CN104404004A - 鸡新型新城疫疫苗病毒毒株rClone30-chIL15及其应用 - Google Patents

鸡新型新城疫疫苗病毒毒株rClone30-chIL15及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鸡新型新城疫病毒毒株及其应用。本发明提供的鸡新城疫病毒毒株，其制备方法包括如下步骤：将重组质粒pBrClone30-chIL15和辅助质粒pBL-N、pBL-P和pBL-L共转染哺乳动物细胞BHK-21并培养，得到所述鸡新城疫病毒毒株；所述重组质粒pBrClone30-chIL15为具有序列表的序列1所示的DNA分子的质粒。序列表的序列3自5ˊ末端第2703-18546位核苷酸即为rClone30-chIL15病毒的基因组DNA。本发明通过在现有新城疫活疫苗基因组中引入分子佐剂chIL15，可以有效提高免疫效果，提高免疫保护率。本发明对于新城疫病的防治具有重大意义。

Description

鸡新型新城疫疫苗病毒毒株rClone30-chIL15及其应用
技术领域
本发明涉及鸡新型新城疫病毒毒株rClone30-chIL15及其应用。
背景技术
新城疫病（Newcastle Disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle Disease Virus，NDV）引起的禽类高度接触性和急性败血性的烈性传染病，对世界养禽业危害极为严重。NDV病毒作为单股负链的RNA病毒其宿主范围很广，其中以鸡的易感性最高且幼鸡的发病率和死亡率明显高于大龄鸡，一年四季均可以发生，但主要以春季发病较多。仅过去三年新城疫就发病1252起，涉及19个省、市、自治区，发病家禽近四十万羽，死亡二十万羽，捕杀十五余万羽。
目前我国则一直采用以疫苗接种为主、捕杀隔离消毒为辅的措施来控制新城疫的发生。弱毒疫苗能够诱导体液免疫和粘膜免疫，在国内外得到普遍的应用。但此类疫苗常常需要在首次接种后7天才有抗体产生直至免疫后两周抗体滴度才达到保护水平，从免疫到具有保护力需2周以上的时间，如果新城疫一旦爆发在疫苗接种的这段免疫空白期，鸡群将无法得到有效的免疫保护。可见，在控制新城疫发病与流行中，从首免到具有完全保护自身的抗体水平所需时间越短越好；那么，速效疫苗的研制就显得尤为重要与迫切。
发明内容
本发明的目的是提供鸡新城疫病毒毒株rClone30-chIL15及其应用。本发明提供的鸡新城疫病毒毒株，其制备方法包括如下步骤：将所需的重组质粒pBrClone30-chIL15和辅助质粒pBL-N、pBL-P和pBL-L共转染哺乳动物细胞后进行培养，获得所述鸡新城疫病毒毒株；所述重组质粒pBrClone30-chIL15为具有序列表的序列3所示的DNA分子的质粒。序列表的序列3自5’末端第2703-18546位核苷酸所示的DNA分子即为rClone30- chIL15病毒的基因组DNA。
所述重组质粒pBrClone30-chIL15具体可为序列表的序列3所示的质粒。
所述哺乳动物细胞具体可为BHK-21细胞。
rClone30-chIL15病毒的制备方法具体如下：
（1）把所述重组质粒pBrClone30-chIL15、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染BHK-21细胞（每1×106个细胞转染1μg重组质粒pBrClone30- chIL15、0.5μg pBL-N质粒、0.25μg pBL-P质粒和0.1μg pBL-L质粒），放置于5% CO2、37℃静置培养72h；
（2）将上述步骤（1）得到的转染细胞，反复冻融3次，离心获得细胞上清液，然后接种于9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37℃培养72h，收集鸡胚尿囊液（其中含有rClone30- chIL15病毒）；
（3）将步骤（2）得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，37℃培养72h，收集鸡胚尿囊液；
（4）将步骤（3）得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，37℃培养72h，收集鸡胚尿囊液；
（5）将步骤（2）、步骤（3）和步骤（4）得到的鸡胚尿囊液进行混合，得到的混合液，即为rClone30- chIL15病毒液。
本发明还保护一种鸡新城疫病毒毒株（命名为rClone30-chIL15病毒），其基因组DNA如序列表的序列3自5ˊ末端第2703-18546位核苷酸所示。
本发明还保护以上任一所述的鸡新城疫病毒毒株及其应用。
本发明还保护一种鸡新城疫病疫苗，包括以上任一所述的鸡新城疫病毒毒株。
本发明提供一种新的鸡新城疫病毒毒株，命名为rClone30-chIL15，简称毒株rClone30-chIL15。毒株rClone30-chIL15是将chIL15多肽的编码基因利用两个限制性内切酶插入到鸡新城疫病毒毒株Clone30（简称毒株Clone30，弱毒株，为现有的新城疫病活疫苗）的基因组的F基因和HN基因之间得到的重组病毒株。毒株rClone30-chIL15免疫鸡群后，可以使鸡快速产生抗体，使免疫空白期从2周缩短到1周，弥补了现有新城疫活疫苗产生抗体时间过长的缺点，而且能增强细胞免疫，让鸡获得全面的免疫。
本发明涉及的重组新城疫病毒可视为基因工程改造后的弱毒疫苗株，可制备为任何常规制剂，如冻干粉针制剂、液体疫苗制剂等。
本发明通过在现有新城疫活疫苗基因组基础上在F和HN之间引入分子佐剂chIL15，可以有效提高免疫效果，有效缩短免疫空白期，使鸡群提早产生保护性抗体，提高免疫保护率。
附图说明
图1为重组质粒pBrClone30-chIL15的元件示意图。
图2为混合液的HA效价和HI效价结果。
图3为PCR鉴定电泳图。
图4为实施例2的结果。
图5为实施例3的结果。
图6-图8为实施例4的结果。
图9为实施例5的结果。
具体实施方式
以下涉及实施例有利于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
提及“pBrClone30质粒”的文献：“Enhancement of anti-tumor activity of Newcastle disease virus by the synergistic effect of cytosine deaminase”,Zheng LV,Asian Pac J Cancer Ptev.。
