菌落生长的方法，特别涉及一种抑制杨梅青霉和灰霉病菌菌落生长的方法。 

背景技术

杨梅，又名龙晴、朱红，因其形似水杨子、味道似梅子，因而取名杨梅。杨梅原产我国温带、亚热带湿润气候的山区，主要分布在长江流域以南、海南岛以北，即北纬20度至31度之间，与柑桔、枇杷、茶树、毛竹等分布相仿，但其抗寒能力比柑桔、枇杷强。目前分布的省份有云南、贵州、浙江、江苏、福建、广东、湖南、广西、江西、四川、安徽、台湾等，其中以浙江的栽培面积最大，品种质量最优，产量也最高。其次是江苏、福建与广东。国外，如日本和韩国有少量栽培，东南亚各国，如印度、缅甸、越南、菲律宾等国也有分布，但因其果形小、味酸，多种植在庭院供作观赏，或作糖渍食用，没有作为经济果树栽培。 

然而，杨梅果实在贮藏、运输时极易受到病菌侵染而造成腐烂。其中，杨梅青霉和灰霉病就是杨梅果实在贮藏、运输期间危害最严重的几种真菌性病害。据统计，杨梅果实在贮运期因病腐烂达10%-30%，严重时可高达50%以上。其中因感染青霉和灰霉病导致的腐果数，一般占贮藏期总腐果数的70%-80%。 

杨梅青霉病菌属真菌半知菌亚门，丝孢目，青霉属。分生孢子梗从菌丝丛中长出，直立，有3次以上的帚状分枝，间枝1-4个；小梗顶端较尖细，呈瓶梗状。分生孢子顶端串生，无色，单胞，初为圆筒形，成熟后为椭圆形至亚球形。菌丝生长温度范围为6-33℃，最适为27℃；分生孢子形成的最适温度为20℃，低于15℃和高于30℃时不易形成。空气中二氧化碳浓度较高时，可以抑制该菌分生孢子的形成。杨梅青霉病菌可腐生于多种有机物质上，并产生大量分生孢子，在空气中扩散，通过气流传播，从伤口侵入，引起果腐。之后在病部又以分生孢子进行重复侵染。在贮藏库中，杨梅青霉病菌侵入果皮后，还能分泌一种挥发性物质，损伤接触到的健果果皮，从而引起接触传染。因此杨梅青霉病是杨梅采摘后发生最多、分布最广、危害最严重的侵染性病害。动物试验还表明,病菌所产生的真菌霉素对肝脏、肾脏以及神经系统均有毒害作用。 

灰霉病由灰葡萄孢菌侵染所致，属真菌病害，花、果、叶、茎均可发病。果实染病，青果受害重，残留的柱头或花瓣多先被侵染，后向果实或果柄扩展，致使果皮呈灰白色，并生有厚厚的灰色霉层，呈水腐状，叶片发病从叶尖开始，沿叶脉间成“V”形向内扩展，黄褐色，边有深浅相间的纹状线，病键交界分明。灰霉病病苗色浅，叶片、叶柄发病呈灰白色，水渍状，组织软化至腐烂，高湿时表面生有灰霉。幼茎多在叶柄基部初生不规则水浸斑，很快变软腐烂，缢缩或折倒，最后病苗腐烂枯死。 

目前,控制杨梅青霉病病害的主要手段是使用化学杀菌剂，如托 布津、多菌灵、抑霉唑乳油等，但长期使用化学杀菌剂会使病原菌产生较强的抗药性，在杨梅中的残留毒性物质对人类健康也存在着潜在的威胁。 

