CN104394863A - 骨髓干细胞的诱导剂及骨髓干细胞的诱导方法 - Google Patents
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Abstract
提供包含肉桂鞣质B1及五没食子酰基葡萄糖中的至少一种的骨髓干细胞的诱导剂及通过该诱导剂对骨髓干细胞进行诱导的骨髓干细胞的诱导方法。
Description
相关申请的相互参照
本申请主张日本专利申请第2012-139442号的优先权,并引用该向日本的申请中所记载的全部内容。该向日本的申请的内容通过引用而被纳入本申请说明书的记载中。
技术领域
本发明涉及骨髓干细胞的诱导剂及骨髓干细胞的诱导方法。
背景技术
骨髓干细胞是在骨髓中生成的还未分化的细胞,作为能够向各种体内组织的细胞分化的细胞而被知晓。另外,骨髓干细胞作为以下细胞而受到注目:在受到诱导分化的分化诱导剂的影响后,在丧失了功能的组织中分化成其组织细胞,由此能够恢复组织的功能。
具体来说,骨髓干细胞作为以下细胞受到注目:例如,在骨髓干细胞随着血液的流动从骨髓向有炎症的组织或受到损伤的组织移动后,受到分化诱导剂的影响而能够向其组织细胞分化。
以往,作为能够使骨髓干细胞向各种细胞分化的分化诱导剂,已知各种分化诱导剂,例如,已知能够使骨髓干细胞分化成心脏的肌肉细胞的成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor FGF)、血小板源性生长因子(Platelet-Derived Growth Factor PDGF)等(专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开第2005/063967号
发明内容
发明要解决的课题
但是,这种分化诱导剂虽然具有使骨髓干细胞向规定的组织细胞分化的性能,但存在不一定具备充分的诱导骨髓干细胞的性能的问题,例如,不一定具备充分的将随着血液流动而在体内循环的骨髓干细胞向规定的体内组织诱导的性能。
本发明鉴于上述问题,课题在于提供一种具有优异的骨髓干细胞诱导性能的骨髓干细胞的诱导剂。另外,本发明的课题在于提供一种具有优异的骨髓干细胞诱导性能的骨髓干细胞的诱导方法。
用于解决课题的手段
本发明的骨髓干细胞的诱导剂特征在于,包含肉桂鞣质B1及五没食子酰基葡萄糖中的至少一种。
本发明的骨髓干细胞的诱导方法特征在于,通过所述诱导剂对骨髓干细胞进行诱导。
附图说明
图1是示意地表示生物体外的细胞诱导试验的方式的图。
图2是表示生物体外的细胞诱导试验的结果的图。
图3是表示生物体外的细胞诱导试验的结果的图。
图4是表示小鼠生物体内的细胞诱导试验的结果的图表。
具体实施方式
以下说明本发明的骨髓干细胞的诱导剂的实施方式。
本实施方式的骨髓干细胞的诱导剂包括肉桂鞣质B1及五没食子酰基葡萄糖中的至少一种。
所述肉桂鞣质B1是具有下述式(1)的分子结构的化合物。
【化学式1】
所述骨髓干细胞的诱导剂中所含有的肉桂鞣质B1的浓度没有特别限定,作为该浓度,例如可列举0.001~100重量%。
所述骨髓干细胞的诱导剂除了肉桂鞣质B1以外,还可包含pH缓冲剂、水等溶剂、表面活性剂、防腐剂、油类、多元醇类、水溶性高分子化合物等。
包含所述肉桂鞣质B1的骨髓干细胞的诱导剂例如能够通过使市售的肉桂鞣质B1溶解在适当的溶剂中来制造。
