CN104404004A - 鸡新型新城疫疫苗病毒毒株rClone30-chIL15及其应用 - Google Patents
鸡新型新城疫疫苗病毒毒株rClone30-chIL15及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种鸡新型新城疫病毒毒株及其应用。本发明提供的鸡新城疫病毒毒株，其制备方法包括如下步骤：将重组质粒pBrClone30-chIL15和辅助质粒pBL-N、pBL-P和pBL-L共转染哺乳动物细胞BHK-21并培养，得到所述鸡新城疫病毒毒株；所述重组质粒pBrClone30-chIL15为具有序列表的序列1所示的DNA分子的质粒。序列表的序列3自5ˊ末端第2703-18546位核苷酸即为rClone30-chIL15病毒的基因组DNA。本发明通过在现有新城疫活疫苗基因组中引入分子佐剂chIL15，可以有效提高免疫效果，提高免疫保护率。本发明对于新城疫病的防治具有重大意义。
Description
技术领域
本发明涉及鸡新型新城疫病毒毒株rClone30-chIL15及其应用。
背景技术
新城疫病（Newcastle Disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle Disease Virus，NDV）引起的禽类高度接触性和急性败血性的烈性传染病，对世界养禽业危害极为严重。NDV病毒作为单股负链的RNA病毒其宿主范围很广，其中以鸡的易感性最高且幼鸡的发病率和死亡率明显高于大龄鸡，一年四季均可以发生，但主要以春季发病较多。仅过去三年新城疫就发病1252起，涉及19个省、市、自治区，发病家禽近四十万羽，死亡二十万羽，捕杀十五余万羽。
目前我国则一直采用以疫苗接种为主、捕杀隔离消毒为辅的措施来控制新城疫的发生。弱毒疫苗能够诱导体液免疫和粘膜免疫，在国内外得到普遍的应用。但此类疫苗常常需要在首次接种后7天才有抗体产生直至免疫后两周抗体滴度才达到保护水平，从免疫到具有保护力需2周以上的时间，如果新城疫一旦爆发在疫苗接种的这段免疫空白期，鸡群将无法得到有效的免疫保护。可见，在控制新城疫发病与流行中，从首免到具有完全保护自身的抗体水平所需时间越短越好；那么，速效疫苗的研制就显得尤为重要与迫切。
发明内容
本发明的目的是提供鸡新城疫病毒毒株rClone30-chIL15及其应用。本发明提供的鸡新城疫病毒毒株，其制备方法包括如下步骤：将所需的重组质粒pBrClone30-chIL15和辅助质粒pBL-N、pBL-P和pBL-L共转染哺乳动物细胞后进行培养，获得所述鸡新城疫病毒毒株；所述重组质粒pBrClone30-chIL15为具有序列表的序列3所示的DNA分子的质粒。序列表的序列3自5’末端第2703-18546位核苷酸所示的DNA分子即为rClone30- chIL15病毒的基因组DNA。
所述重组质粒pBrClone30-chIL15具体可为序列表的序列3所示的质粒。
所述哺乳动物细胞具体可为BHK-21细胞。
rClone30-chIL15病毒的制备方法具体如下：
（1）把所述重组质粒pBrClone30-chIL15、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染BHK-21细胞（每1×106个细胞转染1μg重组质粒pBrClone30- chIL15、0.5μg pBL-N质粒、0.25μg pBL-P质粒和0.1μg pBL-L质粒），放置于5% CO2、37℃静置培养72h；
（2）将上述步骤（1）得到的转染细胞，反复冻融3次，离心获得细胞上清液，然后接种于9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37℃培养72h，收集鸡胚尿囊液（其中含有rClone30- chIL15病毒）；
（3）将步骤（2）得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，37℃培养72h，收集鸡胚尿囊液；
（4）将步骤（3）得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，37℃培养72h，收集鸡胚尿囊液；
（5）将步骤（2）、步骤（3）和步骤（4）得到的鸡胚尿囊液进行混合，得到的混合液，即为rClone30- chIL15病毒液。
本发明还保护一种鸡新城疫病毒毒株（命名为rClone30-chIL15病毒），其基因组DNA如序列表的序列3自5ˊ末端第2703-18546位核苷酸所示。
本发明还保护以上任一所述的鸡新城疫病毒毒株及其应用。
本发明还保护一种鸡新城疫病疫苗，包括以上任一所述的鸡新城疫病毒毒株。
本发明提供一种新的鸡新城疫病毒毒株，命名为rClone30-chIL15，简称毒株rClone30-chIL15。毒株rClone30-chIL15是将chIL15多肽的编码基因利用两个限制性内切酶插入到鸡新城疫病毒毒株Clone30（简称毒株Clone30，弱毒株，为现有的新城疫病活疫苗）的基因组的F基因和HN基因之间得到的重组病毒株。毒株rClone30-chIL15免疫鸡群后，可以使鸡快速产生抗体，使免疫空白期从2周缩短到1周，弥补了现有新城疫活疫苗产生抗体时间过长的缺点，而且能增强细胞免疫，让鸡获得全面的免疫。
本发明涉及的重组新城疫病毒可视为基因工程改造后的弱毒疫苗株，可制备为任何常规制剂，如冻干粉针制剂、液体疫苗制剂等。
本发明通过在现有新城疫活疫苗基因组基础上在F和HN之间引入分子佐剂chIL15，可以有效提高免疫效果，有效缩短免疫空白期，使鸡群提早产生保护性抗体，提高免疫保护率。
附图说明
图1为重组质粒pBrClone30-chIL15的元件示意图。
图2为混合液的HA效价和HI效价结果。
图3为PCR鉴定电泳图。
图4为实施例2的结果。
图5为实施例3的结果。
图6-图8为实施例4的结果。
图9为实施例5的结果。
具体实施方式
以下涉及实施例有利于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
提及“pBrClone30质粒”的文献：“Enhancement of anti-tumor activity of Newcastle disease virus by the synergistic effect of cytosine deaminase”,Zheng LV,Asian Pac J Cancer Ptev.。
提及“pBL-N质粒”、“pBL-P质粒”和“pBL-L质粒”的文献：Genetically engineered Newcastle disease virus expressing interleukin 2 is a potential drug candidate for cancer immunotherapy,Fuliang Bai,Immunology letters.。
pBrClone30质粒中具有新城疫病毒的NP基因、P基因、M基因、F基因、HN基因和L基因，其中F基因和HN基因之间具有SacⅡ和MluI酶切识别位点。将pBrClone30质粒、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染哺乳动物细胞并培养(pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒起辅助作用，pBrClone30质粒提供病毒的全基因组)，得到毒株Clone30。
提及“NDV强毒BJ株”的文献：“鸡新城疫病毒强毒株的分离鉴定及其遗传变异分析”，校海霞，河北农业大学硕士学位论文。
BHK-21细胞：ATCC编号为CRL-13001。
DF-1细胞：ATCC编号为CRL-12203。
SPF级白色来航鸡：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。
ChIL15多肽的全称为鸡白细胞介素15，如序列表的序列2所示，其编码基因的开放阅读框如序列表的序列1自5ˊ末端第15至578位核苷酸所示。
完全DMEM培养基即为含有5%胎牛血清的DMEM培养基。
鸡血红细胞凝集（HA）试验的具体方法如下：(1)在血凝板第一排的1-12孔各加入50μL生理盐水；(2)在第1孔中加入50μL待测病毒液，混匀后吸50μL到第2孔，如此倍比稀释直到第10孔，第10孔混匀后弃除50μL；(3)在1-12孔中各加入50μL 1%鸡血红细胞；(4)震荡后室温静置20-30min，观察结果。