提及“pBL-N质粒”、“pBL-P质粒”和“pBL-L质粒”的文献：Genetically engineered Newcastle disease virus expressing interleukin 2 is a potential drug candidate for cancer immunotherapy,Fuliang Bai,Immunology letters.。
pBrClone30质粒中具有新城疫病毒的NP基因、P基因、M基因、F基因、HN基因和L基因，其中F基因和HN基因之间具有SacⅡ和MluI酶切识别位点。将pBrClone30质粒、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染哺乳动物细胞并培养(pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒起辅助作用，pBrClone30质粒提供病毒的全基因组)，得到毒株Clone30。
提及“NDV强毒BJ株”的文献：“鸡新城疫病毒强毒株的分离鉴定及其遗传变异分析”，校海霞，河北农业大学硕士学位论文。
BHK-21细胞：ATCC编号为CRL-13001。
DF-1细胞：ATCC编号为CRL-12203。
SPF级白色来航鸡：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。
ChIL15多肽的全称为鸡白细胞介素15，如序列表的序列2所示，其编码基因的开放阅读框如序列表的序列1自5ˊ末端第15至578位核苷酸所示。
完全DMEM培养基即为含有5%胎牛血清的DMEM培养基。
鸡血红细胞凝集（HA）试验的具体方法如下：(1)在血凝板第一排的1-12孔各加入50μL生理盐水；(2)在第1孔中加入50μL待测病毒液，混匀后吸50μL到第2孔，如此倍比稀释直到第10孔，第10孔混匀后弃除50μL；(3)在1-12孔中各加入50μL 1%鸡血红细胞；(4)震荡后室温静置20-30min，观察结果。
鸡血红细胞凝集抑制（HI）试验的具体方法如下：(1)在血凝板的1-12孔各加入25μL生理盐水；(2)第1孔加入待检血清25μL，混匀后吸25μL至第2孔，倍比稀释直至第10孔，第10孔混匀后弃除25μL；(3)在1-12孔中各加入25μL实施例1制备的rClone30病毒液（4个血凝单位），室温静置30min；(4)在1-12孔中各加入25μL 1%鸡血红细胞；(5)震荡后室温静置30-40min，观察结果。
实施例1、rClone30-chIL15病毒液的制备
一、重组质粒的构建
1、合成序列表的序列1所示的双链DNA分子。
合成序列表的序列1中，自5ˊ末端第1至6位核苷酸为限制性内切酶SacⅡ的识别序列，第9-14位核苷酸为Kozac序列，第15至578位核苷酸为chIL15多肽的编码基因，第579至584位核苷酸为限制性内切酶MluI的识别序列；
2、用限制性内切酶SacⅡ和MluI双酶切步骤1得到的双链DNA分子，回收酶切产物；
3、用限制性内切酶SacⅡ和MluI双酶切pBrClone30质粒，回收载体骨架片段，大小约16000bp；
4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pBrClone30-chIL15。重组质粒pBrClone30-chIL15的核苷酸序列如序列表的序列3所示（序列表的序列3中，自5ˊ末端第位2703-18546核苷酸为rClone30-chIL15病毒的基因组）。重组质粒pBrClone30-chIL15的元件示意图见图1。
二、重组病毒的制备
1、将重组质粒pBrClone30-chIL15、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染BHK-21细胞（每1×106个细胞约转染1μg重组质粒pBrClone30-chIL15、0.5μgpBL-N质粒、0.25μg pBL-P质粒和0.1μg pBL-L质粒），置于5% CO2、37℃静置培养72h；
2、将步骤1得到的转染细胞，反复冻融3次，离心获得细胞上清液，接种于9-11日龄SPF鸡胚，37℃培养72h，收集鸡胚尿囊液；
3、将步骤2得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚，37℃培养72h，收集鸡胚尿囊液；
4、将步骤3得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚，37℃培养72h，收集鸡胚尿囊液；
5、将步骤2、步骤3和步骤4得到的鸡胚尿囊液进行混合，得到的混合液即为所制备的病毒（该混合液的HA效价为2048，HI效价为2048，见图2）；
6、将步骤5得到的混合液，提取总RNA并反转录为cDNA，采用F1和R1组成的引物PCR(F15ˊ-CCGCGGACGCCACCATGCTGGGGAT-3ˊ；R15ˊ-ACGCGTTTAGTTAGCGTATTTTTTG-3ˊ)，结果见图3。PCR扩增片段大小约为560bp，与预期相符。
结果表明，成功制备了具有感染性的表达chIL15多肽的NDV病毒，将步骤5得到的混合液命名为rClone30-chIL15病毒液。
三、对照病毒的制备
用pBrClone30质粒代替重组质粒pBrClone30-chIL15进行步骤二的1至5，得到的混合液命名为rClone30病毒液。
实施例2、检测病毒液中chIL15的表达量
1、将对数生长期的DF-1细胞接种于六孔板，以0.1MOI的剂量感染实施例1制备的rClone30-chIL15病毒液（rClone30-chIL15病毒液用完全DMEM培养基稀释），37℃静置孵育1h，完全DMEM培养基洗涤三遍，加入含1μg/mL胰蛋白酶的完全DMEM培养基并置于5% CO2、37℃静置培养48h，然后反复冻融3次，离心收取上清液；
2、用实施例1制备的rClone30病毒液代替rClone30-chIL15病毒液，其它同步骤1；
3、采用chIL15试剂盒（Antibodies online ，ABIN414131）,并按说明书进行操作，检测步骤1得到的上清液和步骤2得到的上清液中的chIL15的浓度；
结果见图4。结果表明，rClone30-chIL15病毒能够稳定表达chIL15,而rClone30病毒不表达chIL15。
实施例3、rClone30-chIL15病毒与rClone30病毒在宿主细胞中的动力生长曲线