另外,包含所述肉桂鞣质B1的骨髓干细胞的诱导剂例如能够通过对月桂(Laurus nobilisL.)、越橘(Vaccinium vitis-idaea)、arameria laevigata、锡兰肉桂(Cinnamomum zeylanicum)、钓樟(Lindera umbellate)或Metaxya rostrata等植物中包含肉桂鞣质B1的部分进行提取处理来制造。
另一方面,所述五没食子酰基葡萄糖是具有下述式(2)的分子结构的化合物。
【化学式2】
所述骨髓干细胞的诱导剂中所包含的五没食子酰基葡萄糖的浓度没有特别限定,作为该浓度,例如可列举0.001~100重量%。
所述骨髓干细胞的诱导剂除了五没食子酰基葡萄糖以外,还可包含pH缓冲剂、水等溶剂、表面活性剂、防腐剂、油类、多元醇类、水溶性高分子化合物等。
包含所述五没食子酰基葡萄糖的骨髓干细胞的诱导剂例如能够通过使市售的五没食子酰基葡萄糖溶解在适当的溶剂中来制造。
另外,包含所述五没食子酰基葡萄糖的骨髓干细胞的诱导剂例如能够通过对月见草的种子、芍药等进行提取处理来制造。
此外,所述骨髓干细胞的诱导剂可以包括肉桂鞣质B1或五没食子酰基葡萄糖中的任一种,也可以包括肉桂鞣质B1及五没食子酰基葡萄糖二者。
接下来,对本发明的骨髓干细胞的诱导方法的实施方式进行说明。本实施方式的骨髓干细胞的诱导方法是通过所述骨髓干细胞的诱导剂对骨髓干细胞进行诱导的方法。
骨髓干细胞包含在骨髓组织中,而且能够在骨髓组织内分化或随着血液流动从骨髓组织向其他的体内组织移动。
作为所述骨髓干细胞,可列举能向软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞等中胚叶性组织的细胞分化的骨髓间叶系干细胞;和能向红血球、白血球等血液细胞分化的造血干细胞等。
即使对于所述骨髓干细胞中的骨髓间叶系干细胞来说,不仅能够向中胚叶性组织的细胞分化,还能够向神经等外胚叶性组织、肝脏等内胚叶性组织的细胞分化。作为本发明的诱导方法中被诱导的骨髓干细胞,在被诱导后能够向更多样的细胞分化这点,优选骨髓间叶系干细胞。
所述骨髓干细胞的诱导方法中,例如,能够在生物体外或在生物体内通过所述骨髓干细胞的诱导剂对骨髓干细胞进行诱导。
具体来说,对于在生物体外进行的骨髓干细胞的诱导方法来说,例如,利用具有薄膜(膜)的装置,该薄膜具有在厚度方向上贯穿的微细孔,在薄膜的一侧配置骨髓干细胞,在另一侧配置所述骨髓干细胞的诱导剂,能够在规定时间内实施将骨髓干细胞向薄膜的另一侧诱导的方法等。
另外,对于在生物体外进行的骨髓干细胞的诱导方法来说,例如,挖取在载玻片上接种的骨髓干细胞的一部分,向挖取的部分涂布包含骨髓干细胞的诱导剂的培养基并在骨髓干细胞的培养条件下放置,由此,能够实施将骨髓干细胞向挖取的部分诱导的方法等。
对于这样的在生物体外进行的骨髓干细胞的诱导方法来说,由于能够比较简单地实施,所以,例如,能够以决定后述的在生物体中进行的骨髓干细胞诱导方法的诱导剂最佳浓度为目的作为预备实验进行实施。
此外,如上所述的骨髓干细胞的诱导方法中的骨髓干细胞的诱导程度能够通过对骨髓干细胞进行染色,并测定染色度来进行评价。另外,还能够通过目视所诱导的骨髓干细胞进行确认而进行评价。
另一方面,对于生物体内进行的骨髓干细胞的诱导方法来说,能够实施以下方法等,即例如,将包含所述骨髓干细胞的诱导剂的水性凝胶埋入通常的小鼠的皮下,然后将小鼠的骨髓干细胞注入该小鼠的静脉,将小鼠饲养规定时间,由此,将骨髓干细胞向水性凝胶诱导。
