CN104382751A - 一种发酵法直接合成细菌纤维素/生物防腐剂复合面膜的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种发酵法直接合成细菌纤维素/生物防腐剂复合面膜的方法，通过木葡糖酸醋杆菌的液态一步发酵法，直接得到与生物防腐剂复合并具有成品外形的面膜。具体制备步骤如下：木葡糖酸醋杆菌在液体培养基中静置发酵，当细菌纤维素膜形成一定厚度时，向发酵液中添加生物防腐剂(含纳他霉素、乳酸链球菌素、ε-聚赖氨酸)并继续发酵，得到细菌纤维素/生物防腐剂复合面膜初品，清洗后加入美容药物溶液。本发明面膜持水性强，保湿效果好；生物防腐剂抑菌效果好，安全性高；同时添加美容药物成分，使用后皮肤润泽，具有优良的美容功能。
Description
技术领域
本发明属于美容用品技术领域，涉及一种美容用品及其制作方法，尤其是一种发酵法直接合成细菌纤维素/生物防腐剂复合面膜的方法。
背景技术
面膜美容是现代流行的美容护肤方法之一，愈来愈受到人们的青睐。面膜中的主要成分是水和油，其次还添加了甘油、蛋白质、氨基酸以及维生素等成分以提高面膜的护肤美容效果。然而，这些物质的添加构成了微生物生长所需的碳源和氮源，使面膜极易受到霉菌和细菌等微生物的污染,出现变质、发霉、腐败等，导致产品质量下降。不但丧失了面膜的美容护肤功效，长期使用还会对皮肤造成损伤。为防止面膜受到微生物污染，确保产品的安全性，有必要在面膜中添加防腐剂。目前，面膜中最常用的是咪唑烷基脲、已内酰脲、异噻唑啉酮、尼泊金酯类等化学防腐剂。然而，这些化学防腐剂大多数对人体有一定毒性，存在安全隐患，同时也是引起皮肤过敏的主要原因之一。因此，选择安全高效的防腐体系成为一个日渐引起重视的问题。
良好的面膜防腐体系必须具有广泛的抗菌谱；有合适的油/水分配比；不干扰产品的色泽、气味及其它性质；具有极高的安全系数,低毒、无毒、无刺激、无过敏；使用方便,性价比高等优点。为有效防止面膜在有效期内的腐败变质及二次污染,采用复配防腐剂更具有优势。纳他霉素、乳酸链球菌素、ε-聚赖氨酸等生物防腐剂作为一类安全高效的天然防腐剂，具备上述条件。
细菌纤维素(Bacterial cellulose，简称BC)是由生长在液态含糖基质中的细菌产生的。为区分于植物纤维素，而被命名为“细菌纤维素”。细菌纤维素是由葡萄糖以β-1,4糖苷键连接而成的高分子聚合物，其化学纯度高，不含植物纤维中的半纤维素和木质素等杂质。除此之外，细菌纤维素还具有生物可降解性、极强的持水性和透水透气性、较高的弹性模量和抗张强度等优点。因此，细菌纤维素是一种理想的面膜材料。
据检索，发现以下相关文献和专利。
专利CN103190454A介绍了一种化妆品的生物防腐剂制备方法，其中含有壳聚糖、ε-聚赖氨酸、葡萄柚种子提取物三种组分。专利CN103040718A介绍了一种化妆品防腐组合物，其中含有凤眼莲提取物、乳酸链球菌素、丁香精油或丁香酚、肉桂精油或肉桂醛、百里香精油、无臭大蒜精油、茶多酚和壳聚糖。同时，考虑到精油类物质及植物提取物存在活性成分 易挥发、氧化变性等问题，专利将上述成分分别包裹于微胶囊中。专利CN203123074U介绍了一种抑菌保健面膜，在面膜内侧涂布一层壳聚糖纤维提取物。专利CN1872022A介绍了一种细菌纤维素凝胶面膜，将剪裁成面膜形状的细菌纤维素凝胶在药物中浸渍。专利CN102212208A介绍了一种细菌纤维素/透明质酸复合材料，采用戊二醛等交联剂，在细菌纤维素膜中交联一定量的透明质酸，得到的复合材料用于促愈敷料和美白自营养型面膜。上述专利中对面膜的防腐处理均是在得到面膜成品后，通过将面膜在防腐剂中浸渍处理实现的，使用的防腐剂对于细菌的抑制能力较好。