1、将对数生长期的DF-1细胞接种于六孔板，以0.1MOI的剂量将实施例1制备的rClone30-chIL15病毒液（rClone30-chIL15病毒液用完全DMEM培养基稀稀释）接种于细胞单层，采用含1μg/mL胰蛋白酶的完全DMEM培养基，置于5% CO2、37℃静置培养96h，每隔24h取上清液并测定TCID50；
2、实施例1制备的rClone30病毒液代替rClone30-chIL15病毒液，其它同步骤1。
结果见图5。rClone30-chIL15病毒与rClone30病毒繁殖滴度保持一致。结果表明，空载体rClone30在插入外源的chIL15基因之后增殖能力并没有因此而改变。
实施例4、rClone30-chIL15病毒缩短免疫空白期情况及佐剂疫苗对细胞免疫的增强作用
按照农业部标准，青年鸡的抗体效价≥5log2时判为合格。
取45日龄的SPF级白色来航鸡，随机分为3组，每组15只。分别处理如下（均为单次免疫）：
第一组：每只实验鸡以点眼滴鼻的方式免疫200μL实施例1所得重组病毒rClone30-chIL15病毒液（rClone30-chIL15病毒液用完全DMEM培养基稀释，用于免疫的病毒液的浓度为105TCID50/0.1ml）；
第二组：每只鸡同样以点眼滴鼻的方式进行免疫，（rClone30病毒液用完全DMEM培养基稀释，用于免疫的病毒液的浓度为105TCID50/0.1ml）；
第三组：每只鸡以点眼滴鼻的方式免疫0.9%的生理盐水200μL；
分别于免疫后2d、4d、6d、8d羽静脉采血分离血清，进行HI抗体效价检测结果见图6，同时分离相应天数的血液中的淋巴细胞，用FITC标记的鼠抗鸡的CD4+抗体（Abcam，ab24896）和CD8+ 抗体（Abcam，ab24899）经流式细胞仪检测淋巴细胞中CD4+、CD8+T占淋巴细胞的百分比，结果见图7、图8。
如图6所示，第一组即rClone30- chIL15免疫组在免疫后两天抗体开始上升至第6天达到保护性水平，在免疫后6天时rClone30在3.6 log2左右，无法形成有效保护，抵抗强毒的攻击。结果如图7、8所示。在免疫后第二天重组lone30-chIL15实验组的鸡CD4+、CD8+T细胞含量都开始增加，且至第八天时一直高于对照组rClone30，可见重组rClone30- chIL15能在快速产生保护性抗体的同时刺激机体细胞免疫，使鸡的免疫力增强。
实施例5、rClone30-chIL15病毒或rClone30病毒免疫鸡后的HI抗体效价
参照农业部标准，青年鸡的抗体效价≥5log2时判为合格。特别是在30日龄前后抗体水平低于此标准，如果在此期间有强毒侵入，就有可能暴发新城疫。如果鸡群能在此期间达到此标准，将不受新城疫病毒的威胁。
取30日龄的SPF级白色来航鸡，随机分为3组，每组10只。分别处理如下（均为单次免疫）：
第一组：每只通过滴鼻点眼的方式免疫200μL实施例1制备的rClone30-chIL15病毒液（rClone30-chIL15病毒液用完全DMEM培养基稀释，用于免疫的病毒液的浓度为105TCID50/0.1ml）；
第二组：每只通过滴鼻点眼的方式免疫200μL实施例1制备的rClone30病毒液（rClone30病毒液用完全DMEM培养基稀释，用于免疫的病毒液的浓度为105TCID50/0.1ml）；
第三组：每只通过滴鼻点眼方式免疫200μL 0.9%生理盐水。
分别于免疫后7d、14 d、21d翅静脉采血分离血清，检测HI效价。
结果见图9。免疫后7d，第一组血清的HI效价高于5log2，第二组的效价低于3log2，即rClone30-chIL15病毒液将可以实现早期保护效果，使鸡免受新城疫病毒的威胁，而rClone30病毒液将无法在免疫7d后实现有效保护鸡免受新城疫病毒的威胁。
实施例6、攻毒试验
将30日龄SPF级白色来航鸡随机分为3组，每组30只。分别处理如下（均为单次免疫）：
第一组：实验第1天，每只通过滴鼻点眼方式免疫200μL实施例1制备的rClone30-chIL15病毒液（rClone30-chIL15病毒液用完全DMEM培养基稀释，用于免疫的病毒液的浓度为105TCID50/0.1ml）
第二组：实验第1天，每只通过滴鼻点眼方式免疫200μL实施例1制备的rClone30病毒液（rClone30病毒液用完全DMEM培养基稀释，用于免疫的病毒液的浓度为105TCID50/0.1ml）；
第三组：实验第1天，每只通过滴鼻点眼方式免疫200μL 0.9%生理盐水。
实验第8天，采用NDV强毒BJ株进行攻毒（每只鸡采用104 ELD50的剂量经肌肉注射途径攻毒，攻毒体积为0.1ml），实验第18天，统计各组的发病与死亡情况。结果见表1。
表1 各组的发病与死亡情况统计（三次试验的平均值）
疫苗组 攻毒剂量 发病数量/死亡数量/总数量 保护率
第一组 104ELD50 0/0/30 100%
第二组 104ELD50 15/8/30 50%
第三组 104ELD50 30/30/30 0%
发病表征如下（满足①-④中的一项以上即判断为发病）：①上呼吸道分泌大量黏液，自口鼻流出，有时挂于嘴端，常摇头想甩掉；呼吸困难，呼吸时喉部发出“咯咯”的喘鸣声或尖叫声；②由于呼吸困难，血液中氧气不足，二氧化碳增多，使肉髯变为青紫色，临死前及死后尤为明显；③下痢，粪便呈绿色、黄白色，有时混有少量血液；④部分鸡嗉囊蓄积大量酸臭液体，倒提鸡时，液体急速自口中流出，提壶倒水一般。
结果表明：rClone30-chIL15免疫可在早期先于rClone30疫苗株刺激鸡体内产生抗体并同时增强体液免疫水平，提高攻毒保护效率。
序列1、chIL15的的核苷酸序列（SacⅡ，Kozac 保护碱基 MluⅠ）
1   CCGCGGACGCCACCATGCTGGGGATGGCACAGCCAACACAAAACTCTGCCGGAGCACGGA
61  GAAGGCCGGAGAGTCAGAAAACACATGTGAAAAGTATTTGTCTCCAGTACCAACTGTATC
121 TACTTTTGAACAGCCATTTCTTTTGCCTTTTAAAGAATAAGACTGGACTAACCATCTTCT
181 TCCTATGTGCTTATGTACCAAAGACAGAAGCAAATCACTGTAAGTGGTCAGACGTTCTGA
241 AAGATTTGGAGCTGATCAAGACATCTGAAGACATTGATGTCAGTTTATATACTGCAAACA
301 CATACGAGGATATAGAATGCCAGGAACCTGTAATGAGATGTTTTTTTTTAGAGATGAAAG