茶多酚是茶叶中多酚类物质的总称，包括黄烷醇类、花色苷类、黄酮类、黄酮醇类和酚酸类等。其中以黄烷醇类物质最为重要。茶多酚又称茶鞣或茶单宁，是形成茶叶色香味的主要成份之一，也是茶叶中有保健功能的主要成份之一。本草千叶IT茶中含有丰富的茶多酚。茶多酚具有很强的抗氧化作用，其抗氧化能力是人工合成抗氧化剂BHT、BHA的4-6倍，是VE的6-7倍，VC的5-10倍，且用量少：0.01-0.03％即可起作用，而无合成物的潜在毒副作用；而茶素对食品中的色素和维生素类有保护作用，使食品在较长时间内保持原有色泽与营养水平，能有效防止食品、食用油类的腐败，并能消除异味。茶多酚可用于食品保鲜防腐，无毒副作用，食用安全。茶多酚参入其他有机物（主要是食品）中，能够延长贮存期，防止食品退色，提高纤维素稳定性，有效保护食品各种营养成份。相比较与其他的化学农药而言，茶多酚作为一种生物农药，对于人体而言，更加的环保无污染。 

目前国内外对于茶多酚的研究主要以茶多酚的药理、病理、毒理学以及茶多酚的保颜、保鲜及除臭作用为主，其中对细菌的作用研究较多，而对真菌的作用研究较少。众所周知，植物多酚对微生物（包括丝状真菌、酵母、细菌、病毒）具有广谱抗性，对植物、动物和其他环境中多种微生物的生长都有明显的抑制作用。现有的研究证明，茶叶中的EGC、EGCG能有效抑制伤寒杆菌、副伤寒杆菌、黄色溶 血葡萄球菌、金黄色链球菌、痢疾杆菌等病原菌。 

因此，特别需要一种抑制杨梅青霉和灰霉病菌菌落生长的方法，已解决上述现有存在的问题。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种抑制杨梅青霉和灰霉病菌菌落生长的方法，针对现有技术的不足，能够有效地抑制抑制杨梅青霉和灰霉病菌菌落生长，既达到抑菌目的，又可节约成本。 

本发明所解决的技术问题可以采用以下技术方案来实现： 

一种抑制杨梅青霉和灰霉病菌菌落生长的方法，其特征在于，其通过加入茶多酚溶液对杨梅进行处理。 

在本发明的一个实施例中，所述处理方式包括碰洒或者浸泡。 

在本发明的一个实施例中，所述茶多酚溶液的浓度为5-10mg/mL。 

本发明的抑制杨梅青霉和灰霉病菌菌落生长的方法，与现有技术相比，茶多酚溶液能够有效地抑制抑制杨梅青霉和灰霉病菌菌落生长，且茶多酚溶液对杨梅青霉和灰霉混合真菌不仅有抑菌作用，且有杀菌作用，既达到抑菌目的，又可节约成本，用茶多酚溶液来浸泡果实，能达到防腐保鲜的目的，实现本发明的目的。 

本发明的特点可参阅本案以下较好实施方式的详细说明而获得清楚地了解。 

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体，进一步阐述本发明。 

本发明的抑制杨梅青霉和灰霉病菌菌落生长的方法，其通过加入茶多酚溶液对杨梅进行处理。 

在本发明中，所述处理方式包括碰洒或者浸泡。 

在本发明中，所述茶多酚溶液的浓度为5-10mg/mL。 

实施例 

供试菌种：杨梅青霉和灰霉病菌。 

供试药剂：茶多酚，茶多酚含量50%。 

实验方法：采用平板速率法，通过计数菌落数目进行平板速率抑菌实验；采用悬滴法测定孢子萌发率，进行孢子萌发抑菌实验。 

平板菌落计数法（涂布法）： 

配制马铃薯、蔗糖糖、琼脂培养基(PSA)；将2种病菌预培养（25℃、）2-5天,待长出孢子；配5种浓度茶多酚母液（100.00mg/mL、50.00mg/mL、33.30mg/mL、25.00mg/mL、20.00mg/mL）。 