鸡血红细胞凝集抑制（HI）试验的具体方法如下：(1)在血凝板的1-12孔各加入25μL生理盐水；(2)第1孔加入待检血清25μL，混匀后吸25μL至第2孔，倍比稀释直至第10孔，第10孔混匀后弃除25μL；(3)在1-12孔中各加入25μL实施例1制备的rClone30病毒液（4个血凝单位），室温静置30min；(4)在1-12孔中各加入25μL 1%鸡血红细胞；(5)震荡后室温静置30-40min，观察结果。
实施例1、rClone30-chIL15病毒液的制备
一、重组质粒的构建
1、合成序列表的序列1所示的双链DNA分子。
合成序列表的序列1中，自5ˊ末端第1至6位核苷酸为限制性内切酶SacⅡ的识别序列，第9-14位核苷酸为Kozac序列，第15至578位核苷酸为chIL15多肽的编码基因，第579至584位核苷酸为限制性内切酶MluI的识别序列；
2、用限制性内切酶SacⅡ和MluI双酶切步骤1得到的双链DNA分子，回收酶切产物；
3、用限制性内切酶SacⅡ和MluI双酶切pBrClone30质粒，回收载体骨架片段，大小约16000bp；
4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pBrClone30-chIL15。重组质粒pBrClone30-chIL15的核苷酸序列如序列表的序列3所示（序列表的序列3中，自5ˊ末端第位2703-18546核苷酸为rClone30-chIL15病毒的基因组）。重组质粒pBrClone30-chIL15的元件示意图见图1。
二、重组病毒的制备
1、将重组质粒pBrClone30-chIL15、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染BHK-21细胞（每1×106个细胞约转染1μg重组质粒pBrClone30-chIL15、0.5μgpBL-N质粒、0.25μg pBL-P质粒和0.1μg pBL-L质粒），置于5% CO2、37℃静置培养72h；
2、将步骤1得到的转染细胞，反复冻融3次，离心获得细胞上清液，接种于9-11日龄SPF鸡胚，37℃培养72h，收集鸡胚尿囊液；
3、将步骤2得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚，37℃培养72h，收集鸡胚尿囊液；
4、将步骤3得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚，37℃培养72h，收集鸡胚尿囊液；
5、将步骤2、步骤3和步骤4得到的鸡胚尿囊液进行混合，得到的混合液即为所制备的病毒（该混合液的HA效价为2048，HI效价为2048，见图2）；
6、将步骤5得到的混合液，提取总RNA并反转录为cDNA，采用F1和R1组成的引物PCR(F15ˊ-CCGCGGACGCCACCATGCTGGGGAT-3ˊ；R15ˊ-ACGCGTTTAGTTAGCGTATTTTTTG-3ˊ)，结果见图3。PCR扩增片段大小约为560bp，与预期相符。
结果表明，成功制备了具有感染性的表达chIL15多肽的NDV病毒，将步骤5得到的混合液命名为rClone30-chIL15病毒液。
三、对照病毒的制备
用pBrClone30质粒代替重组质粒pBrClone30-chIL15进行步骤二的1至5，得到的混合液命名为rClone30病毒液。
实施例2、检测病毒液中chIL15的表达量
1、将对数生长期的DF-1细胞接种于六孔板，以0.1MOI的剂量感染实施例1制备的rClone30-chIL15病毒液（rClone30-chIL15病毒液用完全DMEM培养基稀释），37℃静置孵育1h，完全DMEM培养基洗涤三遍，加入含1μg/mL胰蛋白酶的完全DMEM培养基并置于5% CO2、37℃静置培养48h，然后反复冻融3次，离心收取上清液；
2、用实施例1制备的rClone30病毒液代替rClone30-chIL15病毒液，其它同步骤1；
3、采用chIL15试剂盒（Antibodies online ，ABIN414131）,并按说明书进行操作，检测步骤1得到的上清液和步骤2得到的上清液中的chIL15的浓度；
结果见图4。结果表明，rClone30-chIL15病毒能够稳定表达chIL15,而rClone30病毒不表达chIL15。
实施例3、rClone30-chIL15病毒与rClone30病毒在宿主细胞中的动力生长曲线
1、将对数生长期的DF-1细胞接种于六孔板，以0.1MOI的剂量将实施例1制备的rClone30-chIL15病毒液（rClone30-chIL15病毒液用完全DMEM培养基稀稀释）接种于细胞单层，采用含1μg/mL胰蛋白酶的完全DMEM培养基，置于5% CO2、37℃静置培养96h，每隔24h取上清液并测定TCID50；
2、实施例1制备的rClone30病毒液代替rClone30-chIL15病毒液，其它同步骤1。
结果见图5。rClone30-chIL15病毒与rClone30病毒繁殖滴度保持一致。结果表明，空载体rClone30在插入外源的chIL15基因之后增殖能力并没有因此而改变。
实施例4、rClone30-chIL15病毒缩短免疫空白期情况及佐剂疫苗对细胞免疫的增强作用
按照农业部标准，青年鸡的抗体效价≥5log2时判为合格。
取45日龄的SPF级白色来航鸡，随机分为3组，每组15只。分别处理如下（均为单次免疫）：
第一组：每只实验鸡以点眼滴鼻的方式免疫200μL实施例1所得重组病毒rClone30-chIL15病毒液（rClone30-chIL15病毒液用完全DMEM培养基稀释，用于免疫的病毒液的浓度为105TCID50/0.1ml）；
第二组：每只鸡同样以点眼滴鼻的方式进行免疫，（rClone30病毒液用完全DMEM培养基稀释，用于免疫的病毒液的浓度为105TCID50/0.1ml）；
第三组：每只鸡以点眼滴鼻的方式免疫0.9%的生理盐水200μL；
分别于免疫后2d、4d、6d、8d羽静脉采血分离血清，进行HI抗体效价检测结果见图6，同时分离相应天数的血液中的淋巴细胞，用FITC标记的鼠抗鸡的CD4+抗体（Abcam，ab24896）和CD8+ 抗体（Abcam，ab24899）经流式细胞仪检测淋巴细胞中CD4+、CD8+T占淋巴细胞的百分比，结果见图7、图8。
如图6所示，第一组即rClone30- chIL15免疫组在免疫后两天抗体开始上升至第6天达到保护性水平，在免疫后6天时rClone30在3.6 log2左右，无法形成有效保护，抵抗强毒的攻击。结果如图7、8所示。在免疫后第二天重组lone30-chIL15实验组的鸡CD4+、CD8+T细胞含量都开始增加，且至第八天时一直高于对照组rClone30，可见重组rClone30- chIL15能在快速产生保护性抗体的同时刺激机体细胞免疫，使鸡的免疫力增强。
实施例5、rClone30-chIL15病毒或rClone30病毒免疫鸡后的HI抗体效价
参照农业部标准，青年鸡的抗体效价≥5log2时判为合格。特别是在30日龄前后抗体水平低于此标准，如果在此期间有强毒侵入，就有可能暴发新城疫。如果鸡群能在此期间达到此标准，将不受新城疫病毒的威胁。
取30日龄的SPF级白色来航鸡，随机分为3组，每组10只。分别处理如下（均为单次免疫）：
第一组：每只通过滴鼻点眼的方式免疫200μL实施例1制备的rClone30-chIL15病毒液（rClone30-chIL15病毒液用完全DMEM培养基稀释，用于免疫的病毒液的浓度为105TCID50/0.1ml）；
第二组：每只通过滴鼻点眼的方式免疫200μL实施例1制备的rClone30病毒液（rClone30病毒液用完全DMEM培养基稀释，用于免疫的病毒液的浓度为105TCID50/0.1ml）；
第三组：每只通过滴鼻点眼方式免疫200μL 0.9%生理盐水。
分别于免疫后7d、14 d、21d翅静脉采血分离血清，检测HI效价。
结果见图9。免疫后7d，第一组血清的HI效价高于5log2，第二组的效价低于3log2，即rClone30-chIL15病毒液将可以实现早期保护效果，使鸡免受新城疫病毒的威胁，而rClone30病毒液将无法在免疫7d后实现有效保护鸡免受新城疫病毒的威胁。
实施例6、攻毒试验
将30日龄SPF级白色来航鸡随机分为3组，每组30只。分别处理如下（均为单次免疫）：
第一组：实验第1天，每只通过滴鼻点眼方式免疫200μL实施例1制备的rClone30-chIL15病毒液（rClone30-chIL15病毒液用完全DMEM培养基稀释，用于免疫的病毒液的浓度为105TCID50/0.1ml）
第二组：实验第1天，每只通过滴鼻点眼方式免疫200μL实施例1制备的rClone30病毒液（rClone30病毒液用完全DMEM培养基稀释，用于免疫的病毒液的浓度为105TCID50/0.1ml）；