另外,对于在生物体内进行的骨髓干细胞的诱导方法来说,能够实施以下方法等,即例如,将小鼠的骨髓干细胞移植到创伤模型小鼠的骨髓中,并且在该小鼠的创伤部位涂布所述骨髓干细胞的诱导剂,由此,能够向创伤部位诱导骨髓干细胞。
此外,对于如上所述的骨髓干细胞的诱导方法中的骨髓干细胞的诱导程度,作为骨髓干细胞,可利用可表达绿色荧光蛋白质(GreenFluorescent Protein,以下也称作GFP)的小鼠的骨髓干细胞,并通过对所诱导的骨髓干细胞中的荧光强度进行测定来评价。
而且,对于在生物体内进行的骨髓干细胞的诱导方法来说,能够实施以下方法等,即例如,实施使规定的体内组织含有骨髓干细胞的诱导剂的处理,并向该体内组织诱导骨髓干细胞。更具体地说,在生物体内进行的骨髓干细胞的诱导方法中,能够实施以下方法等,即例如,通过在皮肤的表皮组织(角质层等)上涂布所述骨髓干细胞的诱导剂等而使其含有诱导剂,从而将血液中存在的骨髓间叶系干细胞向表皮组织诱导。
此外,在生物体内进行的诱导方法中,作为骨髓干细胞被诱导而得到的体内组织,除了表皮组织以外,能够列举肌肉组织、软骨组织、肝脏组织等各种组织。
生物体中进行的骨髓干细胞的诱导方法以下述目的实施:例如,在使骨髓干细胞向各种组织细胞分化前,使骨髓干细胞向该组织聚集。
所述骨髓干细胞的诱导方法能够在作为人的生物体或人以外的动物的生物体内实施。优选地,所述骨髓干细胞的诱导方法在作为人的生物体中,以例如美容的目的非治疗性地实施。
所述骨髓干细胞的诱导方法中,可使用所述肉桂鞣质B1或所述五没食子酰基葡萄糖被稀释成适当浓度后的诱导剂。作为用于稀释的液体,没有特别限定,可使用例如水、生理盐水、骨髓干细胞的培养液等。
例如,含有所述肉桂鞣质B1的骨髓干细胞的诱导剂优选地使用1~100μg/mL的肉桂鞣质B1浓度,更优选地使用10~40μg/mL的肉桂鞣质B1浓度。
另外,例如,含有所述五没食子酰基葡萄糖的骨髓干细胞的诱导剂优选地使用0.01~1000μg/mL的五没食子酰基葡萄糖浓度,更优选地使用0.94~94μg/mL的五没食子酰基葡萄糖浓度。
本实施方式的骨髓干细胞的诱导剂及骨髓干细胞的诱导方法如上述例示,但本发明不限定于上述例示的骨髓干细胞的诱导剂及骨髓干细胞的诱导方法。另外,本发明中,能够在不损害本发明效果的范围内采用一般的骨髓干细胞的诱导剂及在骨髓干细胞的诱导方法中所采用的各种方式。
【实施例】
接下来,列举实施例进一步详细说明本发明,但本发明不限于这些实施例。
(实施例1)
使肉桂鞣质B1(ENZO公司制,型号为“ALX-350-365-M005”)溶解于溶剂(达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基DMEM),以使其浓度成为10μg/mL,由此制造包含肉桂鞣质B1的诱导剂。
(实施例2)
除了使肉桂鞣质B1的浓度为20μg/mL的浓度这点以外,与实施例1同样地制造诱导剂。
(实施例3)
除了使肉桂鞣质B1的浓度为40μg/mL的浓度这点以外,与实施例1同样地制造诱导剂。
(实施例4)
使五没食子酰基葡萄糖(SIGMA-ALDRICH公司制、型号为“G7548”)溶解于溶剂(DMEM),以使其浓度成为94ng/mL,制造含有五没食子酰基葡萄糖的诱导剂。
(实施例5)
除了使五没食子酰基葡萄糖的浓度成为0.94μg/mL的浓度这点以外,与实施例4同样地制造诱导剂。
(实施例6)
