CN104387482A - 一种羧甲基茯苓多糖的制备方法及其新用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种羧甲基茯苓多糖的制备方法及其新用途。该方法在对茯苓多糖进行羧甲基化修饰的工艺中，通过改变反应介质的组成及比例，调节反应温度，同时采用催化剂技术，显著提高了茯苓多糖羧甲基化效率，提高了原辅料的利用率，节约了成本。与此同时，利用本发明所提供的羧甲基茯苓多糖在制备畜禽免疫增强剂中的新用途可以显著提升畜、禽在应对病原微生物时的免疫力，提升疫苗免疫效力；利用本发明所提供的羧甲基茯苓多糖作为饲料添加剂的新用途可以有效提升畜禽产肉性能。

Description

一种羧甲基茯苓多糖的制备方法及其新用途

技术领域

本发明涉及天然药物化学技术领域，具体涉及一种羧甲基茯苓多糖的制备方法及其新用途。

背景技术

茯苓[Poria cocos(Schw.)Wolf]是一种食药用真菌，是中药“四君八珍”之一，具有利水渗湿，健脾宁心之功效，现代医学研究更进一步证明茯苓具有抗肿瘤、利水消肿、增强免疫、镇定安神和抑菌等多种作用。茯苓中含有多种化学成分，其中最主要的是茯苓多糖，其含量可达茯苓干重的84％。茯苓多糖分子量分布较广，大分子量的可达100万道尔顿，小分子量的在5000～9000道尔顿之间均有分布。茯苓多糖易溶于中、强碱溶液中，难溶于水，其主体结构为β-(1-3)结合的葡萄糖线性结构，同时还具有β-(1-6)结合的葡萄糖基支链的结构。现代科学研究表明，未经化学改性的茯苓多糖没有抗肿瘤活性及免疫增强的功能，茯苓多糖在水溶液中的提取率不超过1％，大部分被当成药渣弃去，造成严重的浪费。

化学改性已成为提高天然多糖生物活性的重要手段：引入合适的离子基团能够显著改善水溶性，同时通过改变多糖在水溶液中的链构象提高其活性；不同的取代基团、取代位置和取代度对多糖衍生物的活性有重要影响，其活性的高低与引入的不同取代离子基团、取代度、取代位、水溶性、分子量和链的构象有关。茯苓多糖难溶于水，为了改善其水溶性，提高生物活性，充分发挥其生理功效,可以采用硫酸酯化(Sulfation)、羧甲基化(Carboxymethylation)、羟乙基化(Hydroxyeth—ylation)、羟丙基化(Hydroxypropylation)及甲基化(Methylation)等半合成衍生化方法对茯苓多糖进行化学改性来增大其溶解度、提高生物活性，取代程度越高，在水中的溶解度就越大，生物利用度越高，生物活性则越强。

Gamuro等人(1971年)采用异丙醇与水为介质，在液固相振荡条件下合成制取羧甲基茯苓多糖，因需大型振荡设备，难以进行工业化生产，且需要大量的有机溶剂(如乙醚，甲醇、异丙酮、醋酸和乙醇)对羧甲基茯苓多糖进行后处理及纯化，不仅生产成本较高，还造成环境污染。

20世纪八九十年代以来，国内研究者如石清东、陈春霞、张金蓱等人均以乙醇与水的混合液为介质，采用液固相搅拌条件下取代制取羧甲基茯苓多糖。虽然在设备和反应介质上有了很大的提升，但是反应的持续时间过长，一般都需要四五十个小时，效率低下。

同时，目前关于羧甲基茯苓多糖的应用研究，仅涉及人药的抗肿瘤应用，对于其他功效及应用未见相关报道。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种制备羧甲基茯苓多糖的方法，以实现提高茯苓多糖羧甲基化效率、缩短反应时间，所获得产物的取代度更高、水溶性更好等技术目的。

同时本发明旨在挖掘羧甲基茯苓多糖其他功效特征，进而拓展其新用途。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种制备羧甲基茯苓多糖的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)取茯苓菌核进行干燥、粉碎，得到茯苓微粉；