第三组：实验第1天，每只通过滴鼻点眼方式免疫200μL 0.9%生理盐水。
实验第8天，采用NDV强毒BJ株进行攻毒（每只鸡采用104 ELD50的剂量经肌肉注射途径攻毒，攻毒体积为0.1ml），实验第18天，统计各组的发病与死亡情况。结果见表1。
表1 各组的发病与死亡情况统计（三次试验的平均值）
| 疫苗组 | 攻毒剂量 | 发病数量/死亡数量/总数量 | 保护率 |
| 第一组 | 104ELD50 | 0/0/30 | 100% |
| 第二组 | 104ELD50 | 15/8/30 | 50% |
| 第三组 | 104ELD50 | 30/30/30 | 0% |
发病表征如下（满足①-④中的一项以上即判断为发病）：①上呼吸道分泌大量黏液，自口鼻流出，有时挂于嘴端，常摇头想甩掉；呼吸困难，呼吸时喉部发出“咯咯”的喘鸣声或尖叫声；②由于呼吸困难，血液中氧气不足，二氧化碳增多，使肉髯变为青紫色，临死前及死后尤为明显；③下痢，粪便呈绿色、黄白色，有时混有少量血液；④部分鸡嗉囊蓄积大量酸臭液体，倒提鸡时，液体急速自口中流出，提壶倒水一般。
结果表明：rClone30-chIL15免疫可在早期先于rClone30疫苗株刺激鸡体内产生抗体并同时增强体液免疫水平，提高攻毒保护效率。
序列1、chIL15的的核苷酸序列（SacⅡ，Kozac 保护碱基 MluⅠ）
1 CCGCGGACGCCACCATGCTGGGGATGGCACAGCCAACACAAAACTCTGCCGGAGCACGGA
61 GAAGGCCGGAGAGTCAGAAAACACATGTGAAAAGTATTTGTCTCCAGTACCAACTGTATC
121 TACTTTTGAACAGCCATTTCTTTTGCCTTTTAAAGAATAAGACTGGACTAACCATCTTCT
181 TCCTATGTGCTTATGTACCAAAGACAGAAGCAAATCACTGTAAGTGGTCAGACGTTCTGA
241 AAGATTTGGAGCTGATCAAGACATCTGAAGACATTGATGTCAGTTTATATACTGCAAACA
301 CATACGAGGATATAGAATGCCAGGAACCTGTAATGAGATGTTTTTTTTTAGAGATGAAAG
361 TGATTCTTCACGAATGTGATATCAAAAAATGTAGTAGGAAGCATGATGTACGGAACATAT
421 GGAAAAATGGAAATGCAAGATTTGCAACTTACCAGTTGAATTCCACAACAGCAAAAAAAT
481 GCAAAGAATGTGAAGAGTATGAAGAAAAAAATTTTACAGAATTTATACAGAGTTTTGTAA
541 AGGTTATACAGAGGGAATGCAAAAAATACGCTAACTAAACGCGT
序列2、chIL15的氨基酸序列
1 MLGMAQPTQNSAGARRRPESQKTHVKSICLQYQLYLLLNSHFFCLLKNKTGLTIFFLCAY
61 VPKTEANHCKWSDVLKDLELIKTSEDIDVSLYTANTYEDIECQEPVMRCFFLEMKVILHE
121 CDIKKCSRKHDVRNIWKNGNARFATYQLNSTTAKKCKECEEYEEKNFTEFIQSFVKVIQR
181 ECKKYAN*
序列3（自5ˊ末端第2703-18546位核苷酸为病毒rClone30-chIL15基因组）
1 CTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGTAGCCTGAA
61 TGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCG
121 CAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTC
181 CTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGG
241 GTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTC
301 ACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTT
361 CTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTC
421 TTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTA
481 ACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCAGGTGGCACTTT
541 TCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTA
601 TCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTAT
661 GAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGT
721 TTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACG
781 AGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGA
841 AGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCG
901 TATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGT
961 TGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATG
1021 CAGTGCTGCCATAAGCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGG
1081 AGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTTCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGA
1141 TCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCC
1201 TGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTC
1261 CCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTC
1321 GGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCG
1381 CGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACAC
1441 GACGGGCAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTC
1501 ACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTT
1561 AAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGAC
1621 CAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAA
1681 AGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACC
1741 ACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGT
1801 AACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGG
1861 CCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACC
1921 AGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTT
1981 ACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGA
2041 GCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCT
2101 TCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCG
2161 CACGAGGGAGCTTCCAGGGGGGAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCA
2221 CCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCCGAGCCTATGGAAAAA
2281 CGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTT
2341 CTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGA
2401 TACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGA
2461 GCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCA
2521 CGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTACCT
2581 CACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCCTATGTTGTGTGGAAT
2641 TGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCGG
2701 AAGCGGCCGCTAATACGACTCACTATAGGGACCAAACAGAGAATCCGTAAGTTACGATAA
2761 AAGGCGAAGGAGCAATTGAAGTCGCACGGGTAGAAGGTGTGAATCTCGAGTGCGAGCCCG
2821 AAGCACAAACTCGAGAAAGCCTTCTGCCAACATGTCTTCCGTATTTGATGAGTACGAACA
2881 GCTCCTCGCGGCTCAGACTCGCCCCAATGGAGCTCATGGAGGGGGAGAAAAAGGGAGTAC
2941 CTTAAAAGTAGACGTCCCGGTATTCACTCTTAACAGTGATGACCCAGAAGATAGATGGAG
3001 CTTTGTGGTATTCTGCCTCCGGATTGCTGTTAGCGAAGATGCCAACAAACCACTCAGGCA
3061 AGGTGCTCTCATATCTCTTTTATGCTCCCACTCACAGGTAATGAGGAACCATGTTGCCCT
3121 TGCAGGGAAACAGAATGAAGCCACATTGGCCGTGCTTGAGATTGATGGCTTTGCCAACGG
3181 CACGCCCCAGTTCAACAATAGGAGTGGAGTGTCTGAAGAGAGAGCACAGAGATTTGCGAT
3241 GATAGCAGGATCTCTCCCTCGGGCATGCAGCAACGGAACCCCGTTCGTCACAGCCGGGGC
3301 CGAAGATGATGCACCAGAAGACATCACCGATACCCTGGAGAGGATCCTCTCTATCCAGGC
3361 TCAAGTATGGGTCACAGTAGCAAAAGCCATGACTGCGTATGAGACTGCAGATGAGTCGGA
3421 AACAAGGCGAATCAATAAGTATATGCAGCAAGGCAGGGTCCAAAAGAAATACATCCTCTA
3481 CCCCGTATGCAGGAGCACAATCCAACTCACGATCAGACAGTCTCTTGCAGTCCGCATCTT
3541 TTTGGTTAGCGAGCTCAAGAGAGGCCGCAACACGGCAGGTGGTACCTCTACTTATTATAA
3601 CCTGGTAGGGGACGTAGACTCATACATCAGGAATACCGGGCTTACTGCATTCTTCTTGAC
3661 ACTCAAGTACGGAATCAACACCAAGACATCAGCCCTTGCACTTAGTAGCCTCTCAGGCGA
3721 CATCCAGAAGATGAAGCAGCTCATGCGTTTGTATCGGATGAAAGGAGATAATGCGCCGTA
3781 CATGACATTACTTGGTGATAGTGACCAGATGAGCTTTGCGCCTGCCGAGTATGCACAACT
3841 TTACTCCTTTGCCATGGGTATGGCATCAGTCCTAGATAAAGGTACTGGGAAATACCAATT
3901 TGCCAGGGACTTTATGAGCACATCATTCTGGAGACTTGGAGTAGAGTACGCTCAGGCTCA
3961 GGGAAGTAGCATTAACGAGGATATGGCTGCCGAGCTAAAGCTAACCCCAGCAGCAAGGAG
4021 GGGCCTGGCAGCTGCTGCCCAACGGGTCTCCGAGGAGACCAGCAGCATAGACATGCCTAC
4081 TCAACAAGTCGGAGTCCTCACTGGGCTTAGCGAGGGGGGGTCCCAAGCTCTACAAGGCGG
4141 ATCGAATAGATCGCAAGGGCAACCAGAAGCCGGGGATGGGGAGACCCAATTCCTGGATCT
4201 GATGAGAGCGGTAGCAAATAGCATGAGGGAGGCGCCAAACTCTGCACAGGGCACTCCCCA
4261 ATCGGGGCCTCCCCCAACTCCTGGGCCATCCCAAGATAACGACACCGACTGGGGGTATTG
4321 ATGGACAAAACCCAGCCTGCTTCCACAAAAACATCCCAATGCCCTCACCCGTAGTCGACC
4381 CCTCGATTTGCGGCTCTATATGACCACACCCTCAAACAAACATCCCCCTCTTTCCTCCCT
4441 CCCCCTGCTGTACAACTCCGCACGCCCTAGATACCACAGGCACAATGCGGCTCACTAACA
4501 ATCAAAACAGAGCCGAGGGAATTAGAAAAAAGTACGGGTAGAAGAGGGATATTCAGAGAT
4561 CAGGGCAAGTCTCCCGAGTCTCTGCTCTCTCCTCTACCTGATAGACCAGGACAAACATGG
4621 CCACCTTTACAGATGCAGAGATCGACGAGCTATTTGAGACAAGTGGAACTGTCATTGACA
4681 ACATAATTACAGCCCAGGGTAAACCAGCAGAGACTGTTGGAAGGAGTGCAATCCCACAAG
4741 GCAAGACCAAGGTGCTGAGCGCAGCATGGGAGAAGCATGGGAGCATCCAGCCACCGGCCA
4801 GTCAAGACAACCCCGATCGACAGGACAGATCTGACAAACAACCATCCACACCCGAGCAAA
4861 CGACCCCGCATGACAGCCCGCCGGCCACATCCGCCGACCAGCCCCCCACCCAGGCCACAG
4921 ACGAAGCCGTCGACACACAGCTCAGGACCGGAGCAAGCAACTCTCTGCTGTTGATGCTTG
4981 ACAAGCTCAGCAATAAATCGTCCAATGCTAAAAAGGGCCCATGGTCGAGCCCCCAAGAGG
5041 GGAATCACCAACGTCCGACTCAACAGCAGGGGAGTCAACCCAGTCGCGGAAACAGTCAGG
5101 AAAGACCGCAGAACCAAGTCAAGGCCGCCCCTGGAAACCAGGGCACAGACGTGAACACAG
5161 CATATCATGGACAATGGGAGGAGTCACAACTATCAGCTGGTGCAACCCCTCATGCTCTCC
5221 GATCAAGGCAGAGCCAAGACAATACCCTTGTATCTGCGGATCATGTCCAGCCACCTGTAG
5281 ACTTTGTGCAAGCGATGATGTCTATGATGGAGGCGATATCACAGAGAGTAAGTAAGGTTG
5341 ACTATCAGCTAGATCTTGTCTTGAAACAGACATCCTCCATCCCTATGATGCGGTCCGAAA
5401 TCCAACAGCTGAAAACATCTGTTGCAGTCATGGAAGCCAACTTGGGAATGATGAAGATTC