361 TGATTCTTCACGAATGTGATATCAAAAAATGTAGTAGGAAGCATGATGTACGGAACATAT
421 GGAAAAATGGAAATGCAAGATTTGCAACTTACCAGTTGAATTCCACAACAGCAAAAAAAT
481 GCAAAGAATGTGAAGAGTATGAAGAAAAAAATTTTACAGAATTTATACAGAGTTTTGTAA
541 AGGTTATACAGAGGGAATGCAAAAAATACGCTAACTAAACGCGT
序列2、chIL15的氨基酸序列
1   MLGMAQPTQNSAGARRRPESQKTHVKSICLQYQLYLLLNSHFFCLLKNKTGLTIFFLCAY
61  VPKTEANHCKWSDVLKDLELIKTSEDIDVSLYTANTYEDIECQEPVMRCFFLEMKVILHE
121 CDIKKCSRKHDVRNIWKNGNARFATYQLNSTTAKKCKECEEYEEKNFTEFIQSFVKVIQR
181 ECKKYAN*
 
序列3（自5ˊ末端第2703-18546位核苷酸为病毒rClone30-chIL15基因组）
1        CTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGTAGCCTGAA
61       TGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCG
121      CAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTC
181      CTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGG
241      GTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTC
301      ACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTT
361      CTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTC
421      TTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTA
481      ACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCAGGTGGCACTTT
541      TCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTA
601      TCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTAT
661      GAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGT
721      TTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACG
781      AGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGA
841      AGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCG
901      TATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGT
961      TGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATG
1021     CAGTGCTGCCATAAGCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGG
1081     AGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTTCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGA
1141     TCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCC
1201     TGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTC
1261     CCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTC
1321     GGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCG
1381     CGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACAC
1441     GACGGGCAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTC
1501     ACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTT
1561     AAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGAC
1621     CAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAA
1681     AGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACC
1741     ACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGT
1801     AACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGG
1861     CCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACC
1921     AGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTT
