CN104379148B - 用于治疗神经障碍的雌激素组分 - Google Patents

Abstract

本发明涉及某些雌激素组分例如雌四醇在神经障碍例如新生儿低氧‑缺血性脑病(HIE)中的预防和治疗应用。

Description

用于治疗神经障碍的雌激素组分

发明领域

本发明涉及医学领域。本发明更具体地涉及某些雌激素组分例如雌四醇(estetrol) (1,3,5(10)-雌三烯-3,15α,16α,17β-四醇)的新的医学用途。

发明背景

神经障碍，特别是中枢神经系统(CNS)障碍，包括许多疾患，尤其包括急性CNS损伤(例如，低氧-缺血性脑病、中风、创伤性脑损伤、脊髓损伤、大脑性麻痹)、神经变性疾病(例如，阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、额颞叶性痴呆)和大量的中枢神经系统功能障碍(例如抑郁症、癫痫症和精神分裂症)。

新生儿低氧-缺血性脑病(HIE)是一种神经障碍，其由于不充分的氧供应而引起对新生儿脑细胞的损害。由于全身血氧不足和减少的脑血流(CBF)所致的脑低氧和缺血是导致发生在新生儿中的新生儿HIE伴有灰质和白质损伤的主要原因。新生儿HIE可引起新生期死亡或导致后来公认的发育迟缓、智力迟钝或大脑性麻痹(CP)。尽管最近已开发出不同的治疗策略，新生儿HIE仍是一种引起未足月(near-term)和足月新生儿重大死亡率和发病率的严重病症并因此其仍是对围产医学的一个挑战。

在过去的几年中，低氧-缺血性脑损伤的大鼠模型成为围产医学中最常用的模型。在产后第7天(P7；出生日 = P1)，大鼠脑在组织学上类似于孕32-至34-周的人类胎儿或新生婴儿的脑，即脑皮质神经元分层是完整的，生发基质正在退化，白质至今已经历很少的髓鞘形成。为了在7-天龄大鼠幼仔中产生低氧-缺血性脑损伤，使它们在恒温(37℃)经受单侧颈总动脉结扎，接着经历通过吸入8%氧/平衡氮产生的全身低氧(Vanucci等 2005. DevNeurosci, 第27卷, 81-86)。

已证明大鼠模型提供关于围产期低氧-缺血性脑损伤的基本机理和如何可使组织损伤通过治疗干预得到预防或使组织损伤最小化的重要信息。特别是，生理和治疗处理已被应用于围产期低氧-缺血性脑损伤的未成熟大鼠模型，以评价潜在的治疗，包括降低体温、氙气治疗和给予促红细胞生成素。

有希望的神经保护剂包括抗癫痫药、促红细胞生成素、褪黑激素和氙气。来自窒息动物模型的数据进一步提示，HIE后的神经学后果可通过在损害后数小时至数天内开始加入降低体温的辅助疗法而得到改善。这些有希望的治疗现在需要在临床试验中进行评价。在将新的疗法采用于实效性试验之前，使用生物标志物的结果例如磷磁共振波谱并包括少数婴儿的1-2期临床研究是评价安全性和潜在功效的关键。氙气和促红细胞生成素的1-2期试验已经在计划或实施中。

用于神经障碍、特别是CNS损伤或神经变性疾病的疗法可集中在保护脑或脊髓免受损害或恢复神经细胞活性，例如，通过使用神经营养因子进行。神经营养因子例如表皮生长因子(EGF)和转化生长因子-α (TGF-α)，是多方面支持神经细胞的存活、增殖、分化、大小和功能的多肽。神经障碍的治疗也可包括给予干细胞以替换因自然细胞死亡、损伤或疾病所致损失的那些神经细胞。

给予这样的神经营养因子或干细胞所遇到的一个问题是血-脑屏障，其可阻止它们从血流进入CNS的转移。因此，治疗常常需要直接施应神经营养因子或输注干细胞到需要这类治疗的受试者的CNS中的损伤或损害部位。

鉴于一般来说缺乏对神经障碍的成功治疗，仍有对优选地不依赖于侵袭性颅内手术或具有改善的血-脑屏障通路的物质的另外的治疗剂和方法的需求。

发明概述

本发明致力于本领域的一种或多种以上讨论的需求。

如在实验部分所表明的，发明人发现某些雌激素组分，用雌四醇举例说明，具有神经保护作用。例如，发明人惊奇地证明，用雌四醇治疗大鼠幼仔可保护它们避免由于低氧-缺血所致的脑损伤。同样明显地，显示在低氧-缺血后(即，继于低氧-缺血后)，用某些雌激素组分(用雌四醇举例说明)治疗大鼠幼仔导致较少的脑损伤，这确证这些化合物表现出有利的治疗效果。而且，已表明用某些雌激素化合物(用雌四醇举例说明)治疗大鼠幼仔，促进神经形成和血管发生。

雌四醇(E4)是在人怀孕期间仅由胎儿肝合成并通过胎盘到达母体循环的雌激素类固醇物质。该物质在早至怀孕9周的母亲尿中已有发现，并基本上随着怀孕的进展增加(Holinka等 2008. J Steroid Biochem Mol Biol, 第110卷, 138-143)。未缀合的E4也存在于羊水中。雌四醇是雌二醇(E2)的主要代谢产物，由其前体经由羟基化形成。

E4被认为比E2的效力低，因为与E2相比，其雌激素受体结合亲和力低。竞争受体结合研究显示E4结合于核和胞浆雌激素受体的亲和力相对于E2的亲和力要低，显示E2和E4对于胞浆雌激素受体结合的值分别为1.0和0.015 (Holinka等 同上)。与E2相比，E4在培养的雌激素响应的MCF-7细胞的生长促进中用作一种弱的雌激素：显示E2的效力为E4的50倍。

Warmerdam等 2008 (Climacteric, 第11卷 (增刊1), 59-63)报告辛醇-水分配(Pow)系数——其是一种化合物的亲脂或亲水性的量度，表示为雌四醇的Pow的对数或“PowLog”，Pow Log = 1.47或1.695，取决于实验设置。因为2.0的Pow Log被认为是最佳的，允许化合物通过血-脑屏障(Warmerdam等 2008, 同上)，雌四醇在新生HIE大鼠模型中强的神经保护作用是令人惊奇的。

最近的药理学和临床数据支持E4用于应用例如激素疗法、避孕、预防骨质疏松和更年期潮热、癌症疗法和治疗或预防心血管病变的潜在临床用途。据发明人所知，迄今为止，尚未描述雌激素组分(用E4举例说明)在中枢神经系统中的作用。

因此，在一方面，本发明提供用于治疗神经障碍的雌激素组分，其选自：

具有式(I)的雌激素物质：

(I)

其中R₁、R₂、R₃、R₄各自独立地是氢原子、羟基或具有1-5个碳原子的烷氧基；其中R₅、R₆、R₇中的每一个是羟基；和其中R₁、R₂、R₃、R₄中不超过3个是氢原子；

雌激素物质的前体；和

一种或多种雌激素物质和/或前体的混合物。

优选地，本发明提供用于治疗神经障碍的雌激素组分，其选自：

具有式(I)的雌激素物质：

(I)

其中R₁、R₂、R₃、R₄各自独立地是氢原子、羟基或具有1-5个碳原子的烷氧基；其中R₅、R₆、R₇中的每一个是羟基；和其中R₁、R₂、R₃、R₄中不超过3个是氢原子；

雌激素物质的前体，其中所述前体是雌激素物质的衍生物，其中至少一个羟基的氢原子已被1-25个碳原子的烃羧酸、磺酸或氨基磺酸的酰基；四氢呋喃基；四氢吡喃基；或每个残基含有1-20个糖苷单位的直链或支链糖苷(glycosydic)残基取代；和

一种或多种雌激素物质和/或前体的混合物。

本发明也提供在需要这样治疗的患者中治疗神经障碍的方法，包括给予所述患者治疗有效量的如本文讲述的雌激素组分。

本发明也提供如本文讲述的雌激素组分在制备用于治疗神经障碍的药物中的用途。

在优选的实施方案中，R₃代表羟基或具有1-5个碳原子的烷氧基，更优选R₃代表羟基。

在优选的实施方案中，R₁、R₂、R₃和R₄中的至少2个，更优选3个代表氢原子。在特别优选的实施方案中，R₁、R₂和R₄代表氢原子。

在某些实施方案中，R₃代表羟基或具有1-5个碳原子的烷氧基，更优选R₃代表羟基，和基团R₁、R₂和R₄中的至少1个，更优选至少2个，和甚至更优选地全部3个代表氢原子。

在进一步优选的实施方案中，R₁、R₂和R₄代表氢原子和R₃、R₅、R₆和R₇是羟基；因此，雌激素物质或雌激素组分是1,3,5(10)-雌三烯-3,15,16,17-四醇。在特别优选的实施方案中，雌激素物质或雌激素组分是1,3,5(10)-雌三烯-3,15α,16α,17β-四醇(雌四醇)。

在优选的实施方案中，前体是雌激素物质的衍生物，其中至少一个羟基的氢原子已被1-25个碳原子的烃羧酸、磺酸或氨基磺酸的酰基；四氢呋喃基；四氢吡喃基；或每个残基含有1-20个糖苷单位的直链或支链糖苷残基取代。

如所注明的，本发明提供如本文讲述的用于治疗神经障碍的雌激素组分。

在优选的实施方案中，本发明提供如本文讲述的用于治疗性治疗神经障碍(即治疗神经障碍)的雌激素组分，其中所述雌激素组分给予经诊断患有神经障碍的受试者。

所用术语“神经障碍”一般意指影响神经系统(包括中枢神经系统和外周神经系统)的障碍。

在优选的实施方案中，神经障碍是损伤，优选中枢神经系统损伤，更优选脑损伤，或是神经变性疾病。优选地，神经障碍因此选自包括以下疾病或由以下疾病组成的组：脑损伤、脊髓损伤和神经变性疾病。更优选神经障碍选自包括以下疾病或由以下疾病组成的组：脑损伤和神经变性疾病。

在优选的实施方案中，神经障碍选自包括以下疾病或由以下疾病组成的组：低氧性脑损伤、缺氧性脑损伤、创伤性脑损伤、阿尔茨海默氏病和帕金森氏。

在某些实施方案中，阿尔茨海默氏病是早期阿尔茨海默氏病，即临床前阶段或最早的临床期的阿尔茨海默氏病。

在某些实施方案中，帕金森氏病是早期非痴呆性帕金森氏病或具有轻度认知缺损的帕金森氏病。

所用术语“低氧性损伤”或“缺氧性损伤”在此意指作为分别由于低氧性(即，对脑的氧供应减少)或者缺氧性(即，脑完全缺氧)机制所致的氧剥夺的结果的脑损伤。低氧/缺氧性损伤可影响脑的局部区域或全脑。在某些优选的实施方案中，低氧/缺氧/创伤性脑损伤影响至少海马或大脑皮质，例如至少海马和大脑皮质，优选至少海马。

在优选的实施方案中，神经障碍是低氧-缺血性脑病(HIE)。

所用术语“低氧-缺血性脑病”或“HIE”在此尤其意指发生在全脑缺乏足够的氧供应，但并非完全剥夺氧的病症。氧供应不足可能起源是是低氧，即氧的可利用性减少，和/或起源是缺血，即，由于血流中断所致的氧剥夺。在某些优选的实施方案中，HIE影响至少海马或大脑皮质，例如，至少海马和大脑皮质，优选至少海马。

在特别优选的实施方案中，如本文讲述的雌激素组分被用于治疗新生儿低氧-缺血性脑病(HIE)。

如本文所用的，措辞“治疗新生儿HIE”可包括保护脑避免损伤，和可进一步包括预防新生儿HIE相关障碍，缓解新生儿HIE相关障碍有关的症状，或减少新生儿HIE相关障碍的程度，新生儿HIE相关障碍例如发育迟缓、智力迟钝或大脑性麻痹(CP) (CP的改善包括例如运动、行为，和/或认知功能改进)。如本文所用的，术语“大脑性麻痹”指以运动或姿势的长期障碍为特征的一组病症。大脑性麻痹可伴有癫痫障碍、感觉损伤和/或认知局限。