2)取醇类溶剂和水混合，得到水醇混合液；

3)向步骤2)得到的水醇混合液中加入步骤1)得到的茯苓微粉、第一NaOH，充分搅拌，得到茯苓多糖提取液；

4)取第二NaOH加入到氯乙酸中反应，得到氯乙酸碱化液；

5)将步骤4)得到的氯乙酸碱化液加入到步骤3)得到的茯苓多糖提取液中，再加入催化剂，充分反应，而后调溶液pH至中性，收集固相；

上述催化剂选自聚乙二醇、链状聚乙二醇二烷基醚、苄基三乙基氯化铵、四丁基溴化铵的其中一种或几种的组合。

优选的，步骤5)所述反应是在搅拌条件下进行的。

优选的，步骤5)所述催化剂的用量是所述茯苓微粉用量的10～20％(w/w)。

优选的，步骤5)所述反应的温度为50～80℃，更优的为65～75℃。

优选的，步骤5)所述反应的时间为3～6h，更优的为4～5h。

优选的，步骤3)具体为：先向步骤2)得到的水醇混合液中加入步骤1)得到的茯苓微粉，搅拌均匀，而后再加入第一NaOH，充分搅拌，得到茯苓多糖提取液。

优选的，所述第一NaOH、第二NaOH二者总量与所述茯苓微粉用量的比值为(0.3～0.5):1(w/w)。进一步优选的：所述第一NaOH与茯苓微粉用量的比值为(0.12～0.2):1；所述第二NaOH与茯苓微粉用量的比值为(0.18～0.3):1。

优选的，所述茯苓微粉与所述氯乙酸的用量比值为3.8～4.762(w/w)。

优选的，所述茯苓微粉、第一NaOH、第二NaOH、氯乙酸总量与所述水醇混合液用量的比值为1:(4～8)(w/w)。

优选的，所述水醇混合液中水与醇类溶剂的用量比值为1:(4～19)(v/v)。

优选的，所述醇类溶剂选自异丙醇、乙醇、乙二醇、丙醇、丙三醇、苯甲醇的任一种或几种的组合。

优选的，步骤3)所述的充分搅拌是搅拌1～5h，更优的为2～3h。

优选的，步骤4)所述反应的时间为1～5h，更优的为2～3h。

优选的，还包括步骤6)，所述步骤6)为：对步骤5)得到的固相用无水乙醇充分洗涤，收集固相，干燥。

同时本发明提供了羧甲基茯苓多糖在制备畜禽免疫增强剂中的应用；所述免疫增强剂包括以口服或注射等方式施加的用于改善畜禽免疫力的物质，也包括以疫苗佐剂形式存在的用于提升疫苗注射后机体免疫效果的物质。

同时本发明提供了羧甲基茯苓多糖作为畜禽饲料添加剂的应用。

同时本发明提供了羧甲基茯苓多糖在制备疫苗免疫增强剂中的应用，在此基础上可以进行如下优选：所述疫苗为猪伪狂犬病疫苗；所述疫苗为马立克氏病疫苗。

本发明对茯苓多糖进行了羧甲基化修饰，通过改变反应介质的组成及比例，调节反应温度，同时采用催化剂技术，显著提高了茯苓多糖羧甲基化效率，提高了原辅料的利用率，节约了成本。本发明选用中药茯苓为原料制备羧甲基茯苓多糖，茯苓药材资源丰富，在南方各省均有分布，故价格低廉。本方法易于操作、工业上易于放大，利用本方法制备的羧甲基茯苓多糖取代度高，水溶性好，反应时间短，消耗水和有机溶剂少，反应工艺较简单，安全系数高。

本发明在研究中发现参加反应的碱液应当是非KOH的强碱，因为若选用KOH则在后续纯化过程中会出现因难以去除残留KOH而无法保证产品质量的问题，进而选用NaOH用于反应。对催化剂的选择充分考虑了多种方案，最终选定了上述四种催化剂用于反应，上述催化剂的作用包括增溶、助溶或相转移催化等。在优选技术方案中：具体限定催化剂的加入量或反应条件是综合考量实验效果而得到的较佳条件。具体限定两次NaOH各自加入量是在大量实验基础上确定的，通过上述优选的加入量可以对产率起到进一步的提升效果。

与此同时，利用本发明所提供的羧甲基茯苓多糖在制备畜禽免疫增强剂中的新用途可以显著提升禽、畜在应对病原微生物时的免疫力，提升疫苗免疫效力；利用本发明所提供的羧甲基茯苓多糖作为饲料添加剂的新用途可以有效提升畜禽产肉性能。