1981     ACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGA
2041     GCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCT
2101     TCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCG
2161     CACGAGGGAGCTTCCAGGGGGGAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCA
2221     CCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCCGAGCCTATGGAAAAA
2281     CGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTT
2341     CTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGA
2401     TACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGA
2461     GCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCA
2521     CGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTACCT
2581     CACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCCTATGTTGTGTGGAAT
2641     TGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCGG
2701     AAGCGGCCGCTAATACGACTCACTATAGGGACCAAACAGAGAATCCGTAAGTTACGATAA
2761     AAGGCGAAGGAGCAATTGAAGTCGCACGGGTAGAAGGTGTGAATCTCGAGTGCGAGCCCG
2821     AAGCACAAACTCGAGAAAGCCTTCTGCCAACATGTCTTCCGTATTTGATGAGTACGAACA
2881     GCTCCTCGCGGCTCAGACTCGCCCCAATGGAGCTCATGGAGGGGGAGAAAAAGGGAGTAC
2941     CTTAAAAGTAGACGTCCCGGTATTCACTCTTAACAGTGATGACCCAGAAGATAGATGGAG
3001     CTTTGTGGTATTCTGCCTCCGGATTGCTGTTAGCGAAGATGCCAACAAACCACTCAGGCA
3061     AGGTGCTCTCATATCTCTTTTATGCTCCCACTCACAGGTAATGAGGAACCATGTTGCCCT
3121     TGCAGGGAAACAGAATGAAGCCACATTGGCCGTGCTTGAGATTGATGGCTTTGCCAACGG
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3241     GATAGCAGGATCTCTCCCTCGGGCATGCAGCAACGGAACCCCGTTCGTCACAGCCGGGGC
3301     CGAAGATGATGCACCAGAAGACATCACCGATACCCTGGAGAGGATCCTCTCTATCCAGGC
3361     TCAAGTATGGGTCACAGTAGCAAAAGCCATGACTGCGTATGAGACTGCAGATGAGTCGGA
3421     AACAAGGCGAATCAATAAGTATATGCAGCAAGGCAGGGTCCAAAAGAAATACATCCTCTA
3481     CCCCGTATGCAGGAGCACAATCCAACTCACGATCAGACAGTCTCTTGCAGTCCGCATCTT
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3721     CATCCAGAAGATGAAGCAGCTCATGCGTTTGTATCGGATGAAAGGAGATAATGCGCCGTA
3781     CATGACATTACTTGGTGATAGTGACCAGATGAGCTTTGCGCCTGCCGAGTATGCACAACT
3841     TTACTCCTTTGCCATGGGTATGGCATCAGTCCTAGATAAAGGTACTGGGAAATACCAATT
3901     TGCCAGGGACTTTATGAGCACATCATTCTGGAGACTTGGAGTAGAGTACGCTCAGGCTCA
3961     GGGAAGTAGCATTAACGAGGATATGGCTGCCGAGCTAAAGCTAACCCCAGCAGCAAGGAG
4021     GGGCCTGGCAGCTGCTGCCCAACGGGTCTCCGAGGAGACCAGCAGCATAGACATGCCTAC
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4201     GATGAGAGCGGTAGCAAATAGCATGAGGGAGGCGCCAAACTCTGCACAGGGCACTCCCCA
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4321     ATGGACAAAACCCAGCCTGCTTCCACAAAAACATCCCAATGCCCTCACCCGTAGTCGACC
4381     CCTCGATTTGCGGCTCTATATGACCACACCCTCAAACAAACATCCCCCTCTTTCCTCCCT
4441     CCCCCTGCTGTACAACTCCGCACGCCCTAGATACCACAGGCACAATGCGGCTCACTAACA
4501     ATCAAAACAGAGCCGAGGGAATTAGAAAAAAGTACGGGTAGAAGAGGGATATTCAGAGAT
4561     CAGGGCAAGTCTCCCGAGTCTCTGCTCTCTCCTCTACCTGATAGACCAGGACAAACATGG