本发明的以上和另外的方面、优选的实施方案和特征在以下章节和在所附的权利要求书中描述。本文描述的每个方面、实施方案或特征可与任何其它方面、实施方案或特征结合，除非明确表示与此相反。特别是，本文详细说明的任何特征以及特别是指明为优选的或有利的任何特征，可与本文详细说明的任何其它特征和特别是与指明为优选的或有利的任何其它特征结合。所附权利要求书的主题在此特别地结合到本申请中

附图简述

图1 大鼠幼仔的术后体重. 在分娩后从第4天至第7天(包括第4天和第7天在内)用溶媒(盐水溶液) (溶媒、5 mg/kg E4 (E4 5 mg/kg)或50 mg/kg E4 (E4 50 mg/kg)腹膜内注射或者不注射(假手术)的大鼠幼仔术后体重。显示了来自假手术组的7只大鼠幼仔，溶媒组的11只大鼠幼仔，来自E4 5 mg/kg组的7只大鼠幼仔和来自E4 50 mg/kg组的5只大鼠幼仔的体重的均值± SEM。

图2 大鼠幼仔的脑重. 从分娩后第4天至第7天(包括第4天和第7天在内)用溶媒(盐水溶液) (溶媒)、5 mg/kg E4 (5 mg/kg)或50 mg/kg E4 (50 mg/kg)腹膜内注射或者不注射(假手术)的大鼠幼仔的脑重。显示来自假手术组的7只大鼠幼仔，溶媒组的11只大鼠幼仔，来自E4 5 mg/kg组的7只大鼠幼仔和来自E4 50 mg/kg组的5只大鼠幼仔在分娩后第14天处死时的脑重均值± SEM。比例尺：2 mm。

图3 大鼠幼仔的海马区的脑切片苏木精-伊红染色. 在分娩后第14天处死时取出大鼠幼仔的脑并对多聚甲醛固定和石蜡包埋的样本进行海马区的切片和苏木精-伊红染色。从分娩后第4天至第7天(包括第4天和第7天在内)用溶媒(盐水溶液) (溶媒)、5 mg/kgE4 (E4 5 mg/kg)或50 mg/kg E4 (E4 50 mg/kg)对大鼠幼仔进行腹膜内注射或不注射(假手术)。

图4 苏木精-伊红染色的大鼠幼仔脑切片的完整细胞计数. 在苏木精-伊红染色的大鼠幼仔脑切片上在海马的齿状回区(DG)、颗粒下区(SGZ)以及海马角(CA1, CA2/CA3)和皮质中对完整细胞计数。在各个脑区域的3个视野中以放大400x对完整细胞计数且平均数表示为每个视野的完整细胞数。显示了来自假手术组的7只大鼠幼仔，溶媒组的11只大鼠幼仔，来自E4 5 mg/kg组的7只大鼠幼仔和来自E4 50 mg/kg组的5只大鼠幼仔的完整细胞数/视野加权的均值± SEM。

图5 用雌四醇预处理的大鼠幼仔的术后体重. 在每一个指明的出生后天数(X-轴)，6个条柱从左到右分别代表不注射溶媒或E4 (假手术组，n=24)，从出生后第4天至第7天(包括第4天和第7天在内)用溶媒腹膜内注射(溶媒组, n=14)，从出生后第4天至第7天(包括第4天和第7天在内)用1 mg/kg E4腹膜内注射(n=11)，从出生后第4天至第7天(包括第4天和第7天在内)用5 mg/kg E4腹膜内注射(n=14)，从出生后第4天至第7天(包括第4天和第7天在内)用10 mg/kg E4腹膜内注射(n=14)，或从出生后第4天至第7天(包括第4天和第7天在内)用50 mg/kg E4腹膜内注射(n=19)的大鼠幼仔的术后体重(以g计)。在出生后第7天，在最后的注射后30分钟，使大鼠幼仔经历低氧-缺血性损害。假手术动物通过类似的操作而无低氧-缺血性损害。测量结果表示为均值± SEM。

图6 用雌四醇预处理的大鼠幼仔的脑重. 不注射溶媒或E4 (假手术组，n=24)，或从出生后第4天至第7天(包括第4天和第7天在内)用溶媒(溶媒组, n=14)，1 mg/kg E4 (n=11)，5 mg/kg E4 (n=14)，10 mg/kg E4 (n=14)或50 mg/kg E4 (n=19)腹膜内注射的大鼠幼仔的脑重(以g计)。在出生后第7天，在最后的注射后30分钟，使大鼠幼仔经历低氧-缺血性损害。假手术动物通过类似的操作而无低氧-缺血性损害。测量结果表示为均值± SEM。

图7 用雌四醇预处理的大鼠幼仔中冠状脑切片的苏木精-伊红染色和完整细胞计数. 大鼠幼仔(a) 不注射溶媒或E4 (假手术组，n=14)，或从出生后第4天至第7天(包括第4天和第7天在内)用(b) 溶媒(溶媒组, n=16)，(c) 1 mg/kg E4 (n=10)，(d) 5 mg/kg E4(n=13)，(e) 10 mg/kg E4 n=(10)或(f) 50 mg/kg E4 (n=14)腹膜内注射。在出生后第7天，在最后的注射后30分钟，使大鼠幼仔经历低氧-缺血性损害。假手术动物通过类似的操作而无低氧-缺血性损害。在出生后第14天处死时取出脑并对多聚甲醛固定和石蜡包埋的脑样本在海马区进行冠状切片。显示研究组的(A) 脑冠状切片(比例尺：2mm), (B) 海马区(比例尺：500μm)，和(C) 皮质(比例尺：100μm)的苏木精-伊红染色。(D) 在苏木精-伊红染色的大鼠幼仔冠状脑切片上在海马的不同区域：齿状回(DG)、颗粒下区(SGZ)和海马角(CA1, CA2/CA3)以及皮质中对完整细胞计数。在各个脑区域的3个放大400x的视野中对完整细胞计数，而平均数表示为每个视野的完整细胞数。对于每个指定的脑区域(在X-轴上的DG、SGZ、CA1、CA2/3、皮质)，6个条柱从左到右分别代表来自假手术组、溶媒组的大鼠幼仔、用1 mg/kg E4处理的大鼠幼仔、用5 mg/kg E4处理的大鼠幼仔、用10 mg/kg E4处理的大鼠幼仔或用50 mg/kg E4处理的大鼠幼仔的每个视野完整细胞数。全部测量结果表示为均值± SEM。

图8 用雌四醇预处理的大鼠幼仔的脑冠状切片的微管相关蛋白2 (MAP2)染色.对大鼠幼仔(a) 不注射溶媒或E4 (假手术组)，或从出生后第4天至第7天(包括第4天和第7天在内)用(b) 溶媒(溶媒组)，(c) 1 mg/kg E4，(d) 5 mg/kg E4，(e) 10 mg/kg E4或 (f)50 mg/kg E4腹膜内注射。在出生后第7天，在最后的注射后30分钟，使大鼠幼仔经历低氧-缺血性损害。假手术动物通过类似的操作而无低氧-缺血性损害。在出生后第14天处死时取出脑并对多聚甲醛固定和石蜡包埋的脑样本在海马区进行冠状切片。处理切片用于通过用抗-MAP2抗体进行的免疫组织学染色检测神经元细胞骨架分裂。(A) 显示脑冠状切片的MAP2染色(比例尺：2 mm)。(B) MAP2阳性面积的比率计算为同侧半球的MAP2阳性面积除以对侧半球的MAP2阳性面积。分析来自每一研究组的10个样本。考虑将假手术组的MAP2阳性面积的比率默认为1。

图9 用雌四醇预处理的大鼠幼仔海马和皮质中的双皮层蛋白(DCX)和血管内皮生长因子(VEGF)染色. 对大鼠幼仔不注射溶媒或E4 (假手术组)，或从出生后第4天至第7天(包括第4天和第7天在内)用溶媒(溶媒组)、1 mg/kg E4、5 mg/kg E4、10 mg/kg E4或50mg/kg E4腹膜内注射。在出生后第7天，在最后的注射后30分钟，使大鼠幼仔经历低氧-缺血性损害。假手术动物通过类似的操作而无低氧-缺血性损害。在出生后第14天处死时取出脑并对多聚甲醛固定和石蜡包埋的脑样本在海马区进行冠状切片。用抗-DCX抗体和抗-VEGF抗体对切片进行双染色。DCX (A)和VEGF (B)阳性细胞的百分率被量化为DCX或者VEGF阳性染色细胞的总和除以DAPI阳性细胞的总数。在海马的不同区域((齿状回(DG)、海马角1(CA1)、海马角2/3(CA2/CA3))和在皮质中进行量化。在假手术、1 mg/kg E4、5 mg/kg E4、10mg/kg E4、50 mg/kg E4组中分析10个样本并与来自溶媒组的12个样本进行比较。对于每个指定的脑区域(在X-轴上的DG、CA1、CA2/3、皮质)，6个条柱从左到右分别代表假手术组、溶媒组、1 mg/kg E4组、5 mg/kg E4组、10 mg/kg E4组或50 mg/kg E4组中的DCX (A)或VEGF(B)阳性细胞的百分率。全部测量结果表示为均值± SEM。

图10 S100B和胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)在用雌四醇预处理的大鼠幼仔血清中的表达. 对大鼠幼仔不注射溶媒或E4 (假手术组，n=20和n=21分别对于S100B和GFAP)，或从出生后第4天至第7天(包括第4天和第7天在内)用溶媒(溶媒组, n=13和n=15分别对于S100B和GFAP)、1 mg/kg E4 (n=10和n=11分别对于S100B和GFAP)、5 mg/kg E4 (n=11和n=11分别对于S100B和GFAP)、10 mg/kg E4 (n=13和n=10分别对于S100B和GFAP)或50mg/kg E4 (n=19和n=18分别对于S100B和GFAP)腹膜内注射。在出生后第7天，在最后的注射后30分钟，使大鼠幼仔经历低氧-缺血性损害。假手术动物通过类似的操作而无低氧-缺血性损害。在出生后第14天处死时抽取血样。进行针对S100B和GFAP蛋白的ELISA以检测S100B(A) GFAP (B)在血清中的浓度。全部测量结果表示为均值± SEM。

图11 用雌四醇处理的大鼠幼仔的术后体重. 在出生后第7天，使大鼠幼仔经历低氧-缺血性损害。在从低氧恢复后，用单剂量的溶媒(溶媒组, n=20)、1 mg/kg E4 (n=16)、5mg/kg E4 n=19)、10 mg/kg E4 (n=17)或50 mg/kg E4 (n=15)对大鼠幼仔进行腹膜内注射。对假手术动物进行类似的操作而无低氧-缺血性损害且对它们既不注射溶媒也不注射E4 (假手术组，n=29)。在每一个指明的出生后天数(X-轴)，6个条柱从左到右分别代表来自假手术组、溶媒组、1 mg/kg E4组、5 mg/kg E4组、10 mg/kg E4组或50 mg/kg E4组的大鼠幼仔的术后体重(以g计)。测量结果表示为均值± SEM。

图12 用雌四醇处理的大鼠幼仔的脑重.

在出生后第7天，使大鼠幼仔经历低氧-缺血性损害。在从低氧恢复后，对大鼠幼仔用单剂量的溶媒(溶媒组, n=20)、1 mg/kg E4 (n=16)、5 mg/kg E4 n=19)、10 mg/kg E4(n=17)或50 mg/kg E4 (n=15)腹膜内注射。假手术动物进行类似的操作而无低氧-缺血性损害且对它们既不注射溶媒也不注射E4 (假手术组，n=29)。示出大鼠幼仔的脑重(以g计)。测量结果表示为均值± SEM。

图13 用雌四醇处理的大鼠幼仔的冠状脑切片的苏木精-伊红染色和完整细胞计数.