设茶多酚平板浓度为10.00mg/mL、5.00mg/mL、3.33mg/mL、2.50mg/mL、2.00mg/mL共5个浓度梯度，无菌水为对照（CK），共6项处理。将2种菌分别配制104的孢子悬浮液，然后各取5mL混合摇匀，最终混合菌浓度为104个/mL。分别在灭菌培养皿内加入对应浓度的茶多酚母液1mL和对照加入等量无菌水，将冷却至45℃左右 的培养基倒入各培养皿中，立即摇匀将其制成平板。然后取混合孢子悬浮液0.2mL于各平板中央,然后用涂布棒将菌液涂匀,每处理重复六皿（三皿拍照，三皿计数），置25℃恒温箱中培养。每天观察计算各处理的菌落数目（计算三皿平均菌落数）并拍照，直至第8天止。同时记录菌落形态、颜色等变化，然后用统计方法（方差分析）计算平均菌落抑制率。筛选出抑制效果最好的茶多酚浓度。 

孢子萌发抑菌实验 

悬滴法： 

设茶多酚浓度为10.00mg/mL、5.00mg/mL、3.33mg/mL、2.50mg/mL、2.00mg/mL共5个浓度梯度（用对应的母液配制），无菌水为对照（CK），共6个处理。将灰霉菌，青霉菌培养一定时间，待其产生孢子后，分别制成不同浓度的茶多酚和2种混合菌孢子悬浮液104个/mL，每视野达15-20个孢子，每处理重复二皿；置25℃恒温箱中悬滴培养24h（视对照的发芽情况而定），每4h镜检1次，孢子的萌发以芽管的长度超过孢子宽度约一半为标准[11]。每处理镜检200个孢子，每处理重复3次。分别计算各处理的分生孢子萌发率；并显微摄影不同处理的分生孢子和对照的分生孢子的萌发形态，最后用统计方法（方差分析）计算平均孢子萌发抑制率。筛选出抑制效果最好的茶多酚浓度。 

平板速率抑菌实验结果表明，五种浓度的茶多酚对杨梅青霉和灰霉病菌菌落都具有抑制作用。菌落数目观察得出，除在作用的第一天内杨梅青霉和灰霉病菌菌落数目随着茶多酚浓度增大而逐渐变小，呈现出了茶多酚对该混合菌菌落一定的抑制作用外，在接下来的九天内菌落生长都未呈现出规律性的变化。（见表1） 

表1不同浓度的茶多酚对青霉和灰霉菌菌落生长的抑制作用 

由上表可计算出菌落的抑菌率（见表2） 

表2不同浓度的茶多酚对青霉和灰霉菌菌落生长的抑制率 

由表2可以看出在第一天时，10.00mg/mL的茶多酚抑制率达到最大的81.38%，而到第四天时，只有63.69%，其余各浓度也均成下降趋势，这种现象是否是由于随时间的增加，而导致茶多酚的抑制作用逐渐降低，还有待研究。就其平均抑制率来看，其中5.00mg/mL和10.00mg/mL茶多酚抑制效果最好，其菌落抑制率分别达55.04%和73.35%。 

10.00mg/mL茶多酚浓度下的菌落与CK的菌落相比，10.00mg/mL未发现明显菌落，相对于CK而言，抑菌作用相当显著。随茶多酚浓度的增加，混合真菌受抑制作用越强，而导致菌落越少。CK由于无茶多酚抑制，其菌落生长明显比10.00mg/mL的旺盛。 

孢子萌发抑菌实验表明，24小时内，不同浓度茶多酚对杨梅青霉和灰霉病菌的分生孢子有较强的抑制作用，并且随浓度的升高抑制作用增强。 

表2显示了24小时中不同浓度茶多酚对杨梅青霉病菌分生孢子萌发的抑制效果。同一时间，5.00mg/mL、10.00mg/mL处理的孢子萌 

发抑制率均高于其他浓度处理的抑制率，第16小时起，作用愈加显著。在第16小时，10.00mg/mL的茶多酚对孢子萌发的抑制率达到91.38%；第24h时，5.00mg/mL的茶多酚对孢子萌发的抑制率在86.44%左右，而10.00mg/mL的茶多酚对孢子萌发的抑制率达到88.25%；随着时间推移，5.00mg/mL和10.00mg/mL处理下的抑制率越来越接近。因此可以推断，5.00mg/mL和10.00mg/mL茶多酚抑制效果最好。 