4621     CCACCTTTACAGATGCAGAGATCGACGAGCTATTTGAGACAAGTGGAACTGTCATTGACA
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4741     GCAAGACCAAGGTGCTGAGCGCAGCATGGGAGAAGCATGGGAGCATCCAGCCACCGGCCA
4801     GTCAAGACAACCCCGATCGACAGGACAGATCTGACAAACAACCATCCACACCCGAGCAAA
4861     CGACCCCGCATGACAGCCCGCCGGCCACATCCGCCGACCAGCCCCCCACCCAGGCCACAG
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4981     ACAAGCTCAGCAATAAATCGTCCAATGCTAAAAAGGGCCCATGGTCGAGCCCCCAAGAGG
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5101     AAAGACCGCAGAACCAAGTCAAGGCCGCCCCTGGAAACCAGGGCACAGACGTGAACACAG
5161     CATATCATGGACAATGGGAGGAGTCACAACTATCAGCTGGTGCAACCCCTCATGCTCTCC
5221     GATCAAGGCAGAGCCAAGACAATACCCTTGTATCTGCGGATCATGTCCAGCCACCTGTAG
5281     ACTTTGTGCAAGCGATGATGTCTATGATGGAGGCGATATCACAGAGAGTAAGTAAGGTTG
5341     ACTATCAGCTAGATCTTGTCTTGAAACAGACATCCTCCATCCCTATGATGCGGTCCGAAA
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5521     ACCCGGTTTTAGTTTCAGGCCCTGGAGACCCCTCTCCCTATGTGACACAAGGAGGCGAAA
5581     TGGCACTTAATAAACTTTCGCAACCAGTGCCACATCCATCTGAATTGATTAAACCCGCCA
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6121     GAAGCAAATCGCCCCGCAATATAGGATCCAGCGCCTTGACTTGTGGACTGATAGTAAGGA
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6601     GAAGGTTTCTGGCTCGAGTCTGTACAATCTTGCGCTCAATGTCACTATTAATGTGGAGGT
6661     AGACCCGAGGAGTCCTTTGGTTAAATCTCTGTCTAAGTCTGACAGCGGATACTATGCTAA
6721     CCTCTTCTTGCATATTGGACTTATGACCACCGTAGATAGGAAGGGGAAGAAAGTGACATT
6781     TGACAAGCTGGAAAAGAAAATAAGGAGCCTTGATCTATCTGTCGGGCTCAGTGATGTGCT
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8641     AATAACAGGCAATCTTGATATCTCAACTGAGCTTGGGAATGTCAACAACTCGATCAGTAA
8701     TGCTTTGAATAAGTTAGAGGAAAGCAACAGAAAACTAGACAAAGTCAATGTCAAACTGAC
8761     TAGCACATCTGCTCTCATTACCTATATCGTTTTGACTATCATATCTCTTGTTTTTGGTAT
8821     ACTTAGCCTGATTCTAGCATGCTACCTAATGTACAAGCAAAAGGCGCAACAAAAGACCTT
8881     ATTATGGCTTGGGAATAATACTCTAGATCAGATGAGAGCCACTACAAAAATGTGAACACA
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9121     GAAAAGTATTTGTCTCCAGTACCAACTGTATCTACTTTTGAACAGCCATTTCTTTTGCCT
9181     TTTAAAGAATAAGACTGGACTAACCATCTTCTTCCTATGTGCTTATGTACCAAAGACAGA
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9301     AGACATTGATGTCAGTTTATATACTGCAAACACATACGAGGATATAGAATGCCAGGAACC
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10081    ATGAACGCAATAACATCTCTCTCTTATCAGATTAATGGAGCTGCAAACAACAGTGGGTGG
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10441    CTGCGTTCCATCAACCTGGACGACACCCAAAATCGGAAGTCTTGCAGTGTGAGTGCAACT
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10801    TGCCCAGATGAGCAAGACTACCAGATTCGAATGGCCAAGTCTTCGTATAAGCCTGGACGG
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10921    GAAGACCCGGTACTGACTGTACCGCCCAACACAGTCACACTCATGGGGGCCGAAGGCAGA
10981    ATTCTCACAGTAGGGACATCTCATTTCTTGTATCAACGAGGGTCATCATACTTCTCTCCC