在出生后第7天，使大鼠幼仔经历低氧-缺血性损害。在从低氧恢复后，对大鼠幼仔用单剂量的(b) 溶媒(溶媒组, n=10)、(c) 1 mg/kg E4 (n=10)、(d) 5 mg/kg E4 (n=10)、(e) 10 mg/kg E4 (n=10)或(f) 50 mg/kg E4 (n=10)腹膜内注射。假手术动物(a)进行类似的操作而无低氧-缺血性损害，对它们既不注射溶媒也不注射E4 (假手术组，n=10)。在出生后第14天处死时取出脑并对多聚甲醛固定和石蜡包埋的样本进行海马区的冠状切片，接着进行苏木精-伊红染色。显示 (A) 脑冠状切片(比例尺：2mm), (B) 海马区(比例尺：500μm)，和(C) 皮质(比例尺：100μm)的苏木精-伊红染色。(D) 在苏木精-伊红染色的冠状脑切片上在海马的不同区域：齿状回(DG)、颗粒下区(SGZ)和海马角(CA1, CA2/CA3)以及皮质中对完整细胞计数。在各个脑区域的3个放大400x的视野中对完整细胞计数，而平均数表示为每个视野的完整细胞数。对于每个指定的脑区域(在X-轴上的DG、SGZ、A1、CA2/3、皮质)，6个条柱从左到右分别代表来自假手术组、溶媒组的大鼠幼仔、用1 mg/kg E4处理的大鼠幼仔、用5 mg/kg E4处理的大鼠幼仔、用10 mg/kg E4处理的大鼠幼仔或用50 mg/kg E4处理的大鼠幼仔的每个视野的完整细胞数。全部测量结果表示为均值± SEM。

图14 用雌四醇处理的大鼠幼仔的脑冠状切片的微管相关蛋白2 (MAP2)染色. 在出生后第7天，使大鼠幼仔经历低氧-缺血性损害。在从低氧恢复后，对大鼠幼仔腹膜内注射单剂量的(b) 溶媒(溶媒组, n=10)、c) 1 mg/kg E4 (n=10)、(d) 5 mg/kg E4 (n=10)、(e)10 mg/kg E4 (n=10)或(f) 50 mg/kg E4 (n=10)。假手术动物(a)进行类似的操作而无低氧-缺血性损害，对它们既不注射溶媒也不注射E4 (假手术组，n=10)。在出生后第14天处死时取出脑并对多聚甲醛固定和石蜡包埋的脑样本在海马区进行冠状切片。对切片处理以通过用抗-MAP2抗体进行的免疫组织学染色检测神经元细胞骨架分裂。(A) 显示脑冠状切片的MAP2染色(比例尺：2 mm)。(B) MAP2阳性面积的比率计算为同侧半球的MAP2阳性面积除以对侧半球的MAP2-阳性面积。分析来自各组的10个样本。考虑将假手术组的MAP2阳性面积的比率默认为1.0。

图15 用雌四醇处理的大鼠幼仔的海马和皮质的双皮层蛋白(DCX)和血管内皮生长因子(VEGF)染色. 在出生后第7天，使大鼠幼仔经历低氧-缺血性损害。在从低氧恢复后，对大鼠幼仔腹膜内注射单剂量的溶媒(溶媒组, n=10)、1 mg/kg E4 (n=10)、5 mg/kg E4(n=10)、10 mg/kg E4 (n=10)或50 mg/kg E4 (n=10)。假手术动物(a)进行类似的操作而无低氧-缺血性损害，对它们既不注射溶媒也不注射E4 (假手术组，n=10)。在出生后第14天处死时取出脑并对多聚甲醛固定和石蜡包埋的脑样本在海马区进行冠状切片。用抗-DCX抗体和抗-VEGF抗体对切片进行双染色。DCX (A)和VEGF (B)阳性细胞的百分率被量化为DCX或者VEGF阳性染色细胞的总和除以DAPI阳性细胞的总数。在海马的不同区域((齿状回(DG)、海马角1 (CA1)、海马角2/3(CA2/CA3))和在皮质中进行量化。分析来自各研究组的10个样本。对于每个指定的脑区域(在X-轴上的DG、CA1、CA2/3、皮质)，6个条柱从左到右分别代表假手术组、溶媒组、1 mg/kg E4组、5 mg/kg E4组、10 mg/kg E4组或50 mg/kg E4组的DCX(A)或VEGF (B)阳性细胞的百分率。全部测量结果表示为均值± SEM。

图16 用雌四醇处理的大鼠幼仔的血清中的S100B和胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)表达. 在出生后第7天，使大鼠幼仔经历低氧-缺血性损害。在从低氧恢复后，对大鼠幼仔腹膜内注射单剂量的溶媒(溶媒组, n=14和n=16分别用于S100B和GFAP))、1 mg/kg E4(n=13和n=15分别用于S100B和GFAP)、5 mg/kg E4 (n=16和n=15分别用于S100B和GFAP)、10mg/kg E4 (n=13和n=13分别用于S100B和GFAP)或50 mg/kg E4 (n=15和n=14分别用于S100B和GFAP)。假手术动物(a)进行类似的操作而无低氧-缺血性损害，对它们既不注射溶媒也不注射E4 (假手术组，n=20和n=21分别用于S100B和GFAP)。在出生后第14天处死时抽取血样。进行针对S100B和GFAP蛋白的ELISA以检测S100B (A) GFAP (B)在血清中的浓度。全部测量结果表示为均值± SEM。

发明详述

如本文所用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括单数和复数所指事物二者，除非上下文中另外明确规定。

如本文所用的术语“包含”、“含有”和“具有”与“包括”、“包纳”或“容纳”、“包容”同义，并且是包含性的(inclusive)或开放式的(open-ended)和不排除另外的、未列举的成员、要素或方法步骤。该术语也包括“由…组成”和“基本由…组成”。

由端点界定的数字范围包括各范围内包含的全部数字和分数以及列举的端点。

如本文所用的术语“约”当指可测量的值例如参数、量、持续时间等时，意欲包括规定值的变化和偏离规定值的变化，特别是规定值和偏离规定值的+/-10%或更少，优选+/-5%或更少，更优选+/-1%或更少，和还更优选+/-0.1%或更少的变化，只要这样的变化适于实施所公开的发明。要理解的是，修饰词“约”所指的值是也特别地和优选地公开的其本身。

尽管术语“一个或多个”，例如一组成员的一个或多个成员本身是清楚的，但是作为进一步示例，该术语尤其包括对所述成员的任何一个，或对任何两个或更多个所述成员，例如任何≥3、≥4、≥5、≥6或≥7个等的所述成员，和至多全部所述成员的提及。

本说明书所引用的所有文件通过参考以其全文结合到本文中。

除非另外指明，用于公开本发明的全部术语，包括技术和科学术语，具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的意义。作为进一步指导，术语定义可包括在内以更好地理解本发明的讲述。当某些术语与特定的方面或实施方案联系起来解释或定义时，这样的内涵意欲应用于整个本说明书，即，也适用于其它方面或实施方案，除非另外指明或除非上下文另外明确规定。

本发明人发现雌四醇和相关的雌激素组分具有神经保护作用，如建立的大鼠幼仔的新生儿低氧-缺血性脑病模型中所说明的。他们也揭示雌四醇和相关的雌激素组分呈现出如在相同的新生儿低氧-缺血性脑病大鼠模型中所示的治疗作用。而且，他们发现雌四醇和相关的雌激素组分诱导或促进大鼠幼仔脑的神经形成和血管发生。

如本文所用的，术语“雌激素组分”指如在本文讲述的雌激素物质、其前体或一种或多种所述雌激素物质和/或前体的混合物。

在某些实施方案中，雌激素组分选自：

具有式(I)的雌激素物质，其中R₁是氢原子、羟基或具有1-5个碳原子的烷氧基；其中R₂是氢原子、羟基或具有1-5个碳原子的烷氧基；其中R₃是氢原子、羟基或具有1-5个碳原子的烷氧基；其中R₄是氢原子、羟基或具有1-5个碳原子的烷氧基；其中R₅是羟基；其中R₆是羟基；其中R₇是羟基；和其中R₁、R₂、R₃和R₄中不超过3个是氢原子；

雌激素物质的前体；和

一种或多种雌激素物质和/或前体的混合物。

在某些实施方案中，雌激素组分选自：

具有式(I)的雌激素物质，其中R₁是氢原子、羟基或具有1-5个碳原子的烷氧基；其中R₂是氢原子、羟基或具有1-5个碳原子的烷氧基；其中R₃是氢原子、羟基或具有1-5个碳原子的烷氧基；其中R₄是氢原子、羟基或具有1-5个碳原子的烷氧基；其中R₅是羟基；其中R₆是羟基；其中R₇是羟基；和其中R₁、R₂、R₃和R₄中的至少一个是羟基，或具有1-5个碳原子的烷氧基；

雌激素物质的前体；和

一种或多种雌激素物质和/或前体的混合物。

在实施方案中，雌激素组分选自：

具有式(III)的雌激素物质：

(III)

其中R₁是氢原子、羟，或具有1-5个碳原子的烷氧基；其中R₂是氢原子、羟基或具有1-5个碳原子的烷氧基；其中R₃是氢原子、羟基或具有1-5个碳原子的烷氧基；其中R₄是氢原子、羟基或具有1-5个碳原子的烷氧基；和

其中R₁、R₂、R₃和R₄中的至少一个是羟基，或具有1-5个碳原子的烷氧基；

雌激素物质的前体；和

一种或多种雌激素物质和/或前体的混合物。

措辞“具有1-5个碳原子的烷氧基”也可表示为“C_1-5烷氧基”或“C_1-5烷基氧基”并指具有式：-OR^a的基团，其中R^a是如在本文定义的C_1-5烷基。合适的C_1-5烷基氧基的非限定性实例包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基和戊氧基。

如在本文讲述的雌激素物质与通常应用于药物制剂的生物起源的和合成的雌激素二者的不同之处在于，类固醇骨架中的5元环包含至少3个而不是0-2个羟基取代基。

雌激素物质也包括其立体异构形式、其药学上可接受的加成盐、水合物和溶剂合物。

由式(I)和(III)代表的雌激素物质包括各种对映体，因为携带羟基取代基的碳原子，特别是R₅、R₆和R₇，是手性活性的。在优选的实施方案中，雌激素物质是15α-羟基取代的。在其它优选的实施方案中，所述物质是16α-羟基取代的。在还有的其它优选的实施方案中，所述物质是17β-羟基取代的。最优选雌激素物质是15α, 16α, 17β-三羟基取代的。如在本文讲述的雌激素物质的类固醇骨架的其它手性活性碳原子优选地具有与17β-雌二醇和其它生物起源的雌激素的相应的碳原子相同的构型。

优选地，如本文所用的雌激素物质是所谓的生物起源的雌激素，即，在人体内天然存在的雌激素。因为生物起源的雌激素天然存在于胎儿和雌性体内，预期副作用不会发生，特别是如果外源性给予这样的雌激素所产生的血清水平基本上不超过自然存在的浓度，则副作用不会发生。

在优选的实施方案中，R₁、R₂、R₃、R₄的至少一个，更优选就是一个代表羟基，意味着雌激素物质含有至少4个，更优选就是4个羟基。在雌激素物质含有4个羟基的情况下，它也可表示为四羟基化雌激素。

市售可获得的含有至少4个羟基的雌激素或其前体的非限定性实例是：1,3,5(10)-雌三烯-2,3,15α,16α,17β-五醇2-甲基醚；1,3,5(10)-雌三烯-2,3,15β,16α,17β-五醇2-甲基醚；1,3,5(10)-雌三烯-3,15α,16α,17β-四醇；1,3,5(10)-雌三烯-3,15α,16α,17β-四醇四乙酸酯；或1,3,5(10)-雌三烯-3,15β,16β,17β-四醇四乙酸酯。

在特别优选的实施方案中，雌激素物质是1,3,5(10)-雌三烯-3,15,16,17-四醇。

在更特别优选的实施方案中，雌激素物质是雌四醇。

“雌四醇”、“1,3,5(10)-雌三烯-3,15α,16α,17β-四醇”和“E₄“是同义的且在本文中可互换使用，指已知仅在怀孕期间由人胎儿肝脏自然产生的雌激素化合物，其是一种四羟基化雌激素，特征在于存在四个羟基, 因此其缩写词为E₄，其通式由式(II)代表：

(II)

本发明也包括如本文讲述的雌激素物质的前体的应用。这些前体能够释出雌激素物质，特别是当依据本发明使用时，例如作为代谢转化的结果。

优选地，这些前体是雌激素物质的衍生物，其中至少一个羟基的氢原子已被1-25个碳原子的烃羧酸、磺酸或氨基磺酸的酰基；四氢呋喃基；四氢吡喃基；或每个残基含有1-20个糖苷单位的直链或支链糖苷残基取代。