5461 TGGATCCCGGTTGTGCCAACATTTCATCTCTGAGTGATCTACGGGCAGTTGCCCGATCTC
5521 ACCCGGTTTTAGTTTCAGGCCCTGGAGACCCCTCTCCCTATGTGACACAAGGAGGCGAAA
5581 TGGCACTTAATAAACTTTCGCAACCAGTGCCACATCCATCTGAATTGATTAAACCCGCCA
5641 CTGCATGCGGGCCTGATATAGGAGTGGAAAAGGACACTGTCCGTGCATTGATCATGTCAC
5701 GCCCAATGCACCCGAGTTCTTCAGCCAAGCTCCTAAGCAAGTTAGATGCAGCCGGGTCGA
5761 TCGAGGAAATCAGGAAAATCAAGCGCCTTGCTCTAAATGGCTAATTACTACTGCCACACG
5821 TAGCGGGTCCCTGTCCACTCGGCATCACACGGAATCTGCACCGAGTTCCCCCCCGCAGAC
5881 CCAAGGTCCAACTCTCCAAGCGGCAATCCTCTCTCGCTTCCTCAGCCCCACTGAATGATC
5941 GCGTAACCGTAATTAATCTAGCTACATTTAAGATTAAGAAAAAATACGGGTAGAATTGGA
6001 GTGCCCCAATTGTGCCAAGATGGACTCATCTAGGACAATTGGGCTGTACTTTGATTCTGC
6061 CCATTCTTCTAGCAACCTGTTAGCATTTCCGATCGTCCTACAAGACACAGGAGATGGGAA
6121 GAAGCAAATCGCCCCGCAATATAGGATCCAGCGCCTTGACTTGTGGACTGATAGTAAGGA
6181 GGACTCAGTATTCATCACCACCTATGGATTCATCTTTCAAGTTGGGAATGAAGAAGCCAC
6241 TGTCGGCATGATCGATGATAAACCCAAGCGCGAGTTACTTTCCGCTGCGATGCTCTGCCT
6301 AGGAAGCGTCCCAAATACCGGAGACCTTATTGAGCTGGCAAGGGCCTGTCTCACTATGAT
6361 AGTCACATGCAAGAAGAGTGCAACTAATACTGAGAGAATGGTTTTCTCAGTAGTGCAGGC
6421 ACCCCAAGTGCTGCAAAGCTGTAGGGTTGTGGCAAACAAATACTCATCAGTGAATGCAGT
6481 CAAGCACGTGAAAGCGCCAGAGAAGATTCCCGGGAGTGGAACCCTAGAATACAAGGTGAA
6541 CTTTGTCTCCTTGACTGTGGTACCGAAGAAGGATGTCTACAAGATCCCAGCTGCAGTATT
6601 GAAGGTTTCTGGCTCGAGTCTGTACAATCTTGCGCTCAATGTCACTATTAATGTGGAGGT
6661 AGACCCGAGGAGTCCTTTGGTTAAATCTCTGTCTAAGTCTGACAGCGGATACTATGCTAA
6721 CCTCTTCTTGCATATTGGACTTATGACCACCGTAGATAGGAAGGGGAAGAAAGTGACATT
6781 TGACAAGCTGGAAAAGAAAATAAGGAGCCTTGATCTATCTGTCGGGCTCAGTGATGTGCT
6841 CGGGCCTTCCGTGTTGGTAAAAGCAAGAGGTGCACGGACTAAGCTTTTGGCACCTTTCTT
6901 CTCTAGCAGTGGGACAGCCTGCTATCCCATAGCAAATGCTTCTCCTCAGGTGGCCAAGAT
6961 ACTCTGGAGTCAAACCGCGTGCCTGCGGAGCGTTAAAATCATTATCCAAGCAGGTACCCA
7021 ACGCGCTGTCGCAGTGACCGCCGACCACGAGGTTACCTCTACTAAGCTGGAGAAGGGGCA
7081 CACCCTTGCCAAATACAATCCTTTTAAGAAATAAGCTGCGTCTCTGAGATTGCGCTCCGC
7141 CCACTCACCCAGATCATCATGACACAAAAAACTAATCTGTCTTGATTATTTACAGTTAGT
7201 TTACCTGTCTATCAAGTTAGAAAAAACACGGGTAGAAGATTCTGGATCCCGGTTGGCGCC
7261 CTCCAGGTGCAAGATGGGCTCCAGACCTTCTACCAAGAACCCAGCACCTATGATGCTGAC
7321 TATCCGGGTTGCGCTGGTACTGAGTTGCATCTGTCCGGCAAACTCCATTGATGGCAGGCC
7381 TCTTGCAGCTGCAGGAATTGTGGTTACAGGAGACAAAGCCGTCAACATATACACCTCATC
7441 CCAGACAGGATCAATCATAGTTAAGCTCCTCCCGAATCTGCCCAAGGATAAGGAGGCATG
7501 TGCGAAAGCCCCCTTGGATGCATACAACAGGACATTGACCACTTTGCTCACCCCCCTTGG
7561 TGACTCTATCCGTAGGATACAAGAGTCTGTGACTACATCTGGAGGGGGGAGACAGGGGCG
7621 CCTTATAGGCGCCATTATTGGCGGTGTGGCTCTTGGGGTTGCAACTGCCGCACAAATAAC
7681 AGCGGCCGCAGCTCTGATACAAGCCAAACAAAATGCTGCCAACATCCTCCGACTTAAAGA
7741 GAGCATTGCCGCAACCAATGAGGCTGTGCATGAGGTCACTGACGGATTATCGCAACTAGC
7801 AGTGGCAGTTGGGAAGATGCAGCAGTTTGTTAATGACCAATTTAATAAAACAGCTCAGGA
7861 ATTAGACTGCATCAAAATTGCACAGCAAGTTGGTGTAGAGCTCAACCTGTACCTAACCGA
7921 ATTGACTACAGTATTCGGACCACAAATCACTTCACCTGCTTTAAACAAGCTGACTATTCA
7981 GGCACTTTACAATCTAGCTGGTGGAAATATGGATTACTTATTGACTAAGTTAGGTGTAGG
8041 GAACAATCAACTCAGCTCATTAATCGGTAGCGGCTTAATCACCGGTAACCCTATTCTATA
8101 CGACTCACAGACTCAACTCTTGGGTATACAGGTAACTCTACCTTCAGTCGGGAACCTAAA
8161 TAATATGCGTGCCACCTACTTGGAAACCTTATCCGTAAGCACAACCAGGGGATTTGCCTC
8221 GGCACTTGTCCCAAAAGTGGTGACACAGGTCGGTTCTGTGATAGAAGAACTTGACACCTC
8281 ATACTGTATAGAAACTGACTTAGATTTATATTGTACAAGAATAGTAACGTTCCCTATGTC
8341 CCCTGGTATTTATTCCTGCTTGAGCGGCAATACGTCGGCCTGTATGTACTCAAAGACCGA
8401 AGGCGCACTTACTACACCATACATGACTATCAAAGGTTCAGTCATCGCCAACTGCAAGAT
8461 GACAACATGTAGATGTGTAAACCCCCCGGGTATCATATCGCAAAACTATGGAGAAGCCGT
8521 GTCTCTAATAGATAAACAATCATGCAATGTTTTATCCTTAGGCGGGATAACTTTAAGGCT
8581 CAGTGGGGAATTCGATGTAACTTATCAGAAGAATATCTCAATACAAGATTCTCAAGTAAT
8641 AATAACAGGCAATCTTGATATCTCAACTGAGCTTGGGAATGTCAACAACTCGATCAGTAA
8701 TGCTTTGAATAAGTTAGAGGAAAGCAACAGAAAACTAGACAAAGTCAATGTCAAACTGAC
8761 TAGCACATCTGCTCTCATTACCTATATCGTTTTGACTATCATATCTCTTGTTTTTGGTAT
