CN104360050B - 一种淋巴细胞免疫分型的方法和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明属于免疫学技术领域，公开了一种淋巴细胞免疫分型的方法和试剂盒。本发明提供的淋巴细胞免疫分型的方法，包括：T淋巴细胞免疫分型和B淋巴细胞免疫分型；T淋巴细胞免疫分型包括：取不同的荧光标记的抗体，与待检测样品混合，孵育后，经流式细胞术检测，得检测数据，分析所述检测数据；B淋巴细胞免疫分型包括：取不同的荧光标记的抗体，与新的所述待检测样品混合，孵育后，经流式细胞术检测，得检测数据，分析所述检测数据。本发明的方法实现了对淋巴细胞进行更加全面的精细免疫分型，所需待测样品少，操作简单、所需时间短、准确性高、可广泛应用于淋巴细胞亚群免疫分型。

Description

一种淋巴细胞免疫分型的方法和试剂盒
技术领域
本发明属于免疫学技术领域，特别涉及一种淋巴细胞免疫分型的方法和试剂盒。
背景技术
淋巴细胞(lymphocyte)也称淋巴球，为白细胞中体积最小的一种，直径6-8微米；在人体约占白细胞数目的20％-30％，圆形细胞核，细胞质很少；由淋巴器官产生，是机体免疫应答功能的重要细胞成分，是一类具有免疫识别功能的细胞系。淋巴细胞是复杂的异质性细胞群体，根据其表型和功能特征可分为不同类别，如T细胞、B细胞、NK细胞等，这些细胞还可以进一步分为若干亚群。淋巴细胞及其亚群在免疫应答过程中相互协作、相互制约，共同完成对抗原物质的识别、应答和清除，从而维持机体内环境稳定。
早期研究根据淋巴细胞按其发生迁移、表面分子和功能的不同，大体上将淋巴细胞分为T细胞、B细胞和自然杀伤(NK)细胞。其中T细胞可分为细胞毒性T细胞(cytotoxicTlymphocyte，Tc)、辅助T细胞(helperTlymphocyte，Th)、记忆T细胞(memoryTlymphocyte，Tm)和调节/抑制T细胞(regulatory/suppressorTlymphocyte)；B细胞可进一步分为记忆B细胞(memoryBcell)、浆细胞(plasmacell)、初始B细胞(Bcell)等亚类。
随着科学研究的不断进步，科学家发现了更多的细胞表面标志，可以将各类淋巴细胞进行更加精细的细胞亚群分类。例如，可以将T细胞进一步划分为：TCRαβ+双阴性T细胞(doublenegativeTlymphocyte，DNT)、γδT细胞、辅助初始T细胞、辅助耗竭T细胞、辅助中心记忆T细胞、辅助效应记忆T细胞、细胞毒性初始T细胞、细胞毒性耗竭T细胞、细胞毒性中心记忆T细胞、细胞毒性效应记忆T细胞。
血液样品中淋巴细胞的种类与机体的免疫系统性能有着重要关系。通过对血液样品中淋巴细胞进行免疫分型和定量分析，能够更加准确地评价机体的免疫功能，也能够更好地研究某些疾病的发生、发展以及治疗效果评价。目前，常用于血液样品中的淋巴细胞免疫分型和定量分析的方法主要有：免疫酶标法、普通淋巴细胞分类、较细淋巴细胞亚群检测。免疫酶标法只是针对某一种或一类特定的抗原或抗体发生特异反应，检测面窄、操作复杂、对待检测样品需求量大，费时费力。普通淋巴细胞分类，普遍应用于淋巴细胞检测，但只能将淋巴细胞分为T细胞、Tc细胞、Th细胞、B细胞和NK细胞，不能进一步对细胞进行分型。较细淋巴细胞亚群检测依赖于流式细胞术，采用多色流式的方法，对淋巴细胞进行较为详细的分型，除传统的T细胞、Tc细胞、Th细胞、B细胞和NK细胞外，还检测Tm细胞及细胞数量。但是，如果想进一步对细胞亚群进行免疫分型和定量分析的话，还需要借助于其他的细胞免疫分型方法，操作复杂，对待测样品的需求量大，并不适合实际应用。所以，还需要对淋巴细胞免疫分型和定量分析的方法进行研究，以求尽可能利用简单的方法将淋巴细胞进行较精细地免疫分型和定量分析。
发明内容
有鉴于此，本发明的发明目的在于提供一种淋巴细胞免疫分型的方法和试剂盒。该淋巴细胞免疫分型的方法能够对淋巴细胞进行更为全面的精细免疫分型和定量分析，效率高，且节约了待测样品的用量，更合适淋巴细胞的免疫分型和定量分析。
为了实现本发明的发明目的，本发明采用如下的技术方案：
本发明提供了一种用于淋巴细胞免疫分型的方法，包括T淋巴细胞免疫分型和B淋巴细胞免疫分型；
