CN104407139A - 一种多重功能化石墨烯黑色素瘤传感器的制备方法及应用 - Google Patents

一种多重功能化石墨烯黑色素瘤传感器的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种多重功能化石墨烯黑色素瘤传感器的制备方法及应用。属于新型功能材料与生物传感检测技术领域。本发明具体是采用金纳米粒子和四氧化三铁纳米粒子多重功能化的石墨烯，实现了对黑色素瘤抗原的高灵敏检测，对黑色素瘤的早期诊断具有重要的意义。

Description

一种多重功能化石墨烯黑色素瘤传感器的制备方法及应用
技术领域
本发明一种多重功能化石墨烯黑色素瘤传感器的制备方法及应用。具体是采用金纳米粒子和四氧化三铁纳米粒子多重功能化的石墨烯，制备一种检测黑色素瘤抗原的电化学免疫传感器，属于新型功能材料与生物传感检测技术领域。
背景技术
黑色素瘤是由皮肤和其他器官黑素细胞产生的肿瘤，虽其发病率低，但其恶性度高，转移发生早，死亡率高，因此对黑色素瘤的早期诊断、早期治疗很重要。目前已有的肿瘤标志物的临床检测方法很多，如放射免疫分析、酶联免疫分析、化学发光免疫分析等。电化学免疫传感器是将免疫学方法与电化学方法相结合的一种生物传感器，利用抗原与抗体之间的特性性结合，使得它具有高灵敏性、高选择性、分析快速和操作简便等优点。因此本发明制备了一种多重功能化石墨烯电化学免疫传感器，实现了对黑色素瘤抗原的检测。
本发明利用四氧化三铁粒子对双氧水具有良好的电化学催化性能，将四氧化三铁纳米粒子与氧化石墨烯相结合，得到了四氧化三铁功能化的磁性石墨烯，解决了单独使用四氧化三铁纳米粒子催化双氧水导电性差的问题。金纳米粒子用于进一步功能化磁性石墨烯，利用金纳米粒子和四氧化三铁纳米粒子之间的协同作用，进一步增强对双氧水的电化学催化性能。在检测黑色素瘤抗原的过程中产生了逐步放大的电化学信号，有效地增强了电化学免疫传感器的灵敏度。该方法具有成本低、灵敏度高、特异性好、检测快速等优点，而且制备过程较为简单，克服了目前黑色素瘤抗原检测方法的不足。
发明内容
本发明的目的之一是基于金纳米粒子和四氧化三铁纳米粒子多重功能化的石墨烯，构建了一种无酶、快速且超灵敏的夹心型电化学免疫传感器。
本发明的目的之二是将该夹心型电化学免疫传感器应用于黑色素瘤抗原的检测。
本发明的技术方案如下：
1. 多重功能化石墨烯黑色素瘤传感器的制备方法：
（1）依次用1.0、0.3、0.05 μm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，分别在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；
（2）在电极表面滴加6 μL浓度为1 ~ 3 mg/mL的金杂化的巯基化石墨烯水溶液，干燥；
（3）继续将6 μL浓度为8 ~ 12 μg/mL的黑色素瘤捕获抗体溶液滴加到修饰电极表面，于4℃冰箱中孵化1 h，清洗干净；
（4）用3 μL浓度为5~15 mg/mL的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4℃冰箱中孵化1 h，清洗干净；
（5）将6 μL浓度为0.00001 ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的黑色素瘤抗原用于捕获抗体的特异性识别，室温下孵化1 h，清洗干净；
（6）将6 μL浓度为1 ~ 3 mg/mL的多重功能化石墨烯标记的黑色素瘤检测抗体溶液滴在电极上与抗原特异性识别，室温下孵化1 h，清洗干净，于4℃冰箱中储存备用。
多重功能化石墨烯标记的黑色素瘤检测抗体溶液的制备方法
（1）多重功能化石墨烯的制备
将0.1 ~ 1.0 g氯化铁溶解在5 ~ 15 mL的乙二醇溶液中，随后加入1.0 ~ 2.0 g的醋酸钠、4 ~ 6 mL 乙二胺和0.4 ~0.6 mg的氧化石墨烯，将混合物溶液搅拌30 min，转入不锈钢反应釜中，200℃反应8 h，冷却至室温，用乙醇离心洗涤3次，真空下干燥，得到四氧化三铁纳米粒子功能化的磁性石墨烯；将10 ~ 30 mg该磁性石墨烯和20 ~ 60 mL的金纳米粒子溶液混合，震荡12 h，离心洗涤后，真空干燥，制得金纳米粒子和四氧化三铁纳米粒子功能化的石墨烯，即多重功能化石墨烯。
（2）多重功能化石墨烯标记的黑色素瘤检测抗体溶液的制备