8821 ACTTAGCCTGATTCTAGCATGCTACCTAATGTACAAGCAAAAGGCGCAACAAAAGACCTT
8881 ATTATGGCTTGGGAATAATACTCTAGATCAGATGAGAGCCACTACAAAAATGTGAACACA
8941 GATGAGGAACGAAGGTTTCCCTAATAGTAATTTGTGTGAAAGTTCTGGTAGTCTGTCAGT
9001 TAAGAAAAAATACGGGTAGAAGGTTAACCGGCCCGCGGACGCCACCATGCTGGGGATGGC
9061 ACAGCCAACACAAAACTCTGCCGGAGCACGGAGAAGGCCGGAGAGTCAGAAAACACATGT
9121 GAAAAGTATTTGTCTCCAGTACCAACTGTATCTACTTTTGAACAGCCATTTCTTTTGCCT
9181 TTTAAAGAATAAGACTGGACTAACCATCTTCTTCCTATGTGCTTATGTACCAAAGACAGA
9241 AGCAAATCACTGTAAGTGGTCAGACGTTCTGAAAGATTTGGAGCTGATCAAGACATCTGA
9301 AGACATTGATGTCAGTTTATATACTGCAAACACATACGAGGATATAGAATGCCAGGAACC
9361 TGTAATGAGATGTTTTTTTTTAGAGATGAAAGTGATTCTTCACGAATGTGATATCAAAAA
9421 ATGTAGTAGGAAGCATGATGTACGGAACATATGGAAAAATGGAAATGCAAGATTTGCAAC
9481 TTACCAGTTGAATTCCACAACAGCAAAAAAATGCAAAGAATGTGAAGAGTATGAAGAAAA
9541 AAATTTTACAGAATTTATACAGAGTTTTGTAAAGGTTATACAGAGGGAATGCAAAAAATA
9601 CGCTAACTAAACGCGTGGCCTGAGAGGCCTTCAGAGAGTTAAGAAAAAACTACCGGTTGT
9661 AGATGACCAAAGGACGATATACGGGTAGAACGGTAAGAGAGGCCGCCCCTCAATTGCGAG
9721 CCAGGCTTCACAACCTCCGTTCTACCGCTTCACCGACAACAGTCCTCAATCATGGACCGC
9781 GCCGTTAGCCAAGTTGCGTTAGAGAATGATGAAAGAGAGGCAAAAAATACATGGCGCTTG
9841 ATATTCCGGATTGCAATCTTATTCTTAACAGTAGTGACCTTGGCTATATCTGTAGCCTCC
9901 CTTTTATATAGCATGGGGGCTAGCACACCTAGCGATCTTGTAGGCATACCGACTAGGATT
9961 TCCAGGGCAGAAGAAAAGATTACATCTACACTTGGTTCCAATCAAGATGTAGTAGATAGG
10021 ATATATAAGCAAGTGGCCCTTGAGTCTCCGTTGGCATTGTTAAATACTGAGACCACAATT
10081 ATGAACGCAATAACATCTCTCTCTTATCAGATTAATGGAGCTGCAAACAACAGTGGGTGG
10141 GGGGCACCTATCCATGACCCAGATTATATAGGGGGGATAGGCAAAGAACTCATTGTAGAT
10201 GATGCTAGTGATGTCACATCATTCTATCCCTCTGCATTTCAAGAACATCTGAATTTTATC
10261 CCGGCGCCTACTACAGGATCAGGTTGCACTCGAATACCCTCATTTGACATGAGTGCTACC
10321 CATTACTGCTACACCCATAATGTAATATTGTCTGGATGCAGAGATCACTCACATTCATAT
10381 CAGTATTTAGCACTTGGTGTGCTCCGGACATCTGCAACAGGGAGGGTATTCTTTTCTACT
10441 CTGCGTTCCATCAACCTGGACGACACCCAAAATCGGAAGTCTTGCAGTGTGAGTGCAACT
10501 CCCCTGGGTTGTGATATGCTGTGCTCGAAAGTCACGGAGACAGAGGAAGAAGATTATAAC
10561 TCAGCTGTCCCTACGCGGATGGTACATGGGAGGTTAGGGTTCGACGGCCAGTACCACGAA
10621 AAGGACCTAGATGTCACAACATTATTCGGGGACTGGGTGGCCAACTACCCAGGAGTAGGG
10681 GGTGGATCTTTTATTGACAGCCGCGTATGGTTCTCAGTCTACGGAGGGTTAAAACCCAAT
10741 TCACCCAGTGACACTGTACAGGAAGGGAAATATGTGATATACAAGCGATACAATGACACA
10801 TGCCCAGATGAGCAAGACTACCAGATTCGAATGGCCAAGTCTTCGTATAAGCCTGGACGG
10861 TTTGGTGGGAAACGCATACAGCAGGCTATCTTATCTATCAAGGTGTCAACATCCTTAGGC
10921 GAAGACCCGGTACTGACTGTACCGCCCAACACAGTCACACTCATGGGGGCCGAAGGCAGA
10981 ATTCTCACAGTAGGGACATCTCATTTCTTGTATCAACGAGGGTCATCATACTTCTCTCCC
11041 GCGTTATTATATCCTATGACAGTCAGCAACAAAACAGCCACTCTTCATAGTCCTTATACA
11101 TTCAATGCCTTCACTCGGCCAGGTAGTATCCCTTGCCAGGCTTCAGCAAGATGCCCCAAC
11161 TCGTGTGTTACTGGAGTCTATACAGATCCATATCCCCTAATCTTCTATAGAAACCACACC
11221 TTGCGAGGGGTATTCGGGACAATGCTTGATGGTGTACAAGCAAGACTTAACCCTGCGTCT
11281 GCAGTATTCGATAGCACATCCCGCAGTCGCATTACTCGAGTGAGTTCAAGCAGTACCAAA
11341 GCAGCATACACAACATCAACTTGTTTTAAAGTGGTCAAGACTAATAAGACCTATTGTCTC
11401 AGCATTGCTGAAATATCTAATACTCTCTTCGGAGAATTCAGAATCGTCCCGTTACTAGTT
11461 GAGATCCTCAAAGATGACGGGGTTAGAGAAGCCAGGTCTGGCTAGTTGAGTCAATTATAA
11521 AGGAGTTGGAAAGATGGCATTGTATCACCTATCTTCTGCGACATCAAGAATCAAACCGAA
11581 TGCCGGCGCGTGCTCGAATTCCATGTTGCCAGTTGACCACAATCAGCCAGTGCTCATGCG
11641 ATCAGATTAAGCCTTGTCAATAGTCTCTTGATTAAGAAAAAATGTAAGTGGCAATGAGAT
11701 ACAAGGCAAAACAGCTCATGGTAAATAATACGGGTAGGACATGGCGAGCTCCGGTCCTGA
11761 AAGGGCAGAGCATCAGATTATCCTACCAGAGTCACACCTGTCTTCACCATTGGTCAAGCA
11821 CAAACTACTCTATTACTGGAAATTAACTGGGCTACCGCTTCCTGATGAATGTGACTTCGA
11881 CCACCTCATTCTCAGCCGACAATGGAAAAAAATACTTGAATCGGCCTCTCCTGATACTGA
11941 GAGAATGATAAAACTCGGAAGGGCAGTACACCAAACTCTTAACCACAATTCCAGAATAAC
12001 CGGAGTGCTCCACCCCAGGTGTTTAGAAGAACTGGCTAATATTGAGGTCCCAGATTCAAC
12061 CAACAAATTTCGGAAGATTGAGAAGAAGATCCAAATTCACAACACGAGATATGGAGAACT
12121 GTTCACAAGGCTGTGTACGCATATAGAGAAGAAACTGCTGGGGTCATCTTGGTCTAACAA