与现有专利公开文献相比，本发明专利申请的显著优点在于：第一，通过两步发酵法即得到与防腐剂复合的细菌纤维素面膜；第二，提出一种用于化妆品(特别是面膜)的复配防腐剂，其中的纳他霉素、乳酸链球菌素和ε-聚赖氨酸抗菌谱广，对细菌、真菌等微生物抑菌能力强，且安全高效，稳定性高，不易挥发；第三，纤维素膜通过氢键与防腐剂紧密复合，从而防止防腐剂渗透到营养药物中，既可发挥对面膜的防腐作用，又可避免防腐剂被人体所吸收；第四，通过发酵直接得到具有成品外形的面膜，不需剪裁。
因此，本发明专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种发酵法直接合成细菌纤维素/生物防腐剂复合面膜的方法。
本发明解决技术问题所采用的技术方案是：
一种发酵法直接合成细菌纤维素/生物防腐剂复合面膜的方法，步骤如下：
⑴通过一步发酵法制备具有防腐功能的细菌纤维素面膜初品：将活化后的木葡糖酸醋杆菌种子液接入新鲜液体培养基中静置培养，培养至第2-3天，当细菌纤维素膜厚度形成至3-5mm时，向发酵液中添加生物防腐剂并继续发酵，得到与生物防腐剂复合的细菌纤维素面膜初品；
其中，所述生物防腐剂为纳他霉素、乳酸链球菌素、ε-聚赖氨酸的组合物，所述的生物防腐剂，在每升发酵液中的添加量(mg)为：纳他霉素10-50、乳酸链球菌素10-100、ε-聚赖氨酸10-200，所述纳他霉素、乳酸链球菌素、ε-聚赖氨酸的添加质量比为2～4：5～10：5～10；
⑵洗涤：将上述所得的细菌纤维素面膜初品以水浸泡洗涤，再经弱碱溶液浸泡，水洗涤至中性；
⑶浸渍：将上述所得的面膜置于美容药物溶液中进行浸渍处理，即得细菌纤维素/生物防腐剂复合面膜成品。
而且，所述步骤⑴的具体步骤如下：
a.菌种活化
由固体培养基平板上培养2d的木葡糖酸醋杆菌CGMCC2955，挑取一环，于150mL新鲜的液体培养基中，28-32℃，130-160r/min振荡培养20-24h，OD600为1.0-1.5；
b.发酵产膜
以5-10％(v/v)的接种量接入液体培养基中，经28-32℃静置培养2-3d，当细菌纤维素膜厚度形成至3-5mm时，以10-200ppm的添加量向发酵液中添加生物防腐剂并继续发酵1-3d，得到与生物防腐剂复合的细菌纤维素面膜初品。
而且，
所述菌种活化与发酵产膜过程所用培养基成分如下：
固体培养基(g/L)：
葡萄糖25，酵母粉7.5，蛋白胨10，Na2HPO410，琼脂20，121℃灭菌20min；
液体培养基(g/L)：
葡萄糖25，酵母粉7.5，蛋白胨10，Na2HPO410，冰醋酸调节初始pH6.0，121℃灭菌20min。
而且，所述步骤⑵的具体步骤如下：将细菌纤维素面膜初品以流动水浸泡洗涤处理1-2d后，再经0.1mol/L的NaOH溶液浸泡12-24h除去培养基及残存菌体，清水洗涤至中性。
而且，所述步骤⑶中浸渍处理的条件为：20-30℃下浸渍12-24h；浸渍液中美容药物的体积含量为1-5％。
而且，所述美容药物溶液中包括美容药物，所述美容药物为以下美容药物中的至少2种或2种以上(添加比例为美容药物溶液中的质量百分比)：芦荟萃取液0.5-2、矢车菊萃取液0.5-2、橄榄果萃取液0.5-2、银杏萃取液0.5-2、桑葚萃取液0.5-2、胶原蛋白0.5-2、小麦胚芽油0.5-2。
本发明的优点和积极效果是：
1、本方法通过木葡糖酸醋杆菌的液态一步发酵法，直接得到与生物防腐剂复合并具有成品外形的面膜，该方法简单、易于操作，本方法在发酵过程中，得到一种细菌纤维素/生物防腐剂(含纳他霉素、乳酸链球菌素、ε-聚赖氨酸)复合面膜，赋予了细菌纤维素膜的抑菌功能，同时，该方法中添加的生物防腐剂通过化学键与细菌纤维素膜复合，不易渗透到营养药物中，可避免被人体吸收，利于人体的健康。