附图说明

图1是本发明实施例15饲喂含CMP的饲料对肉仔鸡整体增重效率的影响图；

图2是本发明实施例15饲喂含CMP的饲料对肉仔鸡日增重效率的影响图；

图3是本发明实施例15饲喂含CMP的饲料对肉仔鸡日采食量的影响图；

图4是本发明实施例15饲喂含CMP的饲料对肉仔鸡料肉比的影响图。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。

以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。

除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的术语“第一”、“第二”等并不表示任何顺序、数量或重要性，而仅用于区别一种成分和另一种成分。

实施例1(羧甲基茯苓多糖的制备方法)

一种制备羧甲基茯苓多糖的方法，具体包括以下步骤：

取1000g茯苓菌核进行干燥、粉碎，得茯苓微粉；向6L，80％的苯甲醇溶液中加入茯苓微粉，搅拌均匀，加入150g氢氧化钠，搅拌1h，得茯苓多糖提取液；将150g氢氧化钠加入到氯乙酸中反应1h，得氯乙酸碱化液；将氯乙酸碱化液加入到茯苓多糖提取液中，向反应液中加入100g聚乙二醇，在50℃下充分搅拌3h进行取代反应，反应结束后，调溶液至中性，过滤收集沉淀，并用无水乙醇充分洗涤三次，过滤干燥，即得羧甲基茯苓多糖。

实施例2(羧甲基茯苓多糖的制备方法)

一种制备羧甲基茯苓多糖的方法，具体包括以下步骤：

取1000g茯苓菌核进行干燥、粉碎，得茯苓微粉；向13.7L，95％的丙三醇溶液中加入茯苓微粉，搅拌均匀，加入250g氢氧化钠，搅拌5h，得茯苓多糖提取液；将250g氢氧化钠加入到氯乙酸中反应5h，得氯乙酸碱化液；将氯乙酸碱化液加入到茯苓多糖提取液中，向反应液中加入200g苄基三乙基氯化铵，在80℃下充分搅拌6h进行取代反应，反应结束后，调溶液至中性，过滤收集沉淀，并用无水乙醇充分洗涤三次，过滤干燥，即得羧甲基茯苓多糖。

实施例3(羧甲基茯苓多糖的制备方法)

一种制备羧甲基茯苓多糖的方法，具体包括以下步骤：

取1000g茯苓菌核进行干燥、粉碎，得茯苓微粉；向10L，85％的丙醇溶液中加入茯苓微粉，搅拌均匀，加入200g氢氧化钠，搅拌3h，得茯苓多糖提取液；将200g氢氧化钠加入到氯乙酸中反应3h，得氯乙酸碱化液；将氯乙酸碱化液加入到茯苓多糖提取液中，向反应液中加入150g链状聚乙二醇二烷基醚，在65℃下充分搅拌4.5h进行取代反应，反应结束后，调溶液至中性，过滤收集沉淀，并用无水乙醇充分洗涤三次，过滤干燥，即得羧甲基茯苓多糖。

实施例4(羧甲基茯苓多糖的制备方法)

一种制备羧甲基茯苓多糖的方法，具体包括以下步骤：

取1000g茯苓菌核进行干燥、粉碎，得茯苓微粉；向8L，90％的乙二醇溶液中加入茯苓微粉，搅拌均匀，加入200g氢氧化钠，搅拌2h，得茯苓多糖提取液；将200g氢氧化钠加入到氯乙酸中反应2h，得氯乙酸碱化液；将氯乙酸碱化液加入到茯苓多糖提取液中，向反应液中加入120g聚乙二醇，在75℃下充分搅拌4h进行取代反应，反应结束后，调溶液至中性，过滤收集沉淀，并用无水乙醇充分洗涤三次，过滤干燥，即得羧甲基茯苓多糖。

实施例5(羧甲基茯苓多糖的制备方法)