可依据本发明适当地使用的前体的非限定性实例是酯，其可通过雌激素物质的羟基与含有一个或多个羧基(M^+-OOC-)基团的物质反应而获得，其中M⁺代表氢或(碱)金属阳离子。因此，前体的特别优选的实例是雌激素物质的衍生物，其中式(I)或(II)或(III)中的至少一个羟基的氢原子已被-CO-R取代，其中R是含1-25个碳原子的烃基，优选R是氢，或含1-20个碳原子的烷基、烯基、环烷基或芳基。

术语“烷基”，作为基团或基团的一部分，在此指式C_nH_2n+1的烃基，其中n是范围从1至约25的数值。优选地，本文意图的烷基包含1至20个碳原子，例如1至10个碳原子，1至5个碳原子，1至4个碳原子，或1至3个碳原子，更优选1至2个碳原子。烷基可以是线性的或分支的并可如本文所示被取代。当本文在碳原子之后使用下标时，下标指所指定的基团可包含的碳原子数。因此，例如C_1-5烷基意指1-5个碳原子的烷基。烷基、特别是C_1-5烷基的实例是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、2-甲基丁基、戊基、异戊基及其异构体。

术语“烯基”，作为基团或基团的一部分指不饱和的烃基，其可以是线性的或分支的，包含一个或多个碳-碳双键。烯基可包含至少2个碳原子，例如从2至约25个碳原子，和如本文所用的优选地从2至约20个碳原子，例如从2至10个碳原子，从2至5个碳原子，从2至4个碳原子，或从2至3个碳原子。烯基的实例是乙烯基、2-丙烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、2-戊烯基及其异构体、2-己烯基及其异构体、2,4-戊二烯基等。

术语“环烷基”，作为基团或基团的一部分，指具有1个(即，单环)或多个例如2个(即，双环)环结构的饱和的或部分不饱和的烃基。多环环烷基的另外的环可稠合、桥接和/或通过一个或多个螺原子连接。环烷基可在环上独立地包含3个或更多个碳原子，例如从3至25个碳原子，优选从3至20个碳原子，更优选从3至8个碳原子，例如5、6或7个碳原子。优选地，如本文所意图的环烷基指单环环烷基并包含从3至20个碳原子。单环环烷基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。

术语“芳基”作为基团或基团的一部分指多不饱和的芳族烃基，其含有单个芳环(例如，苯基)或多个(例如，2、3或4个)稠合在一起的芳环(例如，萘基)或共价连接的芳环(例如，联苯基)。芳基在环上包含至少6个碳原子且优选6至约20个碳原子，更优选6至10个碳原子。芳基中的芳环可任选地包括一个或两个与之稠合的另外的环(环烷基、杂环基和/或杂芳基)。芳基的非限定性实例包括苯基、联苯基、5-或6-四氢萘基、1-, 2-, 3-, 4-,5-, 6-, 7-或8-甘菊环基、萘-1-或-2-基、4-, 5-, 6或7-茚基、1- 2-, 3-, 4-或5-苊烯基(acenaphtylenyl)、3-, 4-或5-苊基(acenaphtenyl)、1-, 2-, 3-, 4-或10-菲基、1-或2-并环戊二烯基、4-或5-茚满基、5-, 6-, 7-或8-四氢萘基、1,2,3,4-四氢萘基、1,4-二氢萘基、1-, 2-, 3-, 4-或5-芘基。

如所注明的，如本文讲述的雌激素组分可用于治疗受试者的神经障碍。

如本文所用的，术语“治疗”或“处理”指治疗性治疗和预防或防止措施二者，其中所述目标是防止或减缓(减少)不希望的生理学变化或障碍，例如神经障碍的发展。有益的或所需的临床结果包括但不限于预防障碍，减少障碍的发病率，缓解与障碍相关的症状，减轻障碍的程度，稳定(即，不恶化)障碍的状态，延迟或减慢障碍的进展，改善或减轻障碍的状态，消除疾病(无论是部分的或是全部)(无论是可检测的或是不可检测的)，或它们的组合。“治疗”也可意指与如果不接受治疗所期望的存活相比，延长存活。

在某些实施方案中，如本文讲述的雌激素组分可用于预防或防止性治疗神经障碍，即，其中所述受试者在尚未确诊患有神经障碍时(例如，在诊断之前)给予雌激素组分。例如，所述受试者可被认为面临招致/发展神经障碍的风险。因此，这样的治疗旨在预防神经障碍。

在优选的实施方案中，如本文讲述的雌激素组分可用于治疗性治疗神经障碍。因此，在优选的实施方案中, 本发明涉及如本文讲述的用于治疗神经障碍的雌激素组分，其中所述雌激素组分给予经诊断患有神经障碍的受试者。因此，这样的治疗旨在治疗已存在的神经障碍。

如本文所用的，术语“治疗性治疗”或“治疗”等，指这样的治疗，其中目标是使受试者身体或其成分从不需要的生理学改变或障碍例如神经障碍恢复到所需的状态，例如更少的严重性或不愉快的状态(例如，改善或减轻)，或回到其正常、健康的状态(例如，恢复受试者的健康、身体的完整性和身体的健康)，保持其(即，不恶化)处于所述不需要的生理学改变或障碍(例如，稳定作用)，或预防或减慢向更严重或更坏的状态进展(与所述不需要的生理学改变或障碍比较)。

除了在注明时，“受试者”或“患者”可互换使用并指动物，优选温血动物，更优选脊椎动物，甚至更优选哺乳动物，还更优选灵长类动物，且尤其包括人类患者和非人哺乳动物和灵长类动物。“哺乳动物”受试者指这样分类的任何动物并包括但不限于人、家养动物、商业动物、农用动物、动物园动物、运动动物、宠物和实验动物例如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、母牛；灵长类动物例如猿、猴、猩猩和黑猩猩；犬科动物例如狗和狼；猫科动物例如猫、狮子和老虎；马科动物例如马、驴和斑马；食用动物例如牛、猪和羊；有蹄类动物例如鹿和长颈鹿；啮齿动物例如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠；等等。优选的患者是人受试者。

如本文所用的，短语例如“需要治疗的受试者”包括将从治疗、优选治疗性治疗所述障碍、特别是神经障碍受益的受试者。这样的受试者可包括而不限于已经诊断患有所述障碍的那些、易于招致或发展所述障碍的那些和/或待预防所述障碍的那些。特别计划的是诊断患有神经障碍或待预防所述障碍的患者。

如本文所用的，术语“诊断”指确立和判定受到所述障碍、特别是神经障碍影响的受试者。诊断可基于检查与所述障碍有关的症状(例如，临床诊断)。作为备选或者另外，诊断可在可检查症状之前作出(即，临床前诊断)或由于症状是轻微的或不限于所述障碍，可通过例如检测表明所述障碍的生物标志物和/或成像技术而进行。

如本文所用的术语“治疗有效量”指如本文讲述的雌激素组分或药用组合物有效治疗受试者的神经障碍(即获得所需的局部或全身作用和性能)的量。因此该术语指雌激素组分或药用组合物在组织、系统、动物或人中引起生物学或医学反应的量，这样的反应是研究者、兽医、医生或其他临床医师正在寻找的。特别地，该术语指呈单剂量或者多个剂量的如本文讲述的雌激素组分或药用组合物预防、治愈、改善与神经障碍有关的临床损伤、症状或并发症或至少使所述临床损伤、症状或并发症最小化所必需的量。

如本文所用的，措辞“治疗神经障碍”例如治疗性治疗神经障碍，可包括保护以避免脑损伤或预防脑损伤(包括脑细胞完整性的破坏和/或脑细胞结构或功能的丧失)，减少脑损伤的程度，不恶化脑损伤或恢复脑损伤，并可进一步包括诱导或促进神经形成和/或血管发生。

在某些实施方案中，神经障碍的治疗例如神经障碍的治疗性治疗，包括保护以避免脑损伤,减少脑损伤的程度，不恶化脑损伤或恢复脑损伤。在特定的实施方案中，神经障碍的治疗性治疗包括不恶化脑损伤或恢复脑损伤。

在一实施方案中，神经障碍的治疗例如神经障碍的治疗性治疗包括促进神经形成、血管发生或神经形成和血管发生。

检查脑损伤、神经形成和血管发生的非限定性实例包括成像技术、特别是神经成像技术和检测和测量例如血清或脑脊液中的合适的生物标志物。合适的神经成像技术包括磁共振成像(MRI)和正电子发射断层成像术(PET)。脑损伤的合适的生物标志物包括例如S100B和胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)。检测和测量体液中的生物标志物的技术是众所周知的且包括例如酶联免疫吸附测定(ELISA)。

如本文所用的，术语"神经障碍"指影响中枢神经系统和/或外周神经系统的任何神经学疾病、神经学病症、神经学行为和/或任何与其相关的症状。

优选地，神经障碍可影响中枢神经系统，包括脑和脊髓，更优选其可能影响至少脑, 甚至更优选其可影响至少海马，例如至少海马和皮质。

术语“海马”和“海马结构”在本文作为同义词使用并指位于脑内侧颞叶的脑区域，其参与记忆及空间记忆和导航。脊哺乳动物具有两个海马，各在脑的每一侧，该术语包括两个海马。如本文所用的，海马指齿状回(DG)、海马角(CA)和下托。齿状回包括齿状筋膜(fascia dentata)、门、颗粒下区(SGZ)、粒细胞层和分子层。颗粒下区(SGZ)是位于DG的粒细胞层和门之间的细胞窄层。海马角(CA)区分为海马角1 (CA1)、海马角2 (CA2)、海马角3(CA3)和海马角4 (CA4)区域。神经障碍可影响这些区域中的至少一个、超过一个或所有，例如特别是，齿状回、海马角1、海马角2、海马角3或颗粒下区中的至少一个、超过一个或全部。

术语“皮质”和“大脑皮质”在此作为同义词使用并一般表示大脑的最外层的神经组织。皮质通常可以看作是由感觉、运动和联络区域组成。

神经障碍可影响皮质，例如皮质的任何区域，和特别是可影响初级体感皮质，更特别是影响与初级运动皮质连接的初级体感皮质的主干区。

待使用本文讲述的雌激素组分或药用组合物治疗的神经障碍可包括神经元功能障碍和/或变性、损害或丧失。优选地，待治疗的神经障碍包括神经元变性、损害或丧失，例如但不限于脑损伤、脊髓损伤或神经变性疾病。

示例性脑损伤包括但不限于低氧/缺氧性脑损伤，包括低氧-缺血性脑病(HIE)例如优选新生儿HIE，以及还有脑缺血或中风或创伤性脑损伤。

优选地，脑损伤例如低氧性脑损伤、缺氧性脑损伤或创伤性脑损伤影响至少海马，更优选地脑损伤破坏至少海马中的脑细胞完整性。

脊髓和相关神经节的示例性损伤包括但不限于脊髓灰质炎后综合征、创伤性损伤、手术损伤或麻痹性疾病。

所用术语“神经变性疾病或障碍”一般意指特征在于神经元的结构或功能的进行性丧失(包括神经元死亡)的神经障碍。

优选的示例性神经变性疾病包括但不限于以海马和/或皮质中神经元结构或功能的进行性丧失为特征的疾病，例如阿尔茨海默氏病(AD)、帕金森氏病(PD)、额颞叶性痴呆(FD) (其覆盖一定范围的病症，包括皮克病(Pick’s disease)、额叶变性)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)；以神经元的结构或功能的进行性丧失(包括基底神经节(特别是丘脑下核、黑质和苍白球)、脑干(特别是在核上性眼运动所位于的中脑部分)、小脑的齿状核中的神经元死亡)为特征的疾病，例如进行性核上性麻痹、纹状体黑质变性、皮质基底节变性、橄榄体脑桥小脑萎缩等。