12181 TGTCCCCCGGTCAGAGGAGTTCAGCAGCATTCGTACGGATCCGGCATTCTGGTTTCACTC
12241 AAAATGGTCCACAGCCAAGTTTGCATGGCTCCATATAAAACAGATCCAGAGGCATCTGAT
12301 GGTGGCAGCTAGGACAAGGTCTGCGGCCAACAAATTGGTGATGCTAACCCATAAGGTAGG
12361 CCAAGTCTTTGTCACTCCTGAACTTGTCGTTGTGACGCATACGAATGAGAACAAGTTCAC
12421 ATGTCTTACCCAGGAACTTGTATTGATGTATGCAGATATGATGGAGGGCAGAGATATGGT
12481 CAACATAATATCAACCACGGCGGTGCATCTCAGAAGCTTATCAGAGAAAATTGATGACAT
12541 TTTGCGGTTAATAGACGCTCTGGCAAAAGACTTGGGTAATCAAGTCTACGATGTTGTATC
12601 ACTAATGGAGGGATTTGCATACGGAGCTGTCCAGCTACTCGAGCCGTCAGGTACATTTGC
12661 AGGAGATTTCTTCGCATTCAACCTGCAGGAGCTTAAAGACATTCTAATTGGCCTCCTCCC
12721 CAATGATATAGCAGAATCCGTGACTCATGCAATCGCTACTGTATTCTCTGGTTTAGAACA
12781 GAATCAAGCAGCTGAGATGTTGTGTCTGTTGCGTCTGTGGGGTCACCCACTGCTTGAGTC
12841 CCGTATTGCAGCAAAGGCAGTCAGGAGCCAAATGTGCGCACCGAAAATGGTAGACTTTGA
12901 TATGATCCTTCAGGTACTGTCTTTCTTCAAGGGAACAATCATCAACGGGTACAGAAAGAA
12961 GAATGCAGGTGTGTGGCCGCGAGTCAAAGTGGATACAATATATGGGAAGGTCATTGGGCA
13021 ACTACATGCAGATTCAGCAGAGATTTCACACGATATCATGTTGAGAGAGTATAAGAGTTT
13081 ATCTGCACTTGAATTTGAGCCATGTATAGAATATGACCCTGTCACCAACCTGAGCATGTT
13141 CCTAAAAGACAAGGCAATCGCACACCCCAACGATAATTGGCTTGCCTCGTTTAGGCGGAA
13201 CCTTCTCTCCGAAGACCAGAAGAAACATGTAAAAGAAGCAACTTCGACTAATCGCCTCTT
13261 GATAGAGTTTTTAGAGTCAAATGATTTTGATCCATATAAAGAGATGGAATATCTGACGAC
13321 CCTTGAGTACCTTAGAGATGACAATGTGGCAGTATCATACTCGCTCAAGGAGAAGGAAGT
13381 GAAAGTTAATGGACGGATCTTCGCTAAGCTGACAAAGAAGTTAAGGAACTGTCAGGTGAT
13441 GGCGGAAGGGATCCTAGCCGATCAGATTGCACCTTTCTTTCAGGGAAATGGAGTCATTCA
13501 GGATAGCATATCCTTGACCAAGAGTATGCTAGCGATGAGTCAACTGTCTTTTAACAGCAA
13561 TAAGAAACGTATCACTGACTGTAAAGAAAGAGTATCTTCAAACCGCAATCATGATCCGAA
13621 AAGCAAGAACCGTCGGAGAGTTGCAACCTTCATAACAACTGACCTGCAAAAGTACTGTCT
13681 TAATTGGAGATATCAGACAATCAAATTGTTCGCTCATGCCATCAATCAGTTGATGGGCCT
13741 ACCTCACTTCTTCGAATGGATTCACCTAAGACTGATGGACACTACGATGTTCGTAGGAGA
13801 CCCTTTCAATCCTCCAAGTGACCCTACTGACTGTGACCTCTCAAGAGTCCCTAATGATGA
13861 CATATATATTGTCAGTGCCAGAGGGGGTATCGAAGGATTATGCCAGAAGCTATGGACAAT
13921 GATCTCAATTGCTGCAATCCAACTTGCTGCAGCTAGATCGCATTGTCGTGTTGCCTGTAT
13981 GGTACAGGGTGATAATCAAGTAATAGCAGTAACGAGAGAGGTAAGATCAGACGACTCTCC
14041 GGAGATGGTGTTGACACAGTTGCATCAAGCCAGTGATAATTTCTTCAAGGAATTAATTCA
14101 TGTCAATCATTTGATTGGCCATAATTTGAAGGATCGTGAAACCATCAGGTCAGACACATT
14161 CTTCATATACAGCAAACGAATCTTCAAAGATGGAGCAATCCTCAGTCAAGTCCTCAAAAA
14221 TTCATCTAAATTAGTGCTAGTGTCAGGTGATCTCAGTGAAAACACCGTAATGTCCTGTGC
14281 CAACATTGCCTCTACTGTAGCACGGCTATGCGAGAACGGGCTTCCCAAAGACTTCTGTTA
14341 CTATTTAAACTATATAATGAGTTGTGTGCAGACATACTTTGACTCTGAGTTCTCCATCAC
14401 CAACAATTCGCACCCCGATCTTAATCAGTCGTGGATTGAGGACATCTCTTTTGTGCACTC
14461 ATATGTTCTGACTCCTGCCCAATTAGGGGGACTGAGTAACCTTCAATACTCAAGGCTCTA
14521 CACTAGAAATATCGGTGACCCGGGGACTACTGCTTTTGCAGAGATCAAGCGACTAGAAGC
14581 AGTGGGATTACTGAGTCCTAACATTATGACTAATATCTTAACTAGGCCGCCTGGGAATGG
14641 AGATTGGGCCAGTCTGTGCAACGACCCATACTCTTTCAATTTTGAGACTGTTGCAAGCCC
14701 AAATATTGTTCTTAAGAAACATACGCAAAGAGTCCTATTTGAAACTTGTTCAAATCCCTT
14761 ATTGTCTGGAGTGCACACAGAGGATAATGAGGCAGAAGAGAAGGCATTGGCTGAATTCTT
14821 GCTTAATCAAGAGGTGATTCATCCCCGCGTTGCGCATGCCATCATGGAGGCAAGCTCTGT
14881 AGGTAGGAGAAAGCAAATTCAAGGGCTTGTTGACACAACAAACACCGTAATTAAGATTGC
14941 GCTTACTAGGAGGCCATTAGGCATCAAGAGGCTGATGCGGATAGTCAATTATTCTAGCAT
15001 GCATGCAATGCTGTTTAGAGACGATGTTTTTTCCTCCAGTAGATCCAACCACCCCTTAGT
15061 CTCTTCTAATATGTGTTCTCTGACACTGGCAGACTATGCACGGAATAGAAGCTGGTCACC
15121 TTTGACGGGAGGCAGGAAAATACTGGGTGTATCTAATCCTGATACGATAGAACTCGTAGA
15181 GGGTGAGATTCTTAGTGTAAGCGGAGGGTGTACAAGATGTGACAGCGGAGATGAACAATT
15241 TACTTGGTTCCATCTTCCAAGCAATATAGAATTGACCGATGACACCAGCAAGAATCCTCC
15301 GATGAGGGTACCATATCTCGGGTCAAAGACACAGGAGAGGAGAGCTGCCTCACTTGCAAA
15361 AATAGCTCATATGTCGCCACATGTAAAGGCTGCCCTAAGGGCATCATCCGTGTTGATCTG
15421 GGCTTATGGGGATAATGAAGTAAATTGGACTGCTGCTCTTACGATTGCAAAATCTCGGTG
15481 TAATGTAAACTTAGAGTATCTTCGGTTACTGTCCCCTTTACCCACGGCTGGGAATCTTCA