除了使五没食子酰基葡萄糖的浓度成为9.4μg/mL的浓度这点以外,与实施例4同样地制造诱导剂。
(实施例7)
除了使五没食子酰基葡萄糖的浓度成为94μg/mL的浓度这点以外,与实施例4同样地制造诱导剂。
使用各实施例制造的骨髓干细胞的诱导剂,进行基于生物体外的细胞诱导试验的评价。图1示意地表示该评价方法的方式。以下,参照图1说明评价方法的细节。
<生物体外的细胞诱导试验>
作为试验用样本准备各实施例的骨髓干细胞的诱导剂。并相对于试验用样本准备阴性对照样本及阳性对照样本。
下述中,FBS表示胎牛血清。另外,P/S表示100单位青霉素及0.1mg/mL链霉素。另外,(-)的标记表示不包含的情况。
作为阴性对照样本,准备DMEM(达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基)“FBS(-)、P/S(-)”。即,准备既不包含FBS也不包含P/S的DMEM。
另外,作为阳性对照样本,准备PDGF-BB(血小板源性生长因子PEPRO TECH公司制)浓度为20ng/mL的DMEM溶液。即,准备一种通过用DMEM稀释而使PDGF-BB的浓度成为20ng/mL的溶液。
另一方面,使小鼠骨髓间叶系干细胞(以下,还称作mMSC)培养到铺满并回收,以使该干细胞成为1×107细胞/ml的方式在液体中悬浮,由此准备细胞悬浊液。作为用于使细胞悬浮的液体,使用10容量%的FBS/DMEM“P/S(-)”。即,作为该液体,使用以DMEM稀释至FBS成为10容量%浓度的、不含有P/S的液体。
接下来,准备博伊登室B(Neuro Probe公司制),该博伊登室B具有多个独立的区域(well),如图1(a)所示,所述区域通过薄膜M被分隔成上部区域P和下部区域Q。设定条件,以使各试验用样本中的任一种和阴性对照样本及阳性对照样本能够在同一个博伊登室B中进行试验,将各样本分别在该博伊登室B的各下部区域中各涂布28μL。此外,作为博伊登室B的薄膜M,使用商品名为“PolycarbonateMembranes”(Neuro Probe公司制细孔尺寸为8μm)的薄膜。
接下来,向上部区域P各接种50μL的上述细胞悬浊液,在37℃、5%CO2的条件下进行四小时的培养(参照图1(b))。
四小时培养后,如图1(c)所示,通过附属的过滤器刷R剥取不移动的mMSC。然后,通过迪夫·快速染色(使用Sysmex公司制造的试剂盒)仅对向薄膜M的下侧移动的mMSC进行染色。
进而,将染色像数字化并读入计算机,为了成为黑和白二值化而以使被染色成蓝色的部分成为白色的方式对图像进行转换。然后,利用图像编辑软件(商品名为“PhotoShop”)的功能测定各区域范围内的辉度的平均值。通过对阴性对照样本以及阳性对照样本中的辉度和各试验用样本中的辉度进行比较,来评价骨髓干细胞的诱导剂的mMSC诱导活性。
通过辉度的图表将实施例1~3的诱导剂的评价结果表示在图2中。另外,将实施例4~7的诱导剂的评价结果同样地表示在图3中。
如从图2及图3所掌握的,实施例1、2、7的骨髓干细胞的诱导剂在骨髓干细胞的诱导性能方面尤其优秀。
<小鼠的生物体中的细胞诱导试验>
为了对骨髓干细胞的诱导剂在小鼠的生物体中诱导骨髓干细胞的性能进行评价,使用小鼠的生物体以如下方式进行实验。此外,在小鼠生物体中发生创伤后,骨髓干细胞能够随着血液流动聚集到创伤部分。而且,聚集到创伤部分的骨髓干细胞分泌细胞素,且聚集到创伤部分的骨髓干细胞向创伤部分的细胞分化,由此,能够治愈创伤。因此,通过在创伤部分涂布骨髓干细胞的诱导剂,可以预想骨髓干细胞被诱导至创伤部分,能够促进创伤的治愈。