神经变性疾病的其它实例包括但不限于阿尔茨海默氏病(AD)、帕金森氏病(PD)、额颞叶性痴呆(FTD)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、亨廷顿氏舞蹈病(HD)和其它多聚谷氨酰胺扩展疾病(polyglutamine expansion diseases)、皮克病、进行性核上性麻痹、纹状体黑质变性、皮质基底节变性、橄榄体脑桥小脑萎缩、利氏病(Leigh's disease)、婴儿坏死性脑脊髓病、亨特氏病(Hunter's disease)、粘多糖贮积病、各种脑白质营养不良(例如克拉伯病(Krabbe's disease)、佩梅病(Pelizaeus-Merzbacher disease)等)、黑蒙性(家族性)白痴、库夫病(Kuf's disease)、Spielmayer-Vogt病、泰-萨克斯病(Tay Sachs disease)、巴藤病(Batten disease)、詹-比二氏病(Jansky-Bielschowsky disease)、雷氏病(Reye'sdisease)、大脑共济失调、慢性酒精中毒、脚气病、哈-斯二氏综合征(Hallervorden-Spatzsydrome)、小脑变性等。

优选地，神经变性疾病是阿尔茨海默氏病(AD)或帕金森氏病(PD)。

在阿尔茨海默氏病中，海马是最先受到损害的脑区域之一(Hampel等 2008.Alzheimer & Dementia 4: 38-48)。因此，在某些实施方案中，如本文讲述的雌激素组分或药用组合物可特别适合于治疗、特别是治疗性治疗最早期AD、例如临床前阶段或最早临床期AD受试者。因此，在某些优选的实施方案中，待治疗的神经障碍是早期AD (即，临床前阶段或最早临床期AD)。

帕金森氏病也与海马损害有关。特别是，在患有表现出记忆受损的早期非痴呆性PD患者中(Brück等 2004. J Neurol Neurosurg Psychiatry 75: 1467-1469)和在患有具有轻度认知缺损或痴呆的PD的患者中(Camicioli等 2003. Mov Disorder 18: 784-790)观察到海马萎缩。因此，在某些优选的实施方案中，待治疗的神经障碍是早期非痴呆性PD或具有轻度认知缺损(MCI)的PD。

可使用本文讲述的雌激素组分或药用组合物治疗的进一步优选的示例性神经障碍可包括但不限于：脱髓鞘自身免疫障碍，例如多发性硬化；由中枢神经系统(CNS)的炎性疾病或感染性、病毒性疾病的感染引起的神经功能缺损，这样的疾病是AIDS脑病、脑炎后帕金森症、病毒性脑炎、细菌性脑膜炎或感染性疾病的其它CNS作用；皮质感官知觉障碍，例如前庭功能失调、平衡和协调障碍、头昏、步态问题、诵读困难、笨拙、听觉辨别和调节障碍、视力问题、眼运动和协调障碍或作为神经学疾病症状的感觉障碍；肠功能障碍，这样的是便秘或失禁；和膀胱控制障碍，这样的是作为CNS疾病症状的尿失禁；大脑麻痹后的呼吸功能障碍；引起异常血流至皮肤、异常性反应、勃起功能障碍、头痛、颈痛、背痛、在创伤情况下的脑脊髓病、体位性心动过速、直立不耐受、直立性低血压、晕厥、神经源性肠道和神经源性膀胱的自主神经功能障碍。

可使用本文讲述的雌激素组分或药用组合物治疗的示例性神经障碍可包括但不限于：脱髓鞘自身免疫障碍，例如多发性硬化；由炎性疾病感染引起的神经功能缺损，例如克-雅病(Creutzfeldt-Jacob disease)或中枢神经系统(CNS)的其它慢病毒感染性疾病、AIDS脑病、脑炎后帕金森症、病毒性脑炎、细菌性脑膜炎或感染性疾病的其它CNS作用；皮质运动功能障碍，例如痉挛状态、轻瘫、克隆(clones)或反射亢进；皮质感官知觉障碍，例如前庭功能失调、平衡和协调障碍、头昏、步态问题、诵读困难、笨拙、发育迟缓、听觉辨别和调节障碍、迟缓和机械的语言障碍、视力问题、眼运动和协调障碍或感觉障碍疾病；较低的颅神经功能障碍，例如语言、吞咽或平顺清晰的发音(smooth articulation)之间协调的缺乏；肠功能障碍，例如胃-食管括约肌控制问题；异常尿功能，例如遗尿、尿床或膀胱控制障碍；呼吸功能障碍，例如过度打鼾、阻塞性或中枢性呼吸暂停，或对氧和二氧化碳水平的异常呼吸反应；睡眠障碍性呼吸，如睡眠呼吸暂停，肌肉功能障碍，或婴儿猝死；发育障碍，例如小脑扁桃体下疝畸形(Chiari Malformation)；或先天性疾病，例如唐氏综合征(Down'sSyndrome)、莫尔基奥氏综合征(Morquio's syndrome)、脊椎骨骺发育不良(spondyloepiphysial dysplasia)、软骨发育不全或骨生成；神经行为障碍，例如注意缺陷障碍伴多动、心理问题(包括焦虑、双相性精神障碍、精神分裂症或抑郁症)、自闭症谱系障碍(autism spectrum disorder)(包括孤独症、阿斯伯格综合征(Asperger Syndrome)和未另外说明的普适行为障碍(pervasive behavioral disorder))；解剖学病症(anatomiccondition)，例如扁颅底(platybasia)、翻转齿突(retroflexed odontoid)、颅底凹陷(basilar invagination)和枕骨大孔狭窄(foramen magnum stenosis)；获得性骨软化病症，如佝偻病、佩吉特病(Paget's disease)或甲状旁腺功能亢进；骨代谢障碍；结缔组织疾病，包括活动过度的结缔组织疾病，例如埃-当二氏综合征(Ehlers Danlos Syndrome)；颈髓-延髓综合征(cervico-medullary syndrome)；肾、代谢性或内分泌综合征；引起异常血流至皮肤、异常性反应、GERDS、运动障碍、特发性脊柱侧凸、头痛、颈痛、背痛、头疼痛、在创伤情况下的脑脊髓病、肿瘤、体位性心动过速和延髓结局(bulbar findings)的自主神经功能障碍。

如在实验部分所示，如本文讲述的雌激素组分对在低氧-缺血后的脑损伤表现出治疗作用并促进神经形成和血管发生。因此，如本文讲述的雌激素组分或药用组合物可适用于治疗低氧性脑损伤、缺氧性脑损伤和/或创伤性脑损伤，其中所述雌激素组分或药用组合物在低氧、缺血和/或创伤后给予。特别地，如本文讲述的雌激素组分或药用组合物可适用于治疗低氧-缺血性脑病，例如优选新生儿低氧-缺血性脑病，其中所述雌激素组分或药用组合物在低氧-缺血后给予(即，治疗性治疗HIE)。优选地，雌激素组分或药用组合物低氧、缺血、创伤或低氧-缺血后尽可能早地给予受试者例如在人受试者，例如在低氧、缺血、创伤或低氧-缺血后12小时、9小时或6小时内给予，更优选在低氧、缺血、创伤或低氧-缺血后6小时内例如在5小时、4小时、3小时、2小时、1 小时、30分钟或15分钟内给予。

如上所注明的，如本文讲述的雌激素组分或药用组合物也可特别适用于治疗AD。例如，如本文讲述的雌激素组分或药用组合物可适用于预防性或防止性治疗AD，其中所述雌激素组分或药用组合物给予具有AD家族史的绝经期妇女。如本文讲述的雌激素组分或药用组合物也可适用于治疗性治疗早期AD，其中所述雌激素组分或药用组合物给予经诊断患有早期AD的患者。

早期AD的诊断可通过例如神经成像如MRI来实现，其中早期AD患者的特征在于海马结构的萎缩(Hampel等2008. 同上)。作为备选或者另外地，早期AD诊断可基于评价脑脊液中的生物标志物而确立，所述生物标志物有例如，β淀粉样蛋白42 (Aβ42)、β淀粉样蛋白40比率(Aβ40)、总τ蛋白、超磷酸化τ蛋白、β-分泌酶(BACE)或其任何组合(Hampel等 008.同上)。

如上所注明的，如本文讲述的雌激素组分或药用组合物也可特别适用于治疗早期非痴呆性PD或具有轻度认知缺损(MCI)的PD，更优选治疗性治疗早期非痴呆性PD或具有轻度认知缺损的PD，其中所述雌激素组分或药用组合物给予经诊断患有早期非痴呆性PD的患者，特别是经诊断患有早期非痴呆性PD的表现出记忆力受损的患者，或经诊断患有PD的具有MCI的患者。

患有早期非痴呆性PD的患者的诊断可基于任选地与神经成像技术例如MRI组合的PD的临床症状的检查，其中患有早期非痴呆性PD的患者具有至少两种选自震颤、强直和运动功能减退的PD症状。体积MRI成像可提供PD的痴呆的早期标志物，其中患有早期非痴呆性PD的患者和患有轻度认知缺损的PD患者以海马萎缩为特征。记忆力受损可通过神经心理测试例如用于口头记忆(VEM)的韦氏记忆等级修订的测试(Wechsler Memory Scale-Revisedtest)来评价。

本文讲述的雌激素组分可单独使用或与任何已知的用于神经障碍的疗法组合使用(“组合疗法”)。

如本文预期的组合疗法可包括给予至少一种如本文讲述的雌激素组分和至少一种其它药学或生物学活性成分。所述雌激素组分和所述药学或生物学活性成分可在相同或者分开的药用组合物中同时地、分开地或以任何次序相继地给予。

至少一种“其它药学或生物学活性成分”尤其指并非本文描述的雌激素组分的物质，其有效治疗神经障碍并且其与雌激素组分可产生协同作用或可不产生协同作用。适合于与本文讲述的雌激素组分组合给予尤其用于治疗HIE例如优选新生儿HIE的药学或生物学活性成分的非限定性实例，包括抗癫痫药、促红细胞生成素、褪黑激素和氙气。

本文也构思了给予至少一种如本文讲述的雌激素组分与适度降低体温(即，将体温降至33℃-34℃)的组合。这样的组合疗法可特别适用于治疗、优选治疗性治疗低氧-缺血性脑病(HIE)例如优选新生儿HIE。

如本文公开的雌激素组分可与一种或多种药学上可接受的载体/赋形剂一起配制成药用组合物或制剂。药用组合物可包含一种或多种如本文公开的雌激素组分。药用组合物也可进一步包含一种或多种如上限定的其它药学或生物学活性成分。因此，本文也公开包含如本文公开的雌激素组分的药用组合物。

如本文所用的的术语“药学上可接受的”与本领域的意义一致且意指与药用组合物的其它成分相容和对其接受者无害。

如本文所用的，“载体”或“赋形剂”包括任何和所有的溶剂、稀释剂、缓冲剂(例如，中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水，或任选的Tris-HCl、乙酸盐或磷酸盐缓冲剂)、增溶剂(例如，吐温80、聚山梨醇酯80)、胶体、分散媒介、溶媒、填充剂、螯合剂(例如，EDTA或谷胱甘肽)、氨基酸(例如，甘氨酸)、蛋白、崩解剂、粘合剂、润滑剂、湿润剂、稳定剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、调味剂、增香剂(aromatiser)、增稠剂、获得贮存作用的物质、包衣剂、抗真菌剂、防腐剂(例如，ThimerosalTM、苄醇)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、焦亚硫酸钠)、张力控制剂、吸收延迟剂、辅助剂、增量剂(例如，乳糖、甘露醇)等。用于配制药用组合物的这样的媒介和试剂的使用是本领域熟知的。除非任何常规媒介或试剂与活性成分不相容，否则可考虑其在治疗组合物中的使用。合适的药用载尤其描述于Remington's PharmaceuticalSciences, 第18版, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)中。

药用组合物可以本领域技术人员本身已知的方式制备。为此目的，至少一种如本文公开的雌激素组分、一种或多种固体或液体药用赋形剂以及需要时与一种或多种如上定义的其它药学或生物学活性成分组合产生合适的给药形式或剂型，然后其可用作人类医学或兽医学中的药物。载体或赋形剂或其它原料的准确性质将取决于给药途径。这样的合适的给药形式——其可以是固体、半固体，或液体(这取决于给药方式以及用于其制备的方法和载体)，对于技术人员而言将是清楚的；参考例如标准手册例如Remington’sPharmaceutical Sciences (见上)。