该T淋巴细胞免疫分型包括：
取不同的荧光标记的抗体，与待检测样品混合，孵育后，经流式细胞术检测，得检测数据，分析所述检测数据；
该B淋巴细胞免疫分型包括：
取不同的荧光标记的抗体，与新的所述待检测样品混合，孵育后，经流式细胞术检测，得检测数据，分析所述检测数据；
该T淋巴细胞免疫分型时，所用的抗体包括：
抗TCRαβ的抗体、抗TCRγδ的抗体、抗CD3的抗体、抗CD4的抗体、抗CD8的抗体、抗CD27的抗体和抗CD45RA抗体；
该B淋巴细胞免疫分型时，所用的抗体包括：
抗CD19的抗体、抗IgD的抗体、抗CD38的抗体、抗CD24的抗体和抗CD27的抗体；
该T淋巴细胞免疫分型时，所述分析的方法包括：
细胞表面标志CD3+TCRαβ+CD4-CD8-代表TCRαβ+双阴性T细胞；
细胞表面标志CD3+TCRγδ+代表γδT细胞；
细胞表面标志CD3+CD4+CD45RA+CD27+代表辅助初始T细胞；
细胞表面标志CD3+CD4+CD45RA+CD27-代表辅助耗竭T细胞；
细胞表面标志CD3+CD4+CD45RA-CD27+代表辅助中心记忆T细胞；
细胞表面标志CD3+CD4+CD45RA-CD27-代表辅助效应记忆T细胞；
细胞表面标志CD3+CD8+CD45RA+CD27+代表细胞毒性初始T细胞；
细胞表面标志CD3+CD8+CD45RA+CD27-代表细胞毒性耗竭T细胞；
细胞表面标志CD8+CD45RA-CD27+代表细胞毒性中心记忆T细胞；
细胞表面标志CD3+CD8+CD45RA-CD27-代表细胞毒性效应记忆T细胞；
该B淋巴细胞免疫分型时，所述分析的方法包括：
细胞表面标志CD19+D27+代表记忆B细胞；
细胞表面标志CD19+D27-IgD+代表初始B细胞；
细胞表面标志CD19+CD24++CD38++代表过渡B细胞；
细胞表面标志CD19+CD24-CD38++代表浆母细胞。
在本发明中，流式细胞术中所用到的抗体可以为与待测样品同源的抗体或也可以为与待测样品非同源的抗体，只要该抗体能够与待测样品中细胞表面标志物产生抗原-抗体特异性结合反应即可。
在本发明中，“+”代表阳性，即表示该抗原在细胞表面有表达；
“++”代表强阳性，即表示该抗原在细胞表面高表达；
“-”代表阴性，即表示该抗原在细胞表面不表达。
淋巴细胞的表面标志是指存在于淋巴细胞表面的膜分子，它们是淋巴细胞识别抗原、与其他免疫细胞相互作用以及接受信号刺激并产生应答的物质基础，也是鉴别和分离淋巴细胞的重要依据。在淋巴细胞的分化发育过程中，淋巴样干细胞进一步分化成各个细胞亚群，赋予了各个细胞亚群特定的表面标志。有些表面标志是淋巴细胞共有的，有些表面标志是某一类或某几类淋巴细胞特有的，所以在进行淋巴细胞免疫分型时，可以有众多种组合。但是并不是每种组合都能够实现淋巴细胞的免疫分型，本发明通过大量的创造性劳动发现：针对T细胞，细胞表面标志为CD3+TCRαβ+CD4-CD8-时，可对TCRαβ+双阴性T细胞进行免疫分型；细胞表面标志为CD3+TCRγδ+时，可对γδT细胞进行免疫分型；细胞表面标志为CD3+CD4+CD45RA+CD27+时，可对辅助初始T细胞进行免疫分型；细胞表面标志为CD3+CD4+CD45RA+CD27-时，可以对辅助耗竭T细胞进行免疫分型；细胞表面标志为CD3+CD4+CD45RA-CD27+时，可以对辅助中心记忆T细胞进行免疫分型；细胞表面标志为CD3+CD4+CD45RA-CD27-时，可以对辅助效应记忆T细胞进行免疫分型；细胞表面标志为CD3+CD8+CD45RA+CD27+时，可以对细胞毒性初始T细胞进行免疫分型；细胞表面标志为CD3+CD8+CD45RA+CD27-时，可以对细胞毒性耗竭T细胞免疫分型；细胞表面标志为CD8+CD45RA-CD27+时，可以对细胞毒性中心记忆T细胞免疫分型；细胞表面标志为CD3+CD8+CD45RA-CD27-时，可以对细胞毒性效应记忆T细胞免疫分型。本发明根据对各个细胞所对应的细胞表面标志，设计获得了最优的细胞表面标志的抗体组合，通过流式细胞术，对T淋巴细胞进行了更为全面的免疫分型。针对B淋巴细胞，本发明发现，细胞表面标志为CD19+D27+时，可以对记忆B细胞进行免疫分型；细胞表面标志为CD19+D27-IgD+时，可以对初始B细胞进行免疫分型；细胞表面标志为CD19+CD24++CD38++时，可以对过渡B细胞进行免疫分型；细胞表面标志为CD19+CD24-CD38++时，可以对浆母细胞进行免疫分型。本发明根据对各个细胞所对应的细胞表面标志，设计获得了最优的细胞表面标志的抗体组合，通过流式细胞术，对B淋巴细胞进行了精细免疫分型和定量分析，进一步完善了对淋巴细胞的精细免疫分析和定量分析。