2、本方法通过两步发酵法，直接得到具有成品外形的面膜，形成面膜的眼孔、嘴孔、鼻孔(如图1所示)，该方法操作极为方便，大大节约了操作时间，节约了人力、物力，降低了 生产成本，提高了企业的经济效益。
3、本方法所制备得到的面膜持水性强，保湿效果好；发酵后期加入的生物防腐剂抑菌效果好，安全性高；同时添加美容药物成分，使用后皮肤润泽，具有优良的美容功能。
附图说明
图1是本发明实施例细菌纤维素/生物防腐剂复合面膜的结构示意图，其中，1为面膜，2为眼孔，3为嘴孔，4为鼻孔。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的方法，如无特殊规定，均为本领域的常规方法；本发明所使用的试剂，如无特殊规定，均为本领域内的常规市售试剂。
本发明中所述菌种活化与发酵产膜过程中所用培养基成分如下：
固体培养基(g/L)：
葡萄糖25，酵母粉7.5，蛋白胨10，Na2HPO410，琼脂20，121℃灭菌20min；
液体培养基(g/L)：
葡萄糖25，酵母粉7.5，蛋白胨10，Na2HPO410，冰醋酸调节初始pH6.0，121℃灭菌20min。
实施例1
一种发酵法直接合成细菌纤维素/生物防腐剂复合面膜的方法，步骤如下：
a.菌种活化
由固体培养基平板上培养2d的木葡糖酸醋杆菌CGMCC2955，挑取一环，于150mL新鲜的液体培养基中，28℃，130r/min振荡培养20h，OD600约为1.0。
b.发酵产膜
以6％(v/v)的接种量接入液体培养基中，经28℃静置培养2d，当细菌纤维素膜厚度形成至3mm时，向发酵液中添加生物防腐剂(含纳他霉素30ppm、乳酸链球菌素50ppm、ε-聚赖氨酸100ppm)并继续发酵1d，得到与生物防腐剂复合的细菌纤维素面膜初品，并具备图1所示面膜眼孔[2]、嘴孔[3]和鼻孔[4]。
c.洗涤
将上述发酵制备的复合膜，以流动水浸泡洗涤处理1d后，再经0.1mol/L的NaOH溶液浸泡12h除去培养基及残存菌体，清水洗涤至中性；
d.浸渍
将上述所得的面膜置于含1％橄榄果萃取液、1％银杏萃取液和1％桑葚萃取液的美容药物溶液中，于20℃下浸渍12h，得到面膜成品。
实施例2
一种发酵法直接合成细菌纤维素/生物防腐剂复合面膜的方法，步骤如下：
a.菌种活化
由固体培养基平板上培养2d的木葡糖酸醋杆菌CGMCC2955，挑取一环，于150mL新鲜的液体培养基中，30℃，140r/min振荡培养22h，OD600约为1.2。
b.发酵产膜
以8％(v/v)的接种量接入液体培养基中，经30℃静置培养2d，当细菌纤维素膜厚度形成至5mm时，向发酵液中添加生物防腐剂(含纳他霉素40ppm、乳酸链球菌素100ppm、ε-聚赖氨酸60ppm)并继续发酵2d，得到与生物防腐剂复合的细菌纤维素面膜初品，并具备附图1所示面膜眼孔[2]、嘴孔[3]和鼻孔[4]。
c.洗涤
将上述发酵制备的复合膜，以流动水浸泡洗涤处理1d后，再经0.1mol/L的NaOH溶液浸泡20h除去培养基及残存菌体，清水洗涤至中性；
d.浸渍
将上述所得的面膜置于含1％芦荟萃取液、1％矢车菊萃取液的美容药物溶液中，于25℃下浸渍16h，得到面膜成品。
实施例3
一种发酵法直接合成细菌纤维素/生物防腐剂复合面膜的方法，步骤如下：
a.菌种活化
由固体培养基平板上培养2d的木葡糖酸醋杆菌CGMCC2955，挑取一环，于150mL新鲜的液体培养基中，32℃，150r/min振荡培养24h，OD600约为1.5。
b.发酵产膜
以5％(v/v)的接种量接入液体培养基中，经30℃静置培养2d，当细菌纤维素膜厚度形成至4mm时，向发酵液中添加生物防腐剂(含纳他霉素20ppm、乳酸链球菌素80ppm、ε-聚赖氨酸50ppm)并继续发酵2d，得到与生物防腐剂复合的细菌纤维素面膜初品，并具备附图1所示面膜眼孔[2]、嘴孔[3]和鼻孔[4]。