将1 mL浓度为1 ~ 3 mg/mL的多重功能化石墨烯溶液与1 mL浓度为5 ~ 15 μg/mL黑色素瘤检测抗体混合，震荡12 h，离心洗涤，得到多重功能化石墨烯标记的黑色素瘤检测抗体孵化物，将其分散于1 mL、 pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，制得多重功能化石墨烯标记的黑色素瘤检测抗体溶液，于4℃冰箱中储存备用。
黑色素瘤抗原的检测步骤
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的免疫传感器为工作电极，在10 mL的pH值为6.8的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）选择计时电流法对黑色素瘤抗原进行检测，将输入电压设置为-0.4 V，取样间隔设置为0.1 s，运行时间设置为400 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向磷酸盐缓冲溶液中注入10 μL浓度为5 mol/L的双氧水溶液，然后记录电流随时间的变化，绘制工作曲线；
（4）将待测样品溶液代替黑色素瘤抗原标准溶液进行检测。
本发明的有益成果
（1）本发明将四氧化三铁纳米粒子与氧化石墨烯有机结合，制备了四氧化三铁功能化的磁性石墨烯，解决了单独使用四氧化三铁纳米粒子催化双氧水导电性差的问题。
（2）本发明利用金纳米粒子进一步功能化磁性石墨烯，充分发挥了金纳米粒子和四氧化三铁纳米粒子之间的协同作用，进一步增强对双氧水的电化学催化性能，实现了信号的多重放大，显著提高了电化学免疫传感器的灵敏度。
（3）本发明将制备的夹心电化学免疫传感器用于黑色素瘤抗原的检测，检测限低，线性范围宽，可以实现简单、快速、灵敏和特异性检测。本发明对黑色素瘤抗原检测线性范围为0.00001 ~ 100 ng/mL，检测限达到3 fg/mL。
具体实施方式
实施例1多重功能化石墨烯黑色素瘤传感器的制备方法
（1）依次用1.0、0.3、0.05 μm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，分别在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；
（2）在电极表面滴加6 μL浓度为1 mg/mL的金杂化的巯基化石墨烯水溶液，干燥；
（3）继续将6 μL浓度为8 μg/mL的黑色素瘤捕获抗体溶液滴加到修饰电极表面，于4℃冰箱中孵化1 h，清洗干净；
（4）用3 μL浓度为5 mg/mL的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4℃冰箱中孵化1 h，清洗干净；
（5）将6 μL浓度为0.00001 ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的黑色素瘤抗原用于捕获抗体的特异性识别，室温下孵化1 h，清洗干净；
（6）将6 μL浓度为1 mg/mL的多重功能化石墨烯标记的黑色素瘤检测抗体溶液滴在电极上与抗原特异性识别，室温下孵化1 h，清洗干净，于4℃冰箱中储存备用。
实施例2多重功能化石墨烯黑色素瘤传感器的制备方法
（1）依次用1.0、0.3、0.05 μm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，分别在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；
（2）在电极表面滴加6 μL浓度为2 mg/mL的金杂化的巯基化石墨烯水溶液，干燥；
（3）继续将6 μL浓度为10 μg/mL的黑色素瘤捕获抗体溶液滴加到修饰电极表面，于4℃冰箱中孵化1 h，清洗干净；
（4）用3 μL浓度为10 mg/mL的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4℃冰箱中孵化1 h，清洗干净；
（5）将6 μL浓度为0.00001 ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的黑色素瘤抗原用于捕获抗体的特异性识别，室温下孵化1 h，清洗干净；
（6）将6 μL浓度为2 mg/mL的多重功能化石墨烯标记的黑色素瘤检测抗体溶液滴在电极上与抗原特异性识别，室温下孵化1 h，清洗干净，于4℃冰箱中储存备用。
实施例3多重功能化石墨烯黑色素瘤传感器的制备方法
（1）依次用1.0、0.3、0.05 μm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，分别在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；