优选地，本发明提供的淋巴细胞免疫分型的方法中，针对T淋巴细胞免疫分型，还设置对照组和同型对照组。设置对照组的意义在于排除无关变量的影响，增加实验结果的可信度和说服力；设置同型对照组的意义在于区别抗体染色过程中相同亚型所造成的背景信号影响。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的淋巴细胞免疫分型的方法中，针对T淋巴细胞免疫分型，对照组所用不同的荧光标记的抗体具体为：
抗CD3的抗体、抗CD4的抗体、抗CD8的抗体。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的淋巴细胞免疫分型的方法中，针对T淋巴细胞免疫分型，抗TCRαβ的抗体的荧光标记为PE。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的淋巴细胞免疫分型的方法中，针对T淋巴细胞免疫分型，抗TCRγδ的抗体的荧光标记为BV421或FITC。在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的淋巴细胞免疫分型的方法中，抗TCRγδ的抗体的荧光标记为FITC。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的淋巴细胞免疫分型的方法中，针对T淋巴细胞免疫分型，抗CD3的抗体的荧光标记为Percp-cy5.5或Pacificblue。在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的淋巴细胞免疫分型的方法中，抗CD3的抗体的荧光标记为Pacificblue。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的淋巴细胞免疫分型的方法中，针对T淋巴细胞免疫分型，抗CD4的抗体的荧光标记为FITC或APC-Cy7。在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的淋巴细胞免疫分型的方法中，抗CD4的抗体的荧光标记为APC-Cy7。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的淋巴细胞免疫分型的方法中，针对T淋巴细胞免疫分型，抗CD8的抗体的荧光标记为BV510。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的淋巴细胞免疫分型的方法中，针对T淋巴细胞免疫分型，抗CD27的抗体的荧光标记为APC。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的淋巴细胞免疫分型的方法中，针对T淋巴细胞免疫分型，抗CD45RA的抗体的荧光标记为PE-Cy7。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的淋巴细胞免疫分型的方法中，针对T淋巴细胞免疫分型，同型对照所用的抗体具体为：PE标记的同型抗体、FITC标记的同型抗体、APC标记的同型抗体、PE-Cy7标记的同型抗体。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的淋巴细胞免疫分型的方法，针对T淋巴细胞免疫分型，具体为：
取荧光标记的抗TCRαβ的抗体、荧光标记的抗TCRγδ的抗体，与待测样品混合，室温(即20℃～25℃)条件下，孵育25min～35min，得第一产品；