例如，如本文讲述的药用组合物可以胃肠外可接受的水性溶液的形式经胃肠外(例如经静脉内、大脑内、脑室内、肌内或皮下注射，或静脉内输注)给药，所述水性溶液为无热原的且具有合适的pH、等渗性和稳定性。或者，如本文讲述的药用组合物可例如以丸剂、片剂、漆片剂、糖衣片剂、颗粒剂、硬和软明胶胶囊、水性溶液、醇性溶液或油性溶液、糖浆剂、乳剂或混悬剂的形式经口服给药，或者例如以栓剂的形式经直肠给药，例如以软膏剂、酊剂、喷雾剂或透皮治疗系统(例如皮肤贴剂)的形式经皮或局部给药(包括眼部给予)，或以鼻喷雾剂或气溶胶混合物的形式经吸入给药，或者例如以微胶囊、植入物或棒(rod)的形式给药。

为生产丸剂、片剂、糖衣片剂和硬明胶胶囊，有可能使用例如乳糖、淀粉例如玉米淀粉或淀粉衍生物、滑石粉、硬脂酸或其盐等。用于软明胶胶囊和栓剂的载体为例如脂肪、蜡、半固体和液体多元醇、天然油或硬化油等。用于制备溶液例如注射用溶液或者乳剂或糖浆剂的合适载体为例如水、生理氯化钠溶液、醇例如乙醇、甘油、多元醇、蔗糖、转化糖、葡萄糖、甘露醇、植物油等。还可能的是冻干活性成分并使用所产生的冻干物，例如以制备用于注射或输注的制剂。用于微胶囊、植入物或棒的合适的载体为例如羟基乙酸和乳酸的共聚物。

对于口服给药形式，本发明的组合物可与合适的添加剂例如赋形剂、稳定剂或惰性稀释剂混合，和通过常规方法产生合适的给药形式，例如片剂、包衣片剂、硬胶囊、水性、醇性或油性溶液。合适的惰性载体的实例为阿拉伯胶、氧化镁、碳酸镁、磷酸钾、乳糖、葡萄糖或淀粉，特别是玉米淀粉。在这种情况下，可作为干颗粒和作为湿颗粒进行制备。合适的油性赋形剂或溶剂是植物油或动物油，例如葵花油或鱼肝油。用于水性溶液或醇性溶液的合适的溶剂是水、乙醇、糖溶液或其混合物。聚乙二醇和聚丙二醇也用作另外的辅助剂用于其它给药形式。作为即刻释放片剂，这些组合物可含有微晶纤维素、磷酸二钙、淀粉、硬脂酸镁和乳糖和/或本领域已知的其它赋形剂、粘合剂、增充剂、崩解剂、稀释剂和润滑剂。

口服给予的包含至少一种如本文公开的雌激素组分的药用组合物适合于通过将合适量的粉末状形式的所述组分均匀地和紧密地混合在一起(任选地也包括细分散的固体载体)，并将共混物封装在例如硬明胶胶囊中而完成。固体载体可包括一种或多种用作粘合剂、润滑剂、崩解剂、着色剂等的物质。合适的固体载体包括，例如，磷酸钙、硬脂酸镁、滑石粉、糖、乳糖、糊精、淀粉、明胶、纤维素、聚乙烯吡咯烷、低熔点蜡和离子交换树脂。

含有本文描述的药用组合物的压制片剂可通过均匀地和紧密地混合活性成分与例如上述的固体载体以提供具有必要压制特性的混合物，然后在合适的机器中将该混合物压实为所需的形状和大小来制备。模制片可通过在合适的机器中模压经惰性液体稀释剂湿润的粉末状活性成分的混合物制得。

当通过鼻气溶胶或吸入给药时，这些组合物可依据药物制剂领域熟知的技术制备并可使用苄醇或其它合适的防腐剂、提高生物利用度的吸收促进剂、碳氟化合物和/或被本领域已知的其它增溶剂或分散剂，制备为在盐水中的溶液剂。用于以气溶胶或喷雾剂形式给药的合适的药物制剂为例如本发明的化合物或其生理学可耐受的盐在药学上可接受的溶剂例如乙醇或水或这样的溶剂的混合物中的溶液剂、混悬剂或乳剂。如果需要，所述制剂也可另外地含有其它药用辅助剂例如表面活性剂、乳化剂和稳定剂以及抛射剂。

对于皮下或静脉内给药，将本文所述的雌激素组分与如果需要的话对此常规的物质例如增溶剂、乳化剂或另外的辅助剂，制成溶液剂、混悬剂或乳剂。活性成分也可冻干并使用获得的冻干物，例如，用于制备注射或输注制剂。合适的溶剂为例如水、生理盐水溶液或醇例如乙醇、丙醇、甘油，另外也为糖溶液例如葡萄糖或甘露醇溶液，或者所提及的各种溶剂的混合物。可注射溶液或混悬液可依据已知的技术，使用合适的无毒、胃肠外可接受的稀释剂或溶剂例如甘露醇、1,3-丁二醇、水、林格氏液(Ringer's solution)或等渗氯化钠溶液或合适的分散剂或湿润剂和助悬剂(例如无菌的、温和的固定油，包括合成的甘油一酯或甘油二酯，和脂肪酸，包括油酸)来配制。

当以栓剂的形式直肠给药时，这些制剂可通过使本文描述的雌激素组分与合适的非刺激性赋形剂例如可可酯、合成的甘油酯或聚乙二醇混合而制备，这些赋形剂在普通温度下为固体，但在直肠腔内液化和/或溶解以释放药物。

此类制剂的一些优选，但非限定的实例包括片剂、丸剂、粉末剂、锭剂、囊剂(sachet)、扁囊剂(cachet)、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、气溶胶、软膏剂、霜剂、洗剂、软和硬明胶胶囊、栓剂、滴剂、用于作为推注给予和/或连续给予的无菌注射溶液和无菌包装粉末(其通常在临用前重构)，这些制剂可用本身适合于这样的制剂的载体、赋形剂和稀释剂配制，例如乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、西黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、纤维素、(无菌)水、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯和羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁、食用油、植物油和矿物油或其合适的混合物。制剂可任选地含有其它药用活性物质(其可与本发明的化合物一起产生协同作用或可以不产生协同作用)和在药物制剂中通常使用的其它物质，例如润滑剂、湿润剂、乳化剂和助悬剂、分散剂、崩解剂、增量剂、填充剂、防腐剂、甜味剂、调味剂、流动调节剂、释放剂等。

可配制药用组合物以提供包含于其中的活性成分的快速的、持续的或延迟的释放，例如使用基于天然凝胶或合成的聚合物的脂质体或亲水聚合基质来进行。

任选地与一种或多种如上定义的其它药学或生物学活性成分组合的、如本文公开的雌激素组分所用的剂量或量，取决于个体病例并按照惯例应适应个体的情况以获得最佳作用。因此，其取决于待治疗疾病的性质和严重性，并且也取决于要治疗的人或动物的性别、年龄、体重、饮食、一般健康状况、个体的响应，取决于所用组分的效果、代谢稳定性和作用的持续时间，取决于给药方式和给药时间、排泄率，取决于疗法是否是紧急的或长期的或预防性的，或取决于除了雌激素组分之外是否还给予了如上定义的其它药学或生物学活性成分或应用的其它疗法。

在不限制的情况下，取决于疾病的类型和严重性，典型的日剂量可在从约1 µg/kg-约250 mg/kg体重或更大，例如从约1 µg/kg-约100 mg/kg体重，从约1 µg/kg-约50 mg/kg体重，从约1 µg/kg-约10 mg/kg体重，从约1 µg/kg-约1 mg/kg体重，从约1 µg/kg-约0.4mg/kg体重或从约5 µg/kg-约0.4 mg/kg体重范围内，这取决于以上提及的因素。优选地，日剂量可在从约0,5 mg/kg-约100 mg/kg体重，更优选从约1 mg/kg-约50 mg/kg体重，甚至更优选地从约2 mg/kg-约25 mg/kg体重，例如约5 mg/kg体重或10 mg/kg体重范围内。

对于在几天或更长的时间内重复给药，取决于病症，持续治疗直至疾病症状出现所需的抑制。雌激素组分优选的剂量可在从约0,05 mg/kg-约100 mg/kg体重，更优选从约0.1 mg/kg-约50 mg/kg体重，甚至更优选地从约1 mg/kg-约20 mg/kg体重范围内。因此，约0.1 mg/kg、0.5 mg/kg、1 mg/kg、2 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg或20 mg/kg (或其任何组合)的一个或多个剂量可给予患者。

其它可用的剂量(doseages)可在从约0.01-约20 mg/kg，例如从约0.05 mg/kg-约10 mg/kg范围内。因此，可给予患者约0.1 mg/kg、0.2 mg/kg、0.3 mg/kg、0.4 mg/kg、0.5mg/kg、1.0 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kg或10 mg/kg (或其任何组合)的一个或多个剂量。这样的剂量可作为单次日剂量给予，分成一个或多个日剂量，或基本上连续地给予例如使用点滴注射，或间歇地例如每周或每3周给予。

本文公开的药用制剂优选地呈单位剂型，并可适当地任选地与一或多页含有产品信息和/或用法说明的散页一起包装在例如盒、气泡罩、小瓶、瓶、小袋、安瓿中，或在任何其它合适的单剂量或多剂量储存器或容器(其可被适当地标记)中。一般地，这样的单位剂量将含有1和1000 mg之间，例如5和500 mg之间的至少一种本发明的雌激素组分，例如，每个单位剂量约10、25、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000 mg。

取决于给药模式，药用组合物将优选地包含从0.05-99 %重量，更优选从0.1-70 %重量，甚至更优选地从0.1-50 %重量的如本文描述的雌激素组分，和1-99.95 %重量，更优选从30-99.9 %重量, 甚至更优选地从50-99.9 %重量的药学上可接受的载体，全部百分率均基于组合物的总重量。

药用组合物可在疗程期间的不同时间分开给予或以分开或单一组合形式同时给予。本公开包括全部这样的同时或交替治疗的方案，并且应相应地解释术语“给药”。

给药可与食物例如高脂肪膳食一起进行。术语“与食物一起”意指在给予如本文所述的药用组合物期间或者之前或之后不超过约1小时进食。

实施例

实施例1: 实验程序

研究动物：

从Janvier (法国)获得Sprague-Dawley怀孕大鼠。分娩后新生的大鼠幼仔与其母鼠住在一起并通常于室温(25℃)在12-小时明-暗循环下饲养。所有实验方案经Liege大学伦理委员会批准。尽全部努力以使动物遭受的痛苦最小。

体内操作：

将新生大鼠幼仔分配到假手术组、溶媒组或E4组。

使雌四醇(E4)以不同的浓度溶于盐水溶液并将等体积(5µl/g)的溶液经腹膜内注射到来自E4组的幼鼠中。来自溶媒组的大鼠幼仔经腹膜内注射盐水溶液。来自假手术组的大鼠幼仔完全不进行注射。

通过包括左颈总动脉双重结扎和切断的外科手术来产生缺血；通过在降低浓度的氧下吸入用氮平衡的11%-8%的氧20分钟，接着以恒定的浓度吸入8%氧和92%氮35分钟来产生低氧。假手术组未经受低氧-缺血性损害。

所有操作在37℃进行。

大鼠幼仔直肠温度的测量：

大鼠幼仔的直肠温度用多用途温度计(BAT-10R, Physitemp Instruments Inc.,Clifton, NJ, US)与直肠探针(RET-4, BioMedical Instruments, Zollnitz, 德国)一起在暴露于低氧性损害后0、2和4小时时测量。为保持温度低的可变性，直肠温度的测量在幼鼠从鼠窝移出后15分钟于25℃室内进行(除了第1次低氧后测量立即进行外)。已表明直肠温度很好地对应脑心温度(Thoresen等 1996. Arch Dis Child Fetal Neonatal 74: F3-F9, Yager等 1993. Pediatr Res 34: 525-529)。