(皮肤再生试验(创伤治愈试验)方法)
1.实验材料
1-a.动物
从日本CLEA公司购入六只C57BLKs/J-dbm系遗传性糖尿病小鼠(BKS.Cg-+Leprdb/+Leprdb/Jcl*、db/db小鼠、雌性(メス)、年龄为8周)。让小鼠自由摄取自来水和固体饲料并对小鼠预备饲养一周以上,然后,将年龄为9周的小鼠提供给试验。
1-b.创伤覆盖剂
·聚氨酯制膜敷料:产品名为“3M Tegaterm透明敷料1620”6cm×7cm(住友3M公司制)
1-c.伸缩性包带:产品名“Silkytex”(ALCARE公司制)
1-d.被检验物质
·碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)曲弗明-阳性对照
产品名“Fiblast Spray250”(科研制药公司制)
浓度100μg/mL
·磷酸缓冲生理盐水(PBS)-阴性对照
·肉桂鞣质B1(浓度120μg/mL、浓度40μg/mL)PBS溶液
2.方法
2-a.皮肤全层缺损创伤的制作
对小鼠进行的处置均在吸入异氟烷的麻醉下进行。创伤制作的前一天利用电推子和电动剃刀对小鼠剪毛。
用消毒用乙醇对背部皮肤进行擦洗,利用外科用剪刀在背部中央部制作圆形(φ1.5cm)的皮肤全层缺损创伤。
2-b.被检验物质的给药
皮肤切除后,将bFGF(曲弗明)、PBS或肉桂鞣质B1对每个创面的部位滴入给药20μL。针对每一个给药组使用三只进行给药。
给药后,通过上述聚氨酯制膜敷料密封创面,并从其上卷绕上述伸缩性包带。覆盖剂的更换以及被检验物质的给药以每周三次实施四周。然后,直到创伤制作大概60天后,每周进行一次覆盖剂的更换。在形成上皮后,不进行覆盖剂的粘贴。
2-c.观察
·创伤面积测定:每周三次、在四周期间对背部进行照片拍摄,将图像读入PC,通过图像解析软件(产品名“Image J”)对创伤的面积进行测定。然后,直到创伤制作大概60天后,对创伤的面积进行每周一次的测定。
将上述小鼠的生物体中的创伤面积测定结果表示在图4中。
如从图4能够掌握的,认为通过含有肉桂鞣质B1的骨髓干细胞的诱导剂,骨髓干细胞被诱导至创伤部分,能够促进创伤的治愈。
如以上所述,本发明的骨髓干细胞的诱导剂及骨髓干细胞的诱导方法在骨髓干细胞的诱导性能方面能够发挥优异的效果。
工业上的利用可能性
本发明的骨髓干细胞的诱导剂及骨髓干细胞的诱导方法用于例如在规定的体内组织中使骨髓干细胞分化前,将通过骨髓生成的骨髓干细胞向规定的体内组织诱导。即,本发明的骨髓干细胞的诱导剂及骨髓干细胞的诱导方法适合以如下目的进行使用,即例如,通过进行使规定的体内组织含有诱导剂的处置,将随着血液流动而在体内循环的骨髓干细胞诱导至该体内组织并使其聚集。
附图标记的说明
B:博伊登室,P:上部区域,Q:下部区域,M:薄膜,R:过滤器刷。
Claims (2)
1.一种骨髓干细胞的诱导剂,其特征在于,包含肉桂鞣质B1及五没食子酰基葡萄糖中的至少一种。
2.一种骨髓干细胞的诱导方法,其特征在于,通过包含肉桂鞣质B1及五没食子酰基葡萄糖中的至少一种的骨髓干细胞的诱导剂对骨髓干细胞进行诱导。
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