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11101    TTCAATGCCTTCACTCGGCCAGGTAGTATCCCTTGCCAGGCTTCAGCAAGATGCCCCAAC
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11221    TTGCGAGGGGTATTCGGGACAATGCTTGATGGTGTACAAGCAAGACTTAACCCTGCGTCT
11281    GCAGTATTCGATAGCACATCCCGCAGTCGCATTACTCGAGTGAGTTCAAGCAGTACCAAA
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11401    AGCATTGCTGAAATATCTAATACTCTCTTCGGAGAATTCAGAATCGTCCCGTTACTAGTT
11461    GAGATCCTCAAAGATGACGGGGTTAGAGAAGCCAGGTCTGGCTAGTTGAGTCAATTATAA
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11761    AAGGGCAGAGCATCAGATTATCCTACCAGAGTCACACCTGTCTTCACCATTGGTCAAGCA
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12121    GTTCACAAGGCTGTGTACGCATATAGAGAAGAAACTGCTGGGGTCATCTTGGTCTAACAA
12181    TGTCCCCCGGTCAGAGGAGTTCAGCAGCATTCGTACGGATCCGGCATTCTGGTTTCACTC
12241    AAAATGGTCCACAGCCAAGTTTGCATGGCTCCATATAAAACAGATCCAGAGGCATCTGAT
12301    GGTGGCAGCTAGGACAAGGTCTGCGGCCAACAAATTGGTGATGCTAACCCATAAGGTAGG
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12421    ATGTCTTACCCAGGAACTTGTATTGATGTATGCAGATATGATGGAGGGCAGAGATATGGT
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12541    TTTGCGGTTAATAGACGCTCTGGCAAAAGACTTGGGTAATCAAGTCTACGATGTTGTATC
12601    ACTAATGGAGGGATTTGCATACGGAGCTGTCCAGCTACTCGAGCCGTCAGGTACATTTGC
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12721    CAATGATATAGCAGAATCCGTGACTCATGCAATCGCTACTGTATTCTCTGGTTTAGAACA
12781    GAATCAAGCAGCTGAGATGTTGTGTCTGTTGCGTCTGTGGGGTCACCCACTGCTTGAGTC
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12961    GAATGCAGGTGTGTGGCCGCGAGTCAAAGTGGATACAATATATGGGAAGGTCATTGGGCA
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13081    ATCTGCACTTGAATTTGAGCCATGTATAGAATATGACCCTGTCACCAACCTGAGCATGTT
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15061    CTCTTCTAATATGTGTTCTCTGACACTGGCAGACTATGCACGGAATAGAAGCTGGTCACC
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15181    GGGTGAGATTCTTAGTGTAAGCGGAGGGTGTACAAGATGTGACAGCGGAGATGAACAATT
15241    TACTTGGTTCCATCTTCCAAGCAATATAGAATTGACCGATGACACCAGCAAGAATCCTCC
15301    GATGAGGGTACCATATCTCGGGTCAAAGACACAGGAGAGGAGAGCTGCCTCACTTGCAAA
15361    AATAGCTCATATGTCGCCACATGTAAAGGCTGCCCTAAGGGCATCATCCGTGTTGATCTG
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16441    TCTGCTGTTCCCATCTGTCTTAGATGATAACCTGAATGAGAAGATGCTTCAGCTGATATC
16501    CCGGTTATGCTGTCTGTACACGGTACTCTTTGCTACAACAAGAGAAATCCCGAAAATAAG
16561    AGGCTTAACTGCAGAAGAGAAATGTTCAATACTCACTGAGTATTTACTGTCGGATGCTGT
16621    GAAACCATTACTTAGTCCCGATCAAGTGAGCTCTATCATGTCTCCTAACATAATTACATT
16681    CCCAGCTAATCTGTACTACATGTCTCGGAAGAGCCTCAATTTGATCAGGGAAAGGGAGGA
16741    CAGGGATACTATCCTGGCGTTGTTGTTCCCCCAAGAGCCATTATTAGAGTTCCCTTCTGT
16801    GCAAGATATTGGTGCTCGAGTGAAAGATCCATTCACCCGACAACCTGCGGCATTTTTGCA
16861    AGAGTTAGATTTGAGTGCTCCAGCAAGGTATGACGCATTCACACTTAGTCAGATTCATCC
16921    TGAACTCACATCTCCAAATCCGGAGGAAGACTACTTAGTACGATACTTGTTCAGAGGGAT