表3不同浓度茶多酚对杨梅青霉和灰霉病菌孢子萌发的抑制率（%） 

表3-1单因素（浓度）固定效应模型方差分析表 

表3-2Duncan检验表1 

表3-3Duncan检验表2 

由上表可以看出，除了2.50mg/mL对2.00mg/mL是显著外，其余浓度对2.00mg/mL均为极显著。同理，可以看出10.00mg/mL，5.00mg/mL，3.33mg/mL对2.50mg/mL为极显著。10.00mg/mL，5.00mg/mL对3.33mg/mL均为极显著。10.00mg/mL对5.00mg/mL为不显著。 

由上可见，10.00mg/mL下茶多酚把孢子的细胞膜破坏，原生质外溢，孢子畸形。Ck的孢子萌发，孢子梗生长很茁壮；其余3.33mg/mL，2.50mg/mL，2.00mg/mL茶多酚浓度下孢子梗均有一定程度长出。明显可见，茶多酚浓度越高，对孢子的萌发抑制作用越强。5.00mg/mL下茶多酚的抑制作用也比较明显，孢子梗未明显长出，从另一方面证明了5.00mg/mL和10.00mg/mL茶多酚抑制效果最好。 

孢子萌发抑菌实验的结果显示：24小时内，不同浓度的茶多酚 对杨梅青霉和灰霉病菌孢子的萌发都具有抑制作用；浓度越高，抑制作用越强。此结果与平板速率法中第一天观测到的数据相吻合。其中10.00mg/mL、5.00mg/mL浓度的茶多酚对孢子萌发的抑制作用非常明显，抑制率分别达到了86.44%和88.25%；与CK相比，差异均极显著(P<0.01)。200×显微观察发现，分生孢子经茶多酚处理后，孢子皱缩，内容物益处，芽管畸形，高浓度下孢子基本不能萌发，说明茶多酚在一定时间内对杨梅青霉和灰霉病菌分生孢子有显著的抑制效果。 

不同浓度的茶多酚溶液对二种混合真菌都有不同程度的抑制作用。随着浓度的增大，其抑制率增强，其中5.00mg/mL和10.00mg/mL茶多酚抑制效果最好，其菌落抑制率分别达55.04%和73.35%；孢子萌发抑制率分别达86.44%和88.25%，且分生孢子畸形，细胞壁破裂，原生质外溢，说明茶多酚对杨梅青霉和灰霉混合真菌不仅有抑菌作用，且有杀菌作用。 

茶多酚对分生孢子的萌发表现出了较好的抑制活性，如能有效地抑制杨梅青霉病菌的繁殖，则值得进一步研究。由于10.00mg/mL与3.33mg/mL、2.50mg/mL、2.00mg/ml、CK处理的差异极显著，但与5.00mg/mL处理的差异不显著，且抑制作用时间较短；2.00mg/ml、2.50mg/mL、3.33mg/mL三项处理之间差异极显著，但抑制率较低，抑制效用稳定性不佳，因此，从抑制率、抑制时间和抑制稳定性等方面综合考虑，可选择5.00mg/mL浓度作为短期内抑制柑桔青霉病菌孢子萌发的最佳浓度，既达到抑菌目的，又可节约成本。储藏杨梅果实时，也可用5.00mg/mL浓度茶多酚来浸泡果实，达到防腐保鲜的 目的。 

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内，本发明要求保护等效物界定。 

Claims (3)

1.一种抑制杨梅青霉和灰霉病菌菌落生长的方法，其特征在于，其通过加入茶多酚溶液对杨梅进行处理。

2.如权利要求1所述的抑制杨梅青霉和灰霉病菌菌落生长的方法，其特征在于，所述处理方式包括碰洒或者浸泡。

3.如权利要求1所述的抑制杨梅青霉和灰霉病菌菌落生长的方法，其特征在于，所述茶多酚溶液的浓度为5-10mg/mL。