一种制备羧甲基茯苓多糖的方法，具体包括以下步骤：

1)取茯苓菌核进行干燥、粉碎，得到茯苓微粉；

2)取醇类溶剂与水以11:1(v/v)混合，得到水醇混合液；

3)向步骤2)得到的水醇混合液中加入步骤1)得到的茯苓微粉、第一NaOH，搅拌3h，得到茯苓多糖提取液；

4)取第二NaOH加入到氯乙酸中反应3h，得到氯乙酸碱化液，所述氯乙酸的用量满足以下条件：茯苓微粉与氯乙酸的用量比值为4(w/w)；

5)将步骤4)得到的氯乙酸碱化液加入到步骤3)得到的茯苓多糖提取液中，再加入催化剂，充分反应，而后调溶液pH至7.5，收集固相；

上述第一NaOH、第二NaOH二者总量与所述茯苓微粉用量的比值为0.4:1(w/w)；

上述茯苓微粉、第一NaOH、第二NaOH、氯乙酸总量与所述水醇混合液用量的比值为1:6(w/w)；

上述催化剂为四丁基溴化铵。

实施例6(羧甲基茯苓多糖的制备方法)

一种制备羧甲基茯苓多糖的方法，具体包括以下步骤：

1)取茯苓菌核进行干燥、粉碎，得到茯苓微粉；

2)取醇类溶剂与水以11:1(v/v)混合，得到水醇混合液；

3)向步骤2)得到的水醇混合液中加入步骤1)得到的茯苓微粉、第一NaOH，搅拌3h，得到茯苓多糖提取液；

4)取第二NaOH加入到氯乙酸中反应3h，得到氯乙酸碱化液，所述氯乙酸的用量满足以下条件：茯苓微粉与氯乙酸的用量比值为4(w/w)；

5)将步骤4)得到的氯乙酸碱化液加入到步骤3)得到的茯苓多糖提取液中，再加入催化剂，充分反应，而后调溶液pH至7.5，收集固相；

上述第一NaOH、第二NaOH二者总量与所述茯苓微粉用量的比值为0.4:1(w/w)；

上述茯苓微粉、第一NaOH、第二NaOH、氯乙酸总量与所述水醇混合液用量的比值为1:6(w/w)；

上述催化剂为四丁基溴化铵和聚乙二醇的组合。

在此基础上，步骤5)所述催化剂的用量是所述茯苓微粉用量的15％(w/w)。

步骤5)所述反应的温度为65℃。

步骤5)所述反应的时间为4.5h。

步骤3)第一NaOH与所述茯苓微粉用量的比值为0.16:1(w/w)。

步骤4)第二NaOH与所述茯苓微粉用量的比值为0.24:1(w/w)。

步骤3)具体为：先向步骤2)得到的水醇混合液中加入步骤1)得到的茯苓微粉，搅拌均匀，而后再加入第一NaOH，充分搅拌，得到茯苓多糖提取液。

所述醇类溶剂选自异丙醇、乙二醇的组合。

还包括步骤6)，所述步骤6)为：对步骤5)得到的固相用无水乙醇充分洗涤，收集固相，干燥。

实施例7(羧甲基茯苓多糖的制备方法)

一种制备羧甲基茯苓多糖的方法，具体包括以下步骤：

1)取茯苓菌核进行干燥、粉碎，得到茯苓微粉；

2)取醇类溶剂与水以4:1(v/v)混合，得到水醇混合液；

3)向步骤2)得到的水醇混合液中加入步骤1)得到的茯苓微粉、第一NaOH，搅拌1h，得到茯苓多糖提取液；

4)取第二NaOH加入到氯乙酸中反应1h，得到氯乙酸碱化液，所述氯乙酸的用量满足以下条件：茯苓微粉与氯乙酸的用量比值为3.8(w/w)；

5)将步骤4)得到的氯乙酸碱化液加入到步骤3)得到的茯苓多糖提取液中，再加入催化剂，充分反应，而后调溶液pH至7，收集固相；

上述第一NaOH、第二NaOH二者总量与所述茯苓微粉用量的比值为0.3:1(w/w)；

上述茯苓微粉、第一NaOH、第二NaOH、氯乙酸总量与所述水醇混合液用量的比值为1:4(w/w)；

上述催化剂为链状聚乙二醇二烷基醚。

步骤5)所述催化剂的用量是所述茯苓微粉用量的10％(w/w)。

步骤5)所述反应的温度为50℃。

步骤5)所述反应的时间为3h。

步骤3)第一NaOH与所述茯苓微粉用量的比值为0.12:1(w/w)。

步骤4)第二NaOH与所述茯苓微粉用量的比值为0.18:1(w/w)。

步骤3)具体为：先向步骤2)得到的水醇混合液中加入步骤1)得到的茯苓微粉，搅拌均匀，而后再加入第一NaOH，充分搅拌，得到茯苓多糖提取液。

所述醇类溶剂选自苯甲醇。

实施例8(羧甲基茯苓多糖的制备方法)