取荧光标记的抗CD3的抗体、荧光标记的抗CD4的抗体、荧光标记的抗CD8的抗体、荧光标记的抗CD27的抗体、荧光标记的抗CD45RA的抗体，与第一产品混合，室温(即20℃～25℃)条件下，孵育25min～35min，得第二产品；
取第二产品与红细胞裂解液混合，并将所得混合液置于36.5℃～37.5℃的中水中水浴9min～11min，洗涤，流式上机检测，得检测数据，分析检测数据；
分析的方法包括：
细胞表面标志CD3+TCRαβ+CD4-CD8-代表TCRαβ+双阴性T细胞；
细胞表面标志CD3+TCRγδ+代表γδT细胞；
细胞表面标志CD3+CD4+CD45RA+CD27+代表辅助初始T细胞；
细胞表面标志CD3+CD4+CD45RA+CD27-代表辅助耗竭T细胞；
细胞表面标志CD3+CD4+CD45RA-CD27+代表辅助中心记忆T细胞；
细胞表面标志CD3+CD4+CD45RA-CD27-代表辅助效应记忆T细胞；
细胞表面标志CD3+CD8+CD45RA+CD27+代表细胞毒性初始T细胞；
细胞表面标志CD3+CD8+CD45RA+CD27-代表细胞毒性耗竭T细胞；
细胞表面标志CD8+CD45RA-CD27+代表细胞毒性中心记忆T细胞；
细胞表面标志CD3+CD8+CD45RA-CD27-代表细胞毒性效应记忆T细胞。
在本发明中，本发明提供的方法中，各个荧光标记的抗体中的荧光标记物不受本发明的限制，本领域技术人员可以根据实际情况选择合适的荧光标记物，以及对应的同型对照。
优选地，本发明提供的淋巴细胞免疫分型的方法中，针对B淋巴细胞免疫分型，还设置对照组和同型对照组。设置对照组的意义在于排除无关变量的影响，增加实验结果的可信度和说服力；设置同型对照组的意义在于区别抗体染色过程中相同亚型所造成的背景信号影响。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的淋巴细胞免疫分型的方法中，针对B淋巴细胞免疫分型，对照组所用的抗体具体为：抗CD19的抗体。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的淋巴细胞免疫分型的方法中，针对B淋巴细胞免疫分型，同型对照所用的抗体具体为：BV450标记的同型抗体、BV510标记的同型抗体、PE标记的同型抗体、Percp-cy5.5标记的同型抗体。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的淋巴细胞免疫分型的方法中，针对B淋巴细胞免疫分型，同型对照所用的抗体具体为：APC标记的同型抗体、BV510标记的同型抗体、PE标记的同型抗体、Percp-cy5.5标记的同型抗体。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的淋巴细胞免疫分型的方法中，针对B淋巴细胞免疫分型，抗CD19的抗体的荧光标记为APC或APC-Cy7。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的淋巴细胞免疫分型的方法中，针对B淋巴细胞免疫分型，抗IgD的抗体的荧光标记为BV510。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的淋巴细胞免疫分型的方法中，针对B淋巴细胞免疫分型，抗CD38的抗体的荧光标记为Percp-cy5.5。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的淋巴细胞免疫分型的方法中，针对B淋巴细胞免疫分型，抗CD24的抗体的荧光标记为PE。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的淋巴细胞免疫分型的方法中，针对B淋巴细胞免疫分型，抗CD27的抗体的荧光标记为BV450或APC。
优选地，本发明提供的淋巴细胞免疫分型的方法，针对B淋巴细胞免疫分型，具体为：
取荧光标记的抗CD19的抗体、荧光标记的抗IgD的抗体、荧光标记的抗CD38的抗体、荧光标记的抗CD24的抗体、荧光标记的抗CD27的抗体，与待检测样品混合，室温(20℃～25℃)条件下，孵育25min～35min后，与红细胞裂解液混合，经裂解红细胞后，洗涤，流式上机检测，得检测数据；