（2）在电极表面滴加6 μL浓度为3 mg/mL的金杂化的巯基化石墨烯水溶液，干燥；
（3）继续将6 μL浓度为12 μg/mL的黑色素瘤捕获抗体溶液滴加到修饰电极表面，于4℃冰箱中孵化1 h，清洗干净；
（4）用3 μL浓度为15 mg/mL的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4℃冰箱中孵化1 h，清洗干净；
（5）将6 μL浓度为0.00001 ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的黑色素瘤抗原用于捕获抗体的特异性识别，室温下孵化1 h，清洗干净；
（6）将6 μL浓度为3 mg/mL的多重功能化石墨烯标记的黑色素瘤检测抗体溶液滴在电极上与抗原特异性识别，室温下孵化1 h，清洗干净，于4℃冰箱中储存备用。
实施例4多重功能化石墨烯标记的黑色素瘤检测抗体溶液的制备方法
（1）多重功能化石墨烯的制备
将0.1 g氯化铁溶解在5 mL的乙二醇溶液中，随后加入1.0 g的醋酸钠、4 mL 乙二胺和0.4 mg的氧化石墨烯，将混合物溶液搅拌30 min，转入不锈钢反应釜中，200℃反应8 h，冷却至室温，用乙醇离心洗涤3次，真空下干燥，得到四氧化三铁纳米粒子功能化的磁性石墨烯；将10 mg该磁性石墨烯和20 mL的金纳米粒子溶液混合，震荡12 h，离心洗涤后，真空干燥，制得金纳米粒子和四氧化三铁纳米粒子功能化的石墨烯，即多重功能化石墨烯。
（2）多重功能化石墨烯标记的黑色素瘤检测抗体溶液的制备
将1 mL浓度为1 mg/mL的多重功能化石墨烯溶液与1 mL浓度为5 μg/mL黑色素瘤检测抗体混合，震荡12 h，离心洗涤，得到多重功能化石墨烯标记的黑色素瘤检测抗体孵化物，将其分散于1 mL、 pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，制得多重功能化石墨烯标记的黑色素瘤检测抗体溶液，于4℃冰箱中储存备用。
实施例5多重功能化石墨烯标记的黑色素瘤检测抗体溶液的制备方法
（1）多重功能化石墨烯的制备
将0.5 g氯化铁溶解在10 mL的乙二醇溶液中，随后加入1.5 g的醋酸钠、5 mL 乙二胺和0.5 mg的氧化石墨烯，将混合物溶液搅拌30 min，转入不锈钢反应釜中，200℃反应8 h，冷却至室温，用乙醇离心洗涤3次， 
真空下干燥，得到四氧化三铁纳米粒子功能化的磁性石墨烯；将20 mg该磁性石墨烯和40 mL的金纳米粒子溶液混合，震荡12 h，离心洗涤后，真空干燥，制得金纳米粒子和四氧化三铁纳米粒子功能化的石墨烯，即多重功能化石墨烯。
（2）多重功能化石墨烯标记的黑色素瘤检测抗体溶液的制备
将1 mL浓度为2 mg/mL的多重功能化石墨烯溶液与1 mL浓度为10 μg/mL黑色素瘤检测抗体混合，震荡12 h，离心洗涤，得到多重功能化石墨烯标记的黑色素瘤检测抗体孵化物，将其分散于1 mL、 pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，制得多重功能化石墨烯标记的黑色素瘤检测抗体溶液，于4℃冰箱中储存备用。
实施例6多重功能化石墨烯标记的黑色素瘤检测抗体溶液的制备方法：
（1）多重功能化石墨烯的制备
将1.0 g氯化铁溶解在15 mL的乙二醇溶液中，随后加入2.0 g的醋酸钠、6 mL 乙二胺和0.6 mg的氧化石墨烯，将混合物溶液搅拌30 min，转入不锈钢反应釜中，200℃反应8 h，冷却至室温，用乙醇离心洗涤3次， 
真空下干燥，得到四氧化三铁纳米粒子功能化的磁性石墨烯；将30 mg该磁性石墨烯和60 mL的金纳米粒子溶液混合，震荡12 h，离心洗涤后，真空干燥，制得金纳米粒子和四氧化三铁纳米粒子功能化的石墨烯，即多重功能化石墨烯。
（2）多重功能化石墨烯标记的黑色素瘤检测抗体溶液的制备
将1 mL浓度为3 mg/mL的多重功能化石墨烯溶液与1 mL浓度为15 μg/mL黑色素瘤检测抗体混合，震荡12 h，离心洗涤，得到多重功能化石墨烯标记的黑色素瘤检测抗体孵化物，将其分散于1 mL、 pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，制得多重功能化石墨烯标记的黑色素瘤检测抗体溶液，于4℃冰箱中储存备用。
实施例7黑色素瘤抗原的检测步骤