16981    AGGGACTGCATCTTCCTCTTGGTATAAGGCATCTCATCTCCTTTCTGTACCCGAGGTAAG
17041    ATGTGCAAGACACGGGAACTCCTTATACTTAGCTGAAGGGAGCGGAGCCATCATGAGTCT
17101    TCTCGAACTGCATGTACCACATGAAACTATCTATTACAATACGCTCTTTTCAAATGAGAT
17161    GAACCCCCCGCAACGACATTTCGGGCCGACCCCAACTCAGTTTTTGAATTCGGTTGTTTA
17221    TAGGAATCTACAGGCGGAGGTAACATGCAAAGATGGATTTGTCCAAGAGTTCCGTCCATT
17281    ATGGAGAGAAAATACAGAGGAAAGTGACCTGACCTCAGATAAAGTAGTGGGGTATATTAC
17341    ATCTGCAGTGCCCTACAGATCTGTATCATTGCTGCATTGTGACATTGAAATTCCTCCAGG
17401    GTCCAATCAAAGCTTACTAGATCAACTAGCTATCAATTTATCTCTGATTGCCATGCATTC
17461    TGTAAGGGAGGGCGGGGTAGTAATCATCAAAGTGTTGTATGCAATGGGATACTACTTTCA
17521    TCTACTCATGAACTTGTTTGCTCCGTGTTCCACAAAAGGATATATTCTCTCTAATGGTTA
17581    TGCATGTCGAGGAGATATGGAGTGTTACCTGGTATTTGTCATGGGTTACCTGGGCGGGCC
17641    TACATTTGTACATGAGGTGGTGAGGATGGCGAAAACTCTGGTGCAGCGGCACGGTACGCT
17701    TTTGTCTAAATCAGATGAGATCACACTGACCAGGTTATTCACCTCACAGCGGCAGCGTGT
17761    GACAGACATCCTATCCAGTCCTTTACCAAGATTAATAAAGTACTTGAGGAAGAATATTGA
17821    CACTGCGCTGATTGAAGCCGGGGGACAGCCCGTCCGTCCATTCTGTGCGGAGAGTCTGGT
17881    GAGCACGCTAGCGAACATAACTCAGATAACCCAGATCATCGCTAGTCACATTGACACAGT
17941    TATCCGGTCTGTGATATATATGGAAGCTGAGGGTGATCTCGCTGACACAGTATTTCTATT
18001    TACCCCTTACAATCTCTCTACTGACGGGAAAAAGAGGACATCACTTAAACAGTGCACGAG
18061    ACAGATCCTAGAGGTTACAATACTAGGTCTTAGAGTCGAAAATCTCAATAAAATAGGCGA
18121    TATAATCAGCCTAGTGCTTAAAGGCATGATCTCCATGGAGGACCTTATCCCACTAAGGAC
18181    ATACTTGAAGCATAGTACCTGCCCTAAATATTTGAAGGCTGTCCTAGGTATTACCAAACT
18241    CAAAGAAATGTTTACAGACACTTCTGTACTGTACTTGACTCGTGCTCAACAAAAATTCTA
18301    CATGAAAACTATAGGCAATGCAGTCAAAGGATATTACAGTAACTGTGACTCTTAACGAAA
18361    ATCACATATTAATAGGCTCCTTTTTTGGCCAATTGTATTCTTGTTGATTTAATCATATTA
18421    TGTTAGAAAAAAGTTGAACCCTGACTCCTTAGGACTCGAATTCGAACTCAAATAAATGTC
18481    TTAAAAAAAGGTTGCGCACAATTATTCTTGAGTGTAGTCTCGTCATTCACCAAATCTTTG
18541    TTTGGTTTGGTGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATTCC
18601   GAGGGGACCGTCCCCTCGGTAATGGCGAATGGGACGCGGCCGATCCGGCTGCTAACAAAG
18661    CCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTG
18721    GGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGATCGG
18781    CCGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGC
18841    AATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAG
18901    GAGGAACTATATCCGGATGGCCGCCACCGGTGGGCCTTGCAGCACATCCCCCCTTCGCCA
18961    G
 

Claims (6)

1.一种新型新城疫疫苗毒株，其具体制备方法如下：将重组质粒pBrClone30-chIL15、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染哺乳动物细胞并培养，得到所述鸡新城疫病毒活疫苗毒株。
2.权利要求1所述的鸡新城疫病毒活疫苗株，其特征在于:所述重组质粒pBrClone30-chIL15为序列表的序列3所示的质粒。
3.正如权利1或2所述的鸡新城疫病毒活疫苗株，其特征在于：所述的哺乳动物细胞为BHK-21细胞。
4.鸡新城疫病毒活疫苗株，其基因组DNA如序列表的序列3自5’末端第2703-18546位核苷酸所示。
5.权利要求1至4中任一所述的鸡新城疫病毒活疫苗株在制备新城疫病疫苗中的应用。
6.一种鸡新城疫病疫苗，包括权利要求1至4中任一所述的鸡新城疫病毒活疫苗株。
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Non-Patent Citations (5)

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