该分析的方法包括：
细胞表面标志CD19+D27+代表记忆B细胞；
细胞表面标志CD19+D27-IgD+代表初始B细胞；
细胞表面标志CD19+CD24++CD38++代表过渡B细胞；
细胞表面标志CD19+CD24-CD38++代表浆母细胞。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中，针对B淋巴细胞免疫分型，对照组和同型对照组所对应的操作具体为：
取荧光标记的抗CD19的抗体、BV450标记的同型抗体、BV510标记的同型抗体、PE标记的同型抗体、Percp-cy5.5标记的同型抗体，与待检测样品混合，20℃～25℃条件下，孵育25min～35min后，与红细胞裂解液混合，经裂解红细胞后，洗涤，流式上机检测，得检测数据。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中，针对B淋巴细胞免疫分型，对照组和同型对照组所对应的操作具体为：
取荧光标记的抗CD19的抗体、APC标记的同型抗体、BV510标记的同型抗体、PE标记的同型抗体、Percp-cy5.5标记的同型抗体，与待检测样品混合，20℃～25℃条件下，孵育25min～35min后，与红细胞裂解液混合，经裂解红细胞后，洗涤，流式上机检测，得检测数据。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的方法中，还包括统计所述待测样品中各个淋巴细胞亚群的数目的步骤，包括：
检测待测样品中淋巴细胞的总数；
检测待测样品中T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK淋巴细胞占淋巴细胞的百分比；
通过计算，即得待测样品中T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK淋巴细胞的数目。
优选地，本发明提供的方法中，检测待测样品中T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK淋巴细胞占所述淋巴细胞的百分比的步骤，包括：
取不同的荧光标记的抗体，与新的待测样品混合，孵育后，经流式细胞术检测，得检测数据，分析所述检测数据；
将淋巴细胞分为T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK淋巴细胞时，所用的抗体包括：
抗CD45的抗体、抗CD3的抗体、抗CD16的抗体、抗CD56的抗体、抗CD19的抗体；
该步骤中所用的抗CD3的抗体与T淋巴细胞免疫分型中所述抗CD3的抗体，各自独立地带有荧光标记；该步骤中所用的抗CD19的抗体与B淋巴细胞免疫分型中所述抗CD19的抗体，各自独立地带有荧光标记。
本发明提供的方法中，淋巴细胞总数乘以其中T淋巴细胞的百分比，即得T淋巴细胞的数目。在本发明中通过对待测样品各个T细胞亚群进行免疫分型和相对数统计，再结合T淋巴细胞的绝对数，即可获得每个T细胞亚群的细胞绝对数。淋巴细胞总数乘以其中B淋巴细胞的百分比，即得B淋巴细胞的数目。在本发明中通过对待测样品各个B细胞亚群进行免疫分型和相对数统计，再结合B淋巴细胞的绝对数，即可获得每个B细胞亚群的细胞绝对数。淋巴细胞总数乘以其中NK淋巴细胞的百分比，即得NK淋巴细胞的数目。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的方法中，检测待测样品中T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK淋巴细胞占所述淋巴细胞的百分比的步骤中，抗CD45的抗体荧光标记为Percp。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的方法中，检测待测样品中T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK淋巴细胞占所述淋巴细胞的百分比的步骤中，抗CD3的抗体的荧光标记为FITC。