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的免疫传感器为工作电极，在10 mL的pH值为6.8的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）选择计时电流法对黑色素瘤抗原进行检测，将输入电压设置为-0.4 V，取样间隔设置为0.1 s，运行时间设置为400 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向磷酸盐缓冲溶液中注入10 μL浓度为5 mol/L的双氧水溶液，然后记录电流随时间的变化，绘制工作曲线；
（4）将待测样品溶液代替黑色素瘤抗原标准溶液进行检测。
（5）该电化学免疫传感器对黑色素瘤抗原检测线性范围为0.00001 ~ 100 ng/mL，检测限3 fg/mL。

Claims (3)

1.一种多重功能化石墨烯黑色素瘤传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）依次用1.0、0.3、0.05 μm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，分别在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；
（2）在电极表面滴加6 μL浓度为1 ~ 3 mg/mL的金杂化的巯基化石墨烯水溶液，干燥；
（3）将6 μL浓度为8 ~ 12 μg/mL的黑色素瘤捕获抗体溶液滴加到修饰电极表面，于4℃冰箱中孵化1 h，清洗干净；
（4）用3 μL浓度为5~15 mg/mL的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4℃冰箱中孵化1 h，清洗干净；
（5）将6 μL浓度为0.00001 ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的黑色素瘤抗原用于捕获抗体的特异性识别，室温下孵化1 h，清洗干净；
（6）将6 μL浓度为1 ~ 3 mg/mL的多重功能化石墨烯标记的黑色素瘤检测抗体溶液滴在电极上与抗原特异性识别，室温下孵化1 h，清洗干净，于4℃冰箱中储存备用。
2.如权利要求1所述的一种多重功能化石墨烯黑色素瘤传感器的制备方法，所述多重功能化石墨烯标记的黑色素瘤检测抗体溶液的制备，其特征在于，包括以下步骤：
（1）多重功能化石墨烯的制备
将0.1 ~ 1.0 g氯化铁溶解在5 ~ 15 mL的乙二醇溶液中，随后加入1.0 ~ 2.0 g的醋酸钠、4 ~ 6 mL 乙二胺和0.4 ~0.6 mg的氧化石墨烯，将混合物溶液搅拌30 min，转入不锈钢反应釜中，200℃反应8 h，冷却至室温，用乙醇离心洗涤3次，真空下干燥，得到四氧化三铁纳米粒子功能化的磁性石墨烯；将10 ~ 30 mg该磁性石墨烯和20 ~ 60 mL的金纳米粒子溶液混合，震荡12 h，离心洗涤后，真空干燥，制得金纳米粒子和四氧化三铁纳米粒子功能化的石墨烯，即多重功能化石墨烯；
（2）多重功能化石墨烯标记的黑色素瘤检测抗体溶液的制备
将1 mL浓度为1 ~ 3 mg/mL的多重功能化石墨烯溶液与1 mL浓度为5 ~ 15 μg/mL黑色素瘤检测抗体混合，震荡12 h，离心洗涤，得到多重功能化石墨烯标记的黑色素瘤检测抗体孵化物，将其分散于1 mL、 pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，制得多重功能化石墨烯标记的黑色素瘤检测抗体溶液，于4℃冰箱中储存备用。
3.如权利要求1所述的制备方法制备的一种多重功能化石墨烯黑色素瘤传感器，其特征在于，用于黑色素瘤抗原的检测，检测步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的免疫传感器为工作电极，在10 mL的pH值为6.8的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）选择计时电流法对黑色素瘤抗原进行检测，将输入电压设置为-0.4 V，取样间隔设置为0.1 s，运行时间设置为400 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向磷酸盐缓冲溶液中注入10 μL浓度为5 mol/L的双氧水溶液，然后记录电流随时间的变化，绘制工作曲线；
（4）将待测样品溶液代替黑色素瘤抗原标准溶液进行检测。
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