15541 ACATAGACTAGATGATGGTATAACTCAGATGACATTCACCCCTGCATCTCTCTACAGGGT
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15661 AGAGGGGAATGTGGTTTACCAACAGATCATGCTCTTGGGTTTATCTCTAATCGAATCGAT
15721 CTTTCCAATAACAACAACCAGGACATATGATGAGATCACACTGCACCTACATAGTAAATT
15781 TAGTTGCTGTATCAGAGAAGCACCTGTTGCGGTTCCTTTCGAGCTACTTGGGGTGGTACC
15841 GGAACTGAGGACAGTGACCTCAAATAAGTTTATGTATGATCCTAGCCCTGTATCGGAGGG
15901 AGACTTTGCGAGACTTGACTTAGCTACTTTCAAGAGTTATGAGCTTAATCTGGAGTCATA
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16141 AGCACTTGAAGTGCTCCTCGACTGTTCTTACCAACTCTATTACCTGAGAGTAAGAGGCCT
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16261 CAACATTGCAGCTACAATATCTCATCCCGTCATTCATTCAAGGTTACATGCAGTGGGCCT
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16381 ACTATTAGTATCTTGCACCCGACGTGTGATCTCCGGCTTATATTCAGGAAATAAGTATGA
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16561 AGGCTTAACTGCAGAAGAGAAATGTTCAATACTCACTGAGTATTTACTGTCGGATGCTGT
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16681 CCCAGCTAATCTGTACTACATGTCTCGGAAGAGCCTCAATTTGATCAGGGAAAGGGAGGA
16741 CAGGGATACTATCCTGGCGTTGTTGTTCCCCCAAGAGCCATTATTAGAGTTCCCTTCTGT
16801 GCAAGATATTGGTGCTCGAGTGAAAGATCCATTCACCCGACAACCTGCGGCATTTTTGCA
16861 AGAGTTAGATTTGAGTGCTCCAGCAAGGTATGACGCATTCACACTTAGTCAGATTCATCC
16921 TGAACTCACATCTCCAAATCCGGAGGAAGACTACTTAGTACGATACTTGTTCAGAGGGAT
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17641 TACATTTGTACATGAGGTGGTGAGGATGGCGAAAACTCTGGTGCAGCGGCACGGTACGCT
17701 TTTGTCTAAATCAGATGAGATCACACTGACCAGGTTATTCACCTCACAGCGGCAGCGTGT
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17881 GAGCACGCTAGCGAACATAACTCAGATAACCCAGATCATCGCTAGTCACATTGACACAGT
17941 TATCCGGTCTGTGATATATATGGAAGCTGAGGGTGATCTCGCTGACACAGTATTTCTATT
18001 TACCCCTTACAATCTCTCTACTGACGGGAAAAAGAGGACATCACTTAAACAGTGCACGAG
18061 ACAGATCCTAGAGGTTACAATACTAGGTCTTAGAGTCGAAAATCTCAATAAAATAGGCGA
18121 TATAATCAGCCTAGTGCTTAAAGGCATGATCTCCATGGAGGACCTTATCCCACTAAGGAC
18181 ATACTTGAAGCATAGTACCTGCCCTAAATATTTGAAGGCTGTCCTAGGTATTACCAAACT
18241 CAAAGAAATGTTTACAGACACTTCTGTACTGTACTTGACTCGTGCTCAACAAAAATTCTA
18301 CATGAAAACTATAGGCAATGCAGTCAAAGGATATTACAGTAACTGTGACTCTTAACGAAA
18361 ATCACATATTAATAGGCTCCTTTTTTGGCCAATTGTATTCTTGTTGATTTAATCATATTA
18421 TGTTAGAAAAAAGTTGAACCCTGACTCCTTAGGACTCGAATTCGAACTCAAATAAATGTC
18481 TTAAAAAAAGGTTGCGCACAATTATTCTTGAGTGTAGTCTCGTCATTCACCAAATCTTTG
18541 TTTGGTTTGGTGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATTCC
18601 GAGGGGACCGTCCCCTCGGTAATGGCGAATGGGACGCGGCCGATCCGGCTGCTAACAAAG
18661 CCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTG
18721 GGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGATCGG
18781 CCGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGC
18841 AATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAG
18901 GAGGAACTATATCCGGATGGCCGCCACCGGTGGGCCTTGCAGCACATCCCCCCTTCGCCA
18961 G
Claims (6)
1.一种新型新城疫疫苗毒株，其具体制备方法如下：将重组质粒pBrClone30-chIL15、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染哺乳动物细胞并培养，得到所述鸡新城疫病毒活疫苗毒株。
2.权利要求1所述的鸡新城疫病毒活疫苗株，其特征在于:所述重组质粒pBrClone30-chIL15为序列表的序列3所示的质粒。
3.正如权利1或2所述的鸡新城疫病毒活疫苗株，其特征在于：所述的哺乳动物细胞为BHK-21细胞。
4.鸡新城疫病毒活疫苗株，其基因组DNA如序列表的序列3自5’末端第2703-18546位核苷酸所示。
5.权利要求1至4中任一所述的鸡新城疫病毒活疫苗株在制备新城疫病疫苗中的应用。
6.一种鸡新城疫病疫苗，包括权利要求1至4中任一所述的鸡新城疫病毒活疫苗株。
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Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| OZDEMIR O等: "Mechanisms of superior anti-tumor cytotoxic response of interleukin 15-induced lymphokine-activated killer cell.", 《J IMMUNOTHER》 * |
| 侯萍等: "新城疫病毒疫苗及白细胞介素-15对卵巢细胞株体外作用的实验研究", 《青岛医药卫生》 * |
| 吕政: "重组新城疫病毒rClone30-CD的构建及其抑制肿瘤效果的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 * |
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| 王衡等: "雏鸡免疫鸡IL-15基因质粒和新城疫病毒F基因质粒后免疫细胞数量的动态变化", 《畜牧与兽医》 * |
Also Published As
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