一种制备羧甲基茯苓多糖的方法，具体包括以下步骤：

1)取茯苓菌核进行干燥、粉碎，得到茯苓微粉；

2)取醇类溶剂与水以19:1(v/v)混合，得到水醇混合液；

3)向步骤2)得到的水醇混合液中加入步骤1)得到的茯苓微粉、第一NaOH，搅拌5h，得到茯苓多糖提取液；

4)取第二NaOH加入到氯乙酸中反应5h，得到氯乙酸碱化液，所述氯乙酸的用量满足以下条件：茯苓微粉与氯乙酸的用量比值为4.762(w/w)；

5)将步骤4)得到的氯乙酸碱化液加入到步骤3)得到的茯苓多糖提取液中，再加入催化剂，充分反应，而后调溶液pH至6.5，收集固相；

上述第一NaOH、第二NaOH二者总量与所述茯苓微粉用量的比值为0.5:1(w/w)；

上述茯苓微粉、第一NaOH、第二NaOH、氯乙酸总量与所述水醇混合液用量的比值为1:8(w/w)；

上述催化剂选自四丁基溴化铵和苄基三乙基氯化铵的组合。

步骤5)所述催化剂的用量是所述茯苓微粉用量的20％(w/w)。

步骤5)所述反应的温度为80℃。

步骤5)所述反应的时间为6h。

步骤3)第一NaOH与所述茯苓微粉用量的比值为0.2:1(w/w)。

步骤4)第二NaOH与所述茯苓微粉用量的比值为0.3:1(w/w)。

所述醇类溶剂选自异丙醇、乙醇、乙二醇、丙醇、丙三醇、苯甲醇的组合。

以上实施例1～8方法制备的羧甲基茯苓多糖产率及含量如表1所示：

表1实施例1～8方法制备的羧甲基茯苓多糖产率及含量

方法	羧甲基茯苓多糖产率(％)	羧甲基茯苓多糖含量(％)
			实施例1	71.2	66.7
实施例2	84.6	78.4

实施例3	83.9	80.0
			实施例4	82.8	77.6
实施例5	81.5	79.4
			实施例6	83.2	80.7
实施例7	82.3	78.6
			实施例8	84.1	78.3

实施例9(羧甲基茯苓多糖的制剂类别及方法)

以实施例3制备的产物为原料，参照药典的制剂通则要求，将羧甲基茯苓多糖制成口服液、粉剂、颗粒剂、注射液和粉针剂，具体操作步骤如下：

羧甲基茯苓多糖口服液：取5kg羧甲基茯苓多糖，溶于80L纯化水中，加入2kg柠檬酸钠、200g山梨酸钾、200g苯甲酸钠，搅拌溶解后，用0.1mol/L的氢氧化钠溶液调pH至7～9，加纯化水定容至100L，即得含量为4％的羧甲基茯苓多糖口服液。

羧甲基茯苓多糖粉：取100kg羧甲基茯苓多糖、2kg山梨酸钾、0.5kg氢氧化钠、35kg微粉硅胶、35kg明胶，加入纯化水搅拌均匀，调溶液密度至1.08～1.16后，喷雾干燥，分装即得羧甲基茯苓多糖粉。

羧甲基茯苓多糖颗粒剂：取100kg羧甲基茯苓多糖，加入250L纯化水搅拌均匀后，再加入70kg微粉硅胶和0.5kg氢氧化钠，搅拌混匀，制成软材，软材挤压过1号筛制成颗粒，50℃下进行干燥，整粒后烘干即得羧甲基茯苓多糖颗粒。

羧甲基茯苓多糖注射液：取1.25kg羧甲基茯苓多糖，溶于80L注射用水中，透析48h后，加入3％活性炭煮沸10min，冷却后抽滤，用0.1mol/L的氢氧化钠溶液调pH至7～9，加注射用水至100L，过0.22微米微孔滤膜，灌装、密封后121℃高压蒸汽灭菌30min，即得含量为1％的羧甲基茯苓多糖注射液。