c.洗涤
将上述发酵制备的复合膜，以流动水浸泡洗涤处理1d后，再经0.1mol/L的NaOH溶液浸泡20h除去培养基及残存菌体，清水洗涤至中性；
d.浸渍
将上述所得的面膜置于含1％胶原蛋白、1％小麦胚芽油的美容药物溶液中，于30℃下浸渍12h，得到面膜成品。
实施例4
一种发酵法直接合成细菌纤维素/生物防腐剂复合面膜的方法，步骤如下：
a.菌种活化
由固体培养基平板上培养2d的木葡糖酸醋杆菌CGMCC2955，挑取一环，于150mL新鲜的液体培养基中，28-32℃，130-160r/min振荡培养20-24h，OD600约为1.0-1.5。
b.发酵产膜
以5-10％(v/v)的接种量接入液体培养基中，经28-32℃静置培养2-3d，当细菌纤维素膜厚度形成至3-5mm时，向发酵液中添加生物防腐剂(含纳他霉素、乳酸链球菌素、ε-聚赖氨酸)并继续发酵1-3d，得到与生物防腐剂复合的细菌纤维素面膜初品。
c.洗涤
将上述发酵制备的复合膜，以流动水浸泡洗涤处理1-2d后，再经0.1mol/L的NaOH溶液浸泡12-24h除去培养基及残存菌体，清水洗涤至中性；
d.浸渍
将上述所得的面膜置于美容药物溶液中，于20-30℃下浸渍12-24h(浸渍液中美容药物的体积含量为1-5％)，得到面膜成品。
其中，菌种活化与发酵过程所用培养基成分如下：
(1)固体培养基(g/L)
葡萄糖25，酵母粉7.5，蛋白胨10，Na2HPO410，琼脂20，121℃灭菌20min；
(2)液体培养基(g/L)
葡萄糖25，酵母粉7.5，蛋白胨10，Na2HPO410，冰醋酸调节初始pH6.0，121℃灭菌20min；
其中，所述的生物防腐剂，在每升发酵液中的添加量(mg)为：纳他霉素10-50、乳酸链球菌素10-100、ε-聚赖氨酸10-200，三种生物防腐剂的添加质量比为2～4：5～10：5～10；
其中，所述的美容药物为以下美容药物的至少2种或2种以上(添加比例为美容药物溶液中的质量百分比)：芦荟萃取液0.5-2、矢车菊萃取液0.5-2、橄榄果萃取液0.5-2、银杏萃取 液0.5-2、桑葚萃取液0.5-2、胶原蛋白0.5-2、小麦胚芽油0.5-2。
以下通过试验进一步说明本发明的有益效果：
化妆品防腐挑战性试验
本实验参照美国化妆品、盥洗用品和香精协会(CTFA)推荐的防腐体系效能评价方法，以CTFA推荐的经典的为期28天的防腐单次挑战实验。
1.挑战用微生物：细菌和霉菌
2.接种的方式和数量
(1)接种的方式：采用混合接种。因为自然界的微生物有混生杂居的特点，所以混合接种符合实际污染的情况。
(2)接种的数量：将各菌种接种于合适的培养基中，于37℃(细菌)和28℃(霉菌)下培养。细菌培养48小时，霉菌培养72小时后，挑选适量菌落于灭菌的生理盐水中,制成一定浓度的混合细菌(1×106CFU/g或CFU/ml)或混合霉菌悬液(1×105CFU/g或CFU/ml),置于4℃贮放备用。
3.微生物挑战实验
称取实施例1-3面膜样品各30克，无菌环境下将面膜破碎至泥状，加入灭菌的容器内，加入混合细菌和霉菌悬液，充分混匀。每克样品含细菌量为1×106CFU/g或CFU/ml；含霉菌量为1×105CFU/g或CFU/ml。然后置于28℃下。在接菌的0、7、14、21、28天取样分析：准确称取3克样品，加到含有玻璃小球和27ml灭菌生理盐水的锥形瓶内，充分震荡混匀，此悬液为1:10稀释液，然后再用灭菌生理盐水按10倍依次稀释。按平板倾注法计数样品中含菌量，细菌在37℃下培养48小时，霉菌在28℃下培养72小时。
4.评判标准