制备血和脑样本：

在出生后第14天处死大鼠幼仔。用过量的戊巴比妥钠(100 mg/kg, ip)深度麻醉动物。

抽血、离心并将血清样本于-80℃贮存。

然后，于4℃用0.9%盐水溶液对动物进行穿心灌注(perfused transcardially)，然后于4℃用在0.1-mol/L磷酸盐缓冲的盐水溶液(pH 7.4)中的4%多聚甲醛灌注。快速分离脑，称重并于4℃的相同固定溶液中浸泡24小时，用分级系列的乙醇和二甲苯脱水，并包埋在石蜡中。

苏木精-伊红染色(组织化学)：

根据Paxinos大鼠脑图谱集(brain atlas) (Paxinos和Watson 2007. 载于：Therat brain in stereotaxic coordinates (立体定位坐标的大鼠脑), 第6版)，将移出的脑的多聚甲醛固定的石蜡包埋样本在相同水平的海马区进行冠状切片。切片的厚度为5 µM。进行苏木精-伊红染色。简言之，在二甲苯中使切片脱去石蜡并在分级的乙醇浓度中再水合，然后染色。用苏木精染色载玻片，在水中漂洗数秒钟，然后置于1%伊红中并洗涤、脱水和盖上盖玻片。

完整细胞计数：

在大鼠幼仔脑的苏木精-伊红染色的切片上，以放大400x的各个脑区域的3个视野中进行完整细胞计数。在皮质和海马(区域：齿状回(DG)、颗粒下区(SGZ)、海马角(CA1,CA2/CA3))中进行计数。借助于显微镜(Olympus BX51, Olympus, Tokyo, 日本)、图像扫描仪(DotSlide Digital Virtual Microscopy, Olympus, 德国)和ImageJ软件(NIH, US)分析切片。

完整细胞是未受损伤的。损伤的细胞的特征在于苍白的嗜曙红细胞染色伴有非均匀的核密度——皱缩、压缩的或苍白和扩大的。

微管相关蛋白2 (MAP2)染色：

处理脑切片以用于神经元细胞骨架分裂的免疫组织化学检测。对于抗原回收，将切片在10 mmol/L柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中，于100℃加热10分钟。用3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性10分钟并在用5%正常山羊血清第二次阻断后，将切片与按1:1000稀释的抗微管相关蛋白2 (MAP2)抗体(小鼠单克隆抗体；Sigma, St. Louis, Missouri, US)一起于室温温育1h。冲洗后，加入生物素化的山羊抗小鼠免疫球蛋白G (VectorLaboratories, Burlingame, California)，并用抗生物素蛋白–生物素复合物方法(Vector Laboratories)，用3,3’-二氨基联苯胺(DAB)作为色原体进行抗体检测。在与DAB反应后，将载玻片洗涤、脱水和盖上盖玻片。

借助于图像扫描仪(Nanozoomer Virtual Microscopy, Hamamatsu, Tokyo, 日本)和ImageJ软件(NIH, US)分析样本。测量同侧和对侧半球的MAP2阳性面积。MAP2阳性面积的比率计算为同侧半球的MAP2阳性面积除以对侧半球的MAP2阳性面积。考虑将假手术组的MAP2阳性面积的比率默认为1.0。

双皮层蛋白-血管内皮生长因子双染色：

将切片在10 mmol/L柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中，于100℃加热10分钟。用3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性10分钟并在用5%正常山羊血清第二次阻断后，将切片与按1:1000稀释的抗双皮层蛋白(DCX)抗体(兔多克隆抗体；Abcam, Cambridge, UK)和按1:100稀释的抗血管内皮生长因子(VEGF)抗体(小鼠单克隆抗体；Abcam, Cambridge, UK)一起于4℃温育过夜。淋洗后，加入按1:1000稀释的Alexa Fluor山羊抗兔和按1:1000稀释的Alexa Fluor山羊抗小鼠(Invitrogen Inc., Ghent, Belgium)并将切片于室温温育1h。使用含有4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的封闭介质(Mounting medium)用于荧光研究(Vector Laboratories)。借助于显微镜(Olympus Vanox AHBT3, Olympus)和ImageJ软件(NIH)分析样本。阳性染色细胞的百分率量化为阳性染色的DCX或VEGF细胞的总和除以DAPI阳性细胞的总数，以百分率表示。

在血清样本中检测S100B和胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)：

依据制造商的建议，进行ELISA以检测血清样本中的脑损伤标志物S100B蛋白(Catalog# CSB-E08066r, Cusabio Biotech Co., LTD, 中国)，和胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP) (Catalog# E90068Ra, Uscn Life sciences Inc., 中国)。

统计学分析：

使用StatView软件(Abacus Concepts, Inc., Berkeley, CA, US)进行分析。统计学比较使用ANOVA进行，接着使用Fisher’s PLSD、Scheffe’s和Bonferroni/Dunn事后检验进行，P < 0.05视为表示显著。全部值表示为均值± SEM。

实施例2：雌四醇在新生儿低氧-缺血性脑病的动物模型中的神经保护作用

分娩后，将新生大鼠幼仔分配给以下4组之一：假手术组、溶媒组、E4 5 mg/kg/每天组和E4 50 mg/kg/每天组。从第4天至第7天(包括第4天和第7天)对大鼠幼仔腹膜内注射溶媒(溶媒组)或E4 (5mg/kg或50 mg/kg，根据组的分配)或完全不进行注射(假手术组)。在第7天, 在最后的注射后30分钟，使来自溶媒和E4 (5 mg/kg或50 mg/kg)组的动物通过包括左颈总动脉双重结扎和切断的手术，接着通过在降低浓度下吸入用氮平衡的11%-8%的氧达20分钟，接着以恒定的浓度吸入8%氧和92%氮达35分钟而产生低氧。假手术组通过类似的操作进行，但不经历左颈总动脉结扎和低氧。全部操作在37℃进行。大鼠幼仔与其母鼠一起恢复直至在出生后第14天被处死。

大鼠幼仔重量

从第4天至第7天对大鼠幼仔重量进行测量，以确定注射所需的溶媒和E4的量，并从第7天直至最多第14天测量重量，以监测大鼠幼仔术后健康状况。

在术后第13和14天，E4 5mg/kg处理的大鼠幼仔具有比溶媒处理的动物显著更高的体重，而在其它术后天数，假手术操作组具有比其它组显著更高的体重：第8天(假手术对比溶媒和E4 5 mg/kg)、第10天(假手术对比E4 50 mg/kg)、第12天(假手术对比溶媒)、第13天(假手术对比溶媒)和第14天(假手术对比溶媒) (图1)。

脑重

脑重的测量揭示在E4 5 mg/kg和假手术操作组中的脑重显著大于溶媒处理的组(图2)。

苏木精-伊红染色(组织化学)：

只有来自溶媒处理的组的切片显示出与损伤同侧的海马区的可见组织破坏(左侧)，被扩展到与损伤对侧的海马区的梗死区域围绕(右侧) (图3)。这些结果显示E4在两种剂量下具有神经保护作用。

完整细胞计数：

在海马的DG区，每个视野的完整细胞数在E4 5 mg/kg和实施假手术的动物组显著高于溶媒组(图4)。在SGZ中，在单用E4 5 mg/kg的组中的完整细胞数显著高于假手术和溶媒组，而在CA1中，在各研究组中未检测到显著的差异。在海马CA2/CA3区中，单用E4 50 mg/kg的组的完整细胞数显著高于溶媒处理的组和E4 5 mg/kg组，而在皮质中，E4 50 mg/kg组的完整细胞数显著高于单用溶媒的组。这些结果显示雌四醇具有神经保护作用。

实施例3：雌四醇在新生儿低氧-缺血性脑病动物模型中的神经保护作用

将新生大鼠幼仔自出生后第4天开始分配到以下6个组之一中：假手术组(n=24)、溶媒组(n=14)、E4 1 mg/kg/每天组(n=11)、E4 5 mg/kg/每天组(n=14)、E4 10 mg/kg/每天组(n=14)或E4 50 mg/kg/每天组(n=19)。自出生后的第4天，对大鼠幼仔腹膜内注射溶媒(溶媒组)或E4 (1、5、10或50 mg/kg/每天，根据E4组的分配)或既不注射溶媒也不注射E4(假手术组)。在第7天，在最后的注射后30分钟，用异氟烷(诱导，3.0%；维持，1.5%)麻醉动物，并使来自溶媒和E4组的大鼠幼仔通过包括左颈总动脉双重结扎和切断的手术。手术后，使幼鼠返回到其母鼠身边并允许恢复1小时。然后将幼鼠置于加湿的低氧性体内小室(CoyLab, Grass Lake, MI, USA)。通过在降低浓度的氧下，吸入用氮平衡的11%-8%的氧20分钟，接着以恒定的浓度吸入8%氧和92%氮35分钟而产生低氧。全部操作在37℃进行。假手术组通过类似的操作进行，但不经历左颈总动脉结扎和随后的低氧，也不注射。大鼠幼仔与其母鼠一起恢复并正常饲养直至在出生后第14天被处死。

直肠温度：

直肠温度在各研究组之间没有显著的差异，表明雌四醇预处理不影响体温(数据未显示)。

体重

为监测因进行的操作和雌四醇预处理所致的大鼠幼仔的术后健康状况，监测自出生后第7天至第14天(包括第7天和第14天)的体重。图5显示在出生后第8天和第13天实施假手术的和雌四醇预处理的大鼠幼仔具有比溶媒预处理的动物显著更高的术后体重。而且，在出生后第9天实施假手术的和10mg/kg雌四醇预处理的动物具有比溶媒组显著更高的体重，而在出生后第10、11和12天实施假手术的、1 mg/kg和10 mg/kg雌四醇预处理的大鼠幼仔显示出比溶媒组显著更高的体重。在出生后第14天，假手术和1 mg/kg、5 mg/kg和10 mg/kg雌四醇预处理的动物具有比单用溶媒的组显著更高的体重。然而，在出生后第8、9、10、12天实施假手术的动物的体重显著高于5 mg/kg和50 mg/kg雌四醇预处理的组，而在出生后第11、13、14天实施假手术的动物具有比单用50 mg/kg雌四醇预处理的组显著更高的体重。

脑重

为评价可能的脑损伤，进行大鼠幼仔脑的测量。图6证实假手术组(1.225±0.006g)和1 mg/kg E4 (1.155±0.022 g)、5 mg/kg E4 (1.181±0.023 g)、10 mg/kg E4(1.179±0.012 g)和50 mg/kg E4 (1.163±0.016 g)预处理组的脑重显著高于溶媒组(1.016±0.042 g)。

苏木精-伊红染色和完整细胞计数：

得自溶媒预处理的大鼠幼仔的脑切片显示出扩大到皮质的与损伤同侧(左侧)的海马区的可见组织破坏和损伤(图7 A-C)。

在海马的DG区，每个视野的完整细胞数在实施假手术的动物(154.5±7.942) (图7B(a))和用5 mg/kg E4注射的动物(121.0±8.098) (图7B(d))显著高于溶媒组(84.563±5.954) (图7B(b)) (图7D)。而且，SGZ的完整细胞数在假手术组(58.357±3.653) (图7B(a))、5 mg/kg E4组(42.846± 3.884) (图7B(d))和10 mg/kg E4组(47.6± 4.672) (图7B(e))显著高于溶媒组(23.875±3.363) (图7B(b)) (图7D)，而在相同的区中，假手术组显示出比1 mg/kg E4组(35.6±2.75) (图7B(c))和50 mg/kg E4组(30.714±3.615) (图7B(f)) (图7D)显著更高的完整细胞数。在CA1区中，在假手术组(70.714± 4.819) (图7B(a))，和1 mg/kg E4 (43.2± 2.435) (图7B(c))和10 mg/kg E4 (57.4±4.566) (图7B(e))组中检测到显著的差异，而其它组未显示出显著的差异(图7D)。在海马的CA2/CA3区中，假手术(56.929±4.859) (图7B(a))和50 mg/kg E4 (53.0±4.7) (图7B(f))组具有比溶媒组(29± 3.543)显著更高的完整细胞数(图7B(b))，而单独的假手术组具有比1 mg/kgE4组(32.8±2.808)显著更高的完整细胞数(图7B(c)) (图7D)。在皮质中，50 mg/kg E4组(76.286±3.962) (图7C(f))显示出比单独的溶媒组(51.938± 5.304) (图7C(b))显著更高的完整细胞数(Fig. 7D)。