羧甲基茯苓多糖粉针剂：取1.25kg羧甲基茯苓多糖，溶于10L注射用水中，透析48h，反渗透膜过滤后加入3％活性炭煮沸10min，冷却后抽滤，用0.1mol/L的氢氧化钠溶液调pH至7～9，121℃高压蒸汽灭菌30min，0.22微米微孔滤膜滤过，滤液真空干燥至4L，100ml瓶中灌装4ml药液，冷冻干燥，密封后即得羧甲基茯苓多糖粉针剂。

实施例10(羧甲基茯苓多糖对低免小鼠免疫系统的影响)

1、试验方法

昆明种小鼠，雌雄各半，体重18～22g，随机分为3组，分别为：空白、模型、羧甲基茯苓多糖给药组，每组10只。正常组、模型组每日腹腔注射生理盐水0.5ml/只，羧甲基茯苓多糖组每日腹腔注射羧甲基茯苓多糖注射液0.5ml/只。连续给药7天，其中模型组和羧甲基茯苓多糖给药组，于给药第3天腹腔注射氢化可的松(50mg/kg)，建立低免模型，空白组给予等量生理盐水。试验第8天，摘眼球取血，分离血清，进行免疫因子测定，同时测定脾脏指数级胸腺指数。

2、试验结果

表2各组脏器指数的比较

注：与空白组比*p<0.05,**p<0.01

表3各组血清中免疫因子的比较

注：与空白组比*p<0.05,**p<0.01

羧甲基茯苓多糖组脏器指数及血清中免疫因子与空白组无差异,而模型组则显著低于空白组。试验结果表明：羧甲基茯苓多糖具有极其显著的免疫调节作用，能将低免小鼠机体的免疫力恢复至正常水平。

实施例11(羧甲基茯苓多糖对鸡法氏囊病的影响)

1、预防给药方案

试验分空白对照组、模型对照组、羧甲基茯苓多糖口服液组、黄芪多糖口服液组共四组，选择1日龄雏鸡120只，随机分成4组，每组30只。各组采取严格隔离措施，分开后按常规方法饲养，自由采食饮水，24h光照，饲养管理水平一致。

18日龄时开始预防饮水给药,200ml兑300kg水，空白组、模型组不给药。除空白组外，20日龄直接灌服法氏囊病毒，进行人工攻毒，23日龄停止用药，饲养至45日龄，扑杀所有活鸡并剖检观察脏器的情况。记录整个养殖过程中鸡群的发病情况和死亡情况。试验结果见表4。

表4预防方案试验结果

注：aa表示与空白组比p<0.01；a表示与空白组比p<0.05；bb表示与模型组比p<0.01。

2、治疗给药方案

试验分空白对照组、模型对照组、羧甲基茯苓多糖注射液组、黄芪多糖注射液组共四组，选择1日龄雏鸡120只，随机分成4组，每组30只。各组采取严格隔离措施，分开后按常规方法饲养，自由采食饮水，24h光照，饲养管理水平一致。

除空白组外，20日龄直接灌服法氏囊病毒，进行人工攻毒，攻毒后6h开始肌肉注射给药，给药组每1kg体重注射2ml对应的药液，空白对照及模型对照组给予同一剂量的生理盐水，连续给药3天。饲养至30日龄，扑杀所有活鸡并剖检观察脏器的情况，计算法氏囊的脏器指数。记录整个养殖过程中鸡群的发病情况和死亡情况。试验结果见表5。

表5治疗方案试验结果

注：aa表示与空白组比p<0.01；a表示与空白组比p<0.05；bb表示与模型组比p<0.01。

羧甲基茯苓多糖预防用药时，能大大降低鸡群的发病率，鸡群法氏囊脏器指数与空白组无差异。而在治疗给药时，羧甲基茯苓多糖能显著提高鸡群的存活率，鸡群法氏囊脏器指数小于空白组，但是远远大于模型组。试验结果表明：羧甲基茯苓多糖预防给药，能够有效的防止鸡群感染传染性法氏囊病毒；而羧甲基茯苓多糖治疗给药时，能够有效的治疗鸡传染性法氏囊病，保护法氏囊，减小病毒对法氏囊脏器的损害，抵抗病原微生物对机体的侵害。

实施例12(羧甲基茯苓多糖对猪大肠杆菌病的影响)