在28天样品中含细菌或霉菌在10CFU/g～100CFU/g(CFU/ml)，表明该样品的防腐体系对微生物有较强的抑杀效果，通过挑战试验，在第7天下降到1000CFU/g(CFU/m1)以下视为勉强通过，其它视为不通过。
5.实验结果
在接种的0、7、14、2l和28天取样检测，其结果见表1。
表1面膜样品防腐测验结果
从以上结果中可以看出，本复合面膜具有抑菌功能，同时，该方法中添加的生物防腐剂通过化学键与细菌纤维素膜复合，不易渗透到营养药物中，可避免被人体吸收，利于人体的健康。
Claims (6)
1.一种发酵法直接合成细菌纤维素/生物防腐剂复合面膜的方法，其特征在于：步骤如下：
⑴通过一步发酵法制备具有防腐功能的细菌纤维素面膜初品：将活化后的木葡糖酸醋杆菌种子液接入新鲜液体培养基中静置培养，培养至第2-3天，当细菌纤维素膜厚度形成至3-5mm时，向发酵液中添加生物防腐剂并继续发酵，得到与生物防腐剂复合的细菌纤维素面膜初品；
其中，所述生物防腐剂为纳他霉素、乳酸链球菌素、ε-聚赖氨酸的组合物，所述的生物防腐剂，在每升发酵液中的添加量(mg)为：纳他霉素10-50、乳酸链球菌素10-100、ε-聚赖氨酸10-200，所述纳他霉素、乳酸链球菌素、ε-聚赖氨酸的添加质量比为2～4：5～10：5～10；
⑵洗涤：将上述所得的细菌纤维素面膜初品以水浸泡洗涤，再经弱碱溶液浸泡，水洗涤至中性；
⑶浸渍：将上述所得的面膜置于美容药物溶液中进行浸渍处理，即得细菌纤维素/生物防腐剂复合面膜成品。
2.根据权利要求1所述的发酵法直接合成细菌纤维素/生物防腐剂复合面膜的方法，其特征在于：所述步骤⑴的具体步骤如下：
a.菌种活化
由固体培养基平板上培养2d的木葡糖酸醋杆菌CGMCC2955，挑取一环，于150mL新鲜的液体培养基中，28-32℃，130-160r/min振荡培养20-24h，OD600为1.0-1.5；
b.发酵产膜
以5-10％(v/v)的接种量接入液体培养基中，经28-32℃静置培养2-3d，当细菌纤维素膜厚度形成至3-5mm时，以10-200ppm的添加量向发酵液中添加生物防腐剂并继续发酵1-3d，得到与生物防腐剂复合的细菌纤维素面膜初品。
3.根据权利要求2所述的发酵法直接合成细菌纤维素/生物防腐剂复合面膜的方法，其特征在于：
所述菌种活化与发酵产膜过程所用培养基成分如下：
固体培养基(g/L)：
葡萄糖25，酵母粉7.5，蛋白胨10，Na2HPO4 10，琼脂20，121℃灭菌20min；
液体培养基(g/L)：
葡萄糖25，酵母粉7.5，蛋白胨10，Na2HPO4 10，冰醋酸调节初始pH 6.0，121℃灭菌20min。
4.根据权利要求1所述的发酵法直接合成细菌纤维素/生物防腐剂复合面膜的方法，其特征在于：所述步骤⑵的具体步骤如下：将细菌纤维素面膜初品以流动水浸泡洗涤处理1-2d后，再经0.1mol/L的NaOH溶液浸泡12-24h除去培养基及残存菌体，清水洗涤至中性。
5.根据权利要求1所述的发酵法直接合成细菌纤维素/生物防腐剂复合面膜的方法，其特征在于：所述步骤⑶中浸渍处理的条件为：20-30℃下浸渍12-24h；浸渍液中美容药物的体积含量为1-5％。
6.根据权利要求1至5任一项所述的发酵法直接合成细菌纤维素/生物防腐剂复合面膜的方法，其特征在于：所述美容药物溶液中包括美容药物，所述美容药物为以下美容药物中的至少2种或2种以上(添加比例为美容药物溶液中的质量百分比)：芦荟萃取液0.5-2、矢车菊萃取液0.5-2、橄榄果萃取液0.5-2、银杏萃取液0.5-2、桑葚萃取液0.5-2、胶原蛋白0.5-2、小麦胚芽油0.5-2。
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