MAP2染色：

如在出生后第14天低氧-缺血(HI)后所测定的同侧MAP2染色的丧失被用作早期灰质区域丧失的标志物。用MAP2染色显示具有完整神经元的区域，而MAP2染色的丧失显示梗死的区域。具体而言，在溶媒组中，存在扩大到皮质的与损伤半球同侧的海马区域中的MAP2染色的丧失(图8A(b))。MAP2-阳性面积的比率的量化揭示雌四醇预处理(图8B)后MAP2-阳性面积的比率在实施假手术的动物(默认值1.0) (图8A(a))和雌四醇预处理组(1 mg/kgE4 (0.929±0.019) (图8A(c))、5 mg/kg E4 0.889±0.063 (图8A(d))、10 mg.kg E4(0.898±0.022) (图8A(e))、50mg/kg E4 (0.922±0.031) (图8A(f)))中显著高于溶媒组(0.675±0.046) (图8A(b))。

双皮层蛋白-血管内皮生长因子双染色：

在出生后第14天DCX和VEGF的表达被分别用作神经形成和血管发生的标志物。雌四醇预处理导致用10 mg/kg E4预处理的动物(55.8±5.658%)中海马DG区的DCX阳性染色细胞的百分率显著高于溶媒组(32.833±2.625%) (图9A)，而在相同的区中，VEGF阳性染色细胞的百分率在用1 mg/kg E4 (43.5±2.083%)、5 mg/kg E4 (46.0±4.361%)、10 mg/kgE4 (47.0± 5.362%)和50 mg/kg E4 (46.0±4.465%)预处理的组中显著高于溶媒组(25.333±2.271%) (图9B)。而且，在CA1区中，DCX阳性染色细胞的百分率在5 mg/kg E4(35.2± 3.309%)和10 mg/kg E4 (34.1± 6.664%)组中显著高于溶媒组(11± 1.518%)(图9A)，而VEGF阳性染色细胞的百分率显著高于单用10 mg/kg E4的组(37.4± 7.645%)(图9B)。在CA2/CA3区中，5 mg/kg E4组(30.3± 3.7%)的DCX阳性染色细胞的百分率显著高于溶媒组(6.417± 1.033%)，而VEGF阳性染色细胞的百分率仅仅在1 mg/kg E4组(34.1±6.855%)达到显著的差异(图9B)。在皮质中，在10 mg/kg E4组(分别为52.1±7.762%和46.2± 7.646%)中的DCX和VEGF阳性染色细胞的百分率显著高于单用溶媒的组(分别为26.0±4.156%和20.5±2.414%) (分别为图9A-B)。

血清S100B和胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)：

采用S100B和胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)作为脑损伤的标志物。其在血清中的浓度通过针对S100B和GFAP蛋白的ELISA测定。如在图10A中所示的，在雌四醇预处理后，实施假手术的动物(344.614±50.328 pg/ml)和50 mg/kg E4组(361±32.914 pg/ml)的S100B浓度显著低于溶媒预处理的动物(698.925±57.342 pg/ml)，虽然10 mg/kg E4组中的S100B浓度显著高于假手术、5 mg/kg E4和50 mg/kg E4组。

图10B显示在实施假手术的动物(407,567±49.258 pg/ml)和用50 mg/kg E4预处理的动物(300.388±31.232 pg/ml)中观察到的GFAP浓度显著低于溶媒组(1003.926±288.345 pg/ml)。

结论：

本结果证实雌四醇在HIE动物模型中的海马结构和皮质中具有神经保护的剂量依赖性作用。而且根据本结果，雌四醇预处理减少早期灰质丧失和促进神经形成和血管发生。而且，雌四醇预处理对体重、脑重或体温没有不利作用。

实施例4: 雌四醇在新生儿低氧-缺血性脑病动物模型中的治疗作用

为研究雌四醇的治疗作用，将新生大鼠幼仔在出生后的第7天分配到以下6个组之一中：假手术组(n=29)、溶媒组(n=20)、1 mg/kg E4组(n=16)、5 mg/kg E4组(n=19)、10 mg/kg天E4 (n=17)和50 mg/kg天E4组(n=15)。在出生后的第7天，用异氟烷(诱导，3.0%；维持，1.5%)麻醉动物，并使来自溶媒和E4组的大鼠幼仔通过包括左颈总动脉双重结扎和切断的手术。手术后，使幼鼠返回到其母鼠身边并允许恢复1小时。然后将幼鼠置于加湿的低氧性体内小室(CoyLab)。通过在降低浓度的氧下吸入用氮平衡的11%-8%的氧20分钟，接着以恒定的浓度吸入8%氧和92%氮35分钟而产生低氧。全部操作在37℃进行。

在从低氧室恢复后，根据组的分配，对大鼠幼仔用溶媒(溶媒组)或用E4 (1 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg或50 mg/kg)进行腹膜内注射。来自假手术组的动物通过类似的操作，但既不进行左颈总动脉结扎和切断以及随后的低氧，也不给予溶媒或雌四醇。大鼠幼仔与其母鼠一起恢复直至在出生后第14天被处死

直肠温度：

直肠温度在各研究组之间没有显著的差异，表明雌四醇处理不影响体温(数据未显示)。

体重

为评价因进行的操作和雌四醇处理所致的大鼠幼仔的术后健康状况，测量在出生后第7天和第14天的术后体重。图11显示在出生后第14天实施假手术的动物和来自1 mg/kgE4、5 mg/kg E4、10 mg/kg E4和50 mg/kg E4组的动物具有比溶媒组显著更高的体重。实施假手术的动物显示出比5 mg/kg E4处理组显著更高的体重。

脑重

图12证实在实施假手术的动物(1.214±0.007 g)和1 mg/kg E4 (1.099±0.037g)、5 mg/kg E4 (1.06±0.035 g)、10 mg/kg E4 (1.12±0.33 g)和50 mg/kg E4 (1.163±0.025 g)组中的脑重显著高于溶媒组(0.937±0.022 g)。实施假手术的动物显示出比5mg/kg E4组显著更高的脑重。这种结果模式与实施例3的相同。

苏木精-伊红染色和完整细胞计数：

在海马的DG和SGZ区，每个视野的完整细胞数在实施假手术的动物(图13B(a))显著高于来自溶媒组的动物(图13B(b)) (分别为160.8±7.074对比88.2±19.477，和60.8±4.635对比28.3±6.73) (图13D)。在CA1区中，在假手术组(69.4± 5.256) (图13B(a))和1mg/kg E4组(51.5± 2.5) (图13B(c))中的完整细胞数显著高于溶媒组(28.4± 6.997)(图13B(b))，假手术组中的完整细胞数显著高于5 mg/kg E4组(45.3±2.989) (图13B(d))、10 mg/kg E4组(46.0±3.19) (图13B(e))和50 mg/kg E4组(46.6±5.336) (图13B(f)) (图13D)。在海马的CA2/CA3区中，实施假手术的动物(57.1± 6.192) (图13B(a))和用10 mg/kg E4 (35.2± 3.169)处理的动物(图13B(e))具有比溶媒组(13.8±3.018)显著更高的完整细胞数，而假手术组具有比1 mg/kg E4 (33.9±4.306)、5 mg/kg E4 (33.8±4.704)、10 mg/kg E4 (35.2±3.169)和50 mg/kg E4 (30.5±2.527)组显著更高的完整细胞数(图13D)。在皮质中，实施假手术的动物(70.1± 6.165) (图13C(a))和用5 mg/kg E4(57.1± 7.012) (图13C(d))、10 mg/kg E4 (56.9± 5.958) (图13C(e))和50 mg/kg E4(54.5± 3.403) (图13C(f))处理的动物显示出比溶媒组(23.2±3.872) (图13C(b))显著更高的完整细胞数，而假手术组具有比1 mg/kg E4组(42.4±4.865) (图13C(c))显著更高的完整细胞数(图13D)。

MAP2染色：

观察到与在实施例3中相同模式的MAP2染色。MAP2-阳性面积的比率的量化(图14B)揭示在实施假手术的动物(默认值1.0) (图14A(a))和雌四醇处理组(1 mg/kg E4(0.943±0.028) (图14A(c))、5 mg/kg E4 0.89±0.037 (图143A(d))、10 mg/kg E4(0.938±0.044) (图14A(e))、50 mg/kg E4 (0.966±0.036) (图14A(f)))中的MAP2-阳性面积的比率显著高于溶媒组(0.656±0.091) (图14A(b))。

双皮层蛋白-血管内皮生长因子双染色:

在海马的DG区中，无论是DCX或是VEGF染色在各研究组中均无显著性差异(图15)。在CA1区中，在10 mg/kg E4组(37.1± 3.84)和50 mg/kg E4组(37.3± 4.784%)中的DCX阳性染色细胞的百分率显著高于溶媒组(12.8±2.947%) (图15 A)，而VEGF阳性染色细胞的百分率在5 mg/kg E4组(37.4±4.833%)、10 mg/kg E4组(37.1±3.84%)和50 mg/kg E4组(45.1±4.753%)中显著高于溶媒处理的动物(15.7± 4.924%) (图15B)。在CA2/CA3区中，在10 mg/kg E4组(42.5±5.986%)中的DCX阳性染色细胞的百分率显著高于溶媒处理的动物(10.4± 2.868%) (图15A)，而VEGF阳性染色细胞的百分率在各研究组之间没有显著性差异(图15B)。在皮质中，在5 mg/kg E4组(45.2±3.339%)、10 mg/kg E4组(49.4±4.949%)和50 mg/kg E4组(49.6± 3.11%)中的DCX阳性染色细胞的百分率显著高于溶媒组(23.3±4.74%) (图15A)，而VEGF阳性染色细胞的百分率在实施假手术的动物(24.6±3.7%)中显著低于10 mg/kg E4处理组(49.4±4.949%) (图15B)。

血清S100B和胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)：

如图16中所示，在实施假手术的动物和雌四醇治疗动物中观察到比来自溶媒组动物显著更低的S100B和GFAP蛋白的表达。

结论：

本结果证实雌四醇在HIE动物模型中的海马结构和皮质中具有治疗性剂量依赖性作用。而且根据本结果，雌四醇处理减少早期灰质丧失和促进神经形成和血管发生。而且，雌四醇处理对体重、脑重或体温没有不利作用。

实施例5: 围产期或新生儿窒息后雌四醇在新生儿中的治疗作用

用雌四醇治疗患有出生窒息和表现出至少一个以下症状的新生儿：降低的意识和酸中毒(pH < 7.00或碱缺乏 ≥ 12)，10-分钟阿普加评分≤ 5，或在10分钟的正在进行的复苏。

在出生后6小时内，作为单次注射或通过输注，静脉内给予5 mg/kg体重或10 mg/kg体重的剂量的雌四醇。可重复剂量。

任选地，新生儿可在出生后6小时内开始同时地经受降低体温72小时。

Claims (5)

1.雌激素组分在制备用于治疗海马区的脑损伤的药物中的用途，其中所述雌激素组分选自：

具有式(I)的雌激素物质：

(I)

其中R₁、R₂、R₃、R₄各自独立地是氢原子、羟基或具有1-5个碳原子的烷氧基；其中R₅、R₆、R₇中的每一个是羟基；和其中R₁、R₂、R₃、R₄中不超过3个是氢原子；

雌激素物质的前体，其中所述前体是雌激素物质的衍生物，其中至少一个羟基的氢原子已被1-25个碳原子的烃羧酸、磺酸或氨基磺酸的酰基；四氢呋喃基；四氢吡喃基；或每个残基含有1-20个糖苷单位的直链或支链糖苷残基取代；和

一种或多种雌激素物质和/或前体的混合物，

其中所述雌激素组分是1,3,5(10)-雌三烯-3,15α,16α,17β-四醇(雌四醇)。

2.权利要求1的用途，其中所述脑损伤的治疗是治疗性的。

3.权利要求1或2的用途，其中所述脑损伤选自低氧性脑损伤、缺氧性脑损伤和创伤性脑损伤。

4.权利要求1-3的任何一项的雌激素组分在制备用于治疗低氧-缺血性脑病(HIE)的药物中的用途。

5.权利要求1-3的任何一项的雌激素组分在制备用于治疗新生儿低氧-缺血性脑病(HIE)的药物中的用途。