1、试验方法

选取18～20日龄的健康仔猪30头，体重3.5～5.5kg，随机分为3组，每组10头，分别为空白对照组、模型对照组、羧甲基茯苓多糖颗粒剂组。空白组与模型组给以正常饲料，羧甲基茯苓多糖颗粒剂组给以混有羧甲基茯苓多糖颗粒的饲料，每1kg羧甲基茯苓多糖颗粒混400kg饲料。饲养4天后，除空白组外，均口服大肠杆菌菌液，人工染毒，并继续给药4天。感染后观察各试验猪的精神、采食、饮水、粪便、呼吸、体温等临床变化，对病死猪进行解剖，观察病理变化。

2、试验结果

表6羧甲基茯苓多糖对猪大肠杆菌病的影响效果

类别	空白组	模型组	羧甲基茯苓多糖颗粒剂组
				动物数(只)	10	10	10
发病数(只)	0	10	4
				发病率(％)	0	100	40
死亡数(只)	0	8	1
				存活率(％)	100	20	90

上述试验结果表明：羧甲基茯苓多糖能有效的预防仔猪大肠杆菌的发病，抵抗大肠杆菌的侵害。

实施例13(羧甲基茯苓多糖对猪伪狂犬活疫苗免疫效果的影响)

选择健康的无猪伪狂犬病毒抗体的20～25kg的仔猪30头，随机分为3组，每组10头，一组注射用1％羧甲基茯苓多糖注射液稀释的猪伪狂犬病活疫苗，每头1ml；一组注射用生理盐水稀释的猪伪狂犬病活疫苗，每头1ml；一组注射生理盐水，每头1ml。分别于免疫后13、20、27天检测各组猪伪狂犬病毒抗体，结果见下表7：

表7羧甲基茯苓多糖对猪伪狂犬活疫苗免疫效果影响试验结果(Mean±SD)

注：表中同一列比较，肩标不同小写字母表示差异显著p<0.05，肩标不同大写字母表示差异极显著p<0.01，没有肩标表示差异不显著p>0.05。

表7结果显示：免疫后第13、20d，羧甲基茯苓多糖疫苗组血清中猪伪狂犬病毒抗体含量显著高于疫苗组(p<0.05)，极显著的高于生理盐水组(p<0.01)

实施例14(羧甲基茯苓多糖对马立克氏病活疫苗免疫效果的影响)

1、临用前将羧甲基茯苓多糖粉针剂用生理盐水溶解稀释。

2、将商品马立克氏病活疫苗用溶解后的羧甲基茯苓多糖粉针剂和生理盐水分别稀释成每羽份0.25ml。

3、将1日龄雏鸡60羽，随机分成三组，每组20羽，分别为：羧甲基茯苓多糖疫苗组、生理盐水疫苗组、生理盐水组。1日龄分别于鸡颈背部皮下注射相应的疫苗或试剂0.2ml。于免疫后第7天、14天、21天，随机抽取10羽鸡翼下取血，测定血清中抗体效价，结果以log2的几何平均值表示，结果见下表8：

表8羧甲基茯苓多糖对马立克氏病活疫苗免疫效果影响试验结果(Mean±SD)

组别	7天	14天	21天
				羧甲基茯苓多糖疫苗组	2.89±0.21*#	4.56±0.66*#	9.55±1.01*#
疫苗组	2.21±0.46*	3.89±0.94*	8.7±1.11*
				生理盐水组	1.39±0.47	2.76±0.55	3.6±0.89

注：与生理盐水组比*P<0.01，与疫苗组比#P<0.01

表8结果显示：免疫后第7、14、21天，羧甲基茯苓多糖疫苗组马立克氏病的抗体显著高于疫苗组与生理盐水组。

实施例15(羧甲基茯苓多糖对肉仔鸡生产性能的影响)

1、试验方法

150只1日龄健康白羽肉仔鸡，随机分为3组，每组10只鸡，每只5个重复。第一组为对照组，饲养基础日粮；第二组为阳性对照组，饲养添加阿维拉霉素的日粮；第三组为羧甲基茯苓多糖粉组，饲喂添加羧甲基茯苓多糖粉的日粮(250g拌1吨料)。

分别在0、7、14、21、28、35、42d早晨对鸡只进行空腹称重，统计耗料量，计算平均日增重、平均日采食量和料重比。

2、试验结果

表9日粮中添加羧甲基茯苓多糖粉对肉仔鸡生长性能的影响

指标	对照组	阳性对照组	羧甲基茯苓多糖粉组
				初重(g)	125.20±4.52	125.15±4.71	125.31±4.48
末重(g)	2340.84±74.23	2344.46±68.41	2490.01±66.75
				日增重(g)	52.75±1.87	52.84±1.51	56.30±2.11
日采食量(g)	106.45±3.45	105.87±3.21	106.01±2.98
				料肉比	2.02±0.05	2.00±0.08	1.88±0.10

此外，如附图1所示，与对照组比，羧甲基茯苓多糖粉能显著提高肉仔鸡的体重；如附图2所示，与对照组比，羧甲基茯苓多糖粉能显著提高肉仔鸡的日增重；如附图3所示，与对照组比，羧甲基茯苓多糖粉对肉仔鸡日采食量无影响；如附图4所示，与对照组比，羧甲基茯苓多糖粉能显著降低肉仔鸡的料肉比。综上所述，肉仔鸡饲料中添加羧甲基茯苓多糖粉可增加日增重，降低料肉比，提高饲料转化率。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (13)

1.一种制备羧甲基茯苓多糖的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)取茯苓菌核进行干燥、粉碎，得到茯苓微粉；

2)取醇类溶剂与水以(4～19):1(v/v)混合，得到水醇混合液；

3)向步骤2)得到的水醇混合液中加入步骤1)得到的茯苓微粉、第一NaOH，搅拌1～5h，得到茯苓多糖提取液；

4)取第二NaOH加入到氯乙酸中反应1～5h，得到氯乙酸碱化液，所述氯乙酸的用量满足以下条件：茯苓微粉与氯乙酸的用量比值为3.8～4.762(w/w)；

5)将步骤4)得到的氯乙酸碱化液加入到步骤3)得到的茯苓多糖提取液中，再加入催化剂，充分反应，而后调溶液pH至中性，收集固相；

上述第一NaOH、第二NaOH二者总量与所述茯苓微粉用量的比值为(0.3～0.5):1(w/w)；

上述茯苓微粉、第一NaOH、第二NaOH、氯乙酸总量与所述水醇混合液用量的比值为1:(4～8)(w/w)；

上述催化剂选自聚乙二醇、链状聚乙二醇二烷基醚、苄基三乙基氯化铵、四丁基溴化铵的其中一种或几种的组合。

2.根据权利要求1所述的一种制备羧甲基茯苓多糖的方法，其特征在于步骤5)所述催化剂的用量是所述茯苓微粉用量的10～20％(w/w)。

3.根据权利要求1所述的一种制备羧甲基茯苓多糖的方法，其特征在于步骤5)所述反应的条件为：在50～80℃下反应3～6h。

4.根据权利要求1所述的一种制备羧甲基茯苓多糖的方法，其特征在于所述第一NaOH与茯苓微粉用量的比值为(0.12～0.2):1。

5.根据权利要求1所述的一种制备羧甲基茯苓多糖的方法，其特征在于所述第二NaOH与茯苓微粉用量的比值为(0.18～0.3):1。

6.根据权利要求1所述的一种制备羧甲基茯苓多糖的方法，其特征在于步骤3)具体为：先向步骤2)得到的水醇混合液中加入步骤1)得到的茯苓微粉，搅拌均匀，而后再加入第一NaOH，充分搅拌，得到茯苓多糖提取液。

7.根据权利要求1所述的一种制备羧甲基茯苓多糖的方法，其特征在于所述醇类溶剂选自异丙醇、乙醇、乙二醇、丙醇、丙三醇、苯甲醇的任一种或几种的组合。

8.根据权利要求1所述的一种制备羧甲基茯苓多糖的方法，其特征在于还包括步骤6)，所述步骤6)为：对步骤5)得到的固相用无水乙醇充分洗涤，收集固相，干燥。

9.羧甲基茯苓多糖在制备畜禽免疫增强剂中的应用。

10.羧甲基茯苓多糖作为畜禽饲料添加剂的应用。

11.羧甲基茯苓多糖在制备疫苗免疫增强剂中的应用。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于所述疫苗为猪伪狂犬病疫苗。

13.根据权利要求11所述的应用，其特征在于所述疫苗为马立克氏病疫苗。