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的方法中，检测待测样品中T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK淋巴细胞占所述淋巴细胞的百分比的步骤中，抗CD16的抗体的荧光标记为PE。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的方法中，检测待测样品中T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK淋巴细胞占所述淋巴细胞的百分比的步骤中，抗CD56的抗体的荧光标记为PE。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的方法中，检测待测样品中T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK淋巴细胞占所述淋巴细胞的百分比的步骤中，抗CD19的抗体的荧光标记为APC。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的方法中，检测待测样品中T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK淋巴细胞占所述淋巴细胞的百分比的步骤中，抗CD4的抗体的荧光标记为APC。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的方法中，检测待测样品中T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK淋巴细胞占所述淋巴细胞的百分比的步骤中，抗CD8的抗体的荧光标记为PE。
在本发明中，本发明提供的方法中，检测待测样品中T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK淋巴细胞占所述淋巴细胞的百分比的步骤所用方法为常规方法，该方法不受本发明的限制，本领域技术人员可以根据实际情况选择测定待测样品中检测待测样品中T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK淋巴细胞占所述淋巴细胞的百分比的方法。
本发明提供的淋巴细胞免疫分型方法，对待测样品，该待测样品优选为待测血液样品，对T淋巴细胞进行了免疫分型和定量分析，通过选用特定的抗体组合，来识别T淋巴细胞表面标志，经过对检测数据进行分析，通过一次检测，得出了T淋巴细胞中TCRαβ+双阴性T细胞、γδT细胞、辅助初始T细胞、辅助耗竭T细胞、辅助中心记忆T细胞、辅助效应记忆T细胞、细胞毒性初始T细胞、细胞毒性耗竭T细胞、细胞毒性中心记忆T细胞或细胞毒性效应记忆T细胞的数量。同时，也实现了一次性对B淋巴细胞进行了免疫分型和定量分析，通过特定的抗体组合，来识别B淋巴细胞表面标志，经过对所得检测数据进行分析，通过一次检测，得出了B淋巴细胞中，记忆B细胞、初始B细胞、过渡B细胞或浆母细胞的数量。进而，实现了一次性将淋巴细胞进行了精细的免疫分型和定量分析，效率高，且节约了待测样品用量。
本发明还提供了一种用于淋巴细胞免疫分型的试剂盒，其包括用于T淋巴细胞免疫分型的抗体、用于B淋巴细胞免疫分型的抗体；
用于T淋巴细胞免疫分型的抗体包括如下不同的荧光标记的抗体：
抗TCRαβ的抗体、抗TCRγδ的抗体、抗CD3的抗体、抗CD4的抗体、抗CD8的抗体、抗CD27的抗体、抗CD45RA抗体；
用于B淋巴细胞免疫分型的抗体包括如下不同的荧光标记的抗体；
抗CD19的抗体、抗IgD的抗体、抗CD38的抗体、抗CD24的抗体、抗CD27的抗体。
在本发明中，本发明提供的用于淋巴细胞免疫分型的试剂盒中，荧光标记的抗体，可以是荧光标记物与抗体单独放置，在使用时将两者偶联获得荧光标记的抗体；也可以是荧光标记的抗体，在使用时，直接使用即可。
在本发明一些实施例中，本发明提供的用于淋巴细胞免疫分型的试剂盒中，针对T淋巴细胞免疫分型的抗体中抗TCRαβ的抗体的荧光标记为PE。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的用于淋巴细胞免疫分型的试剂盒中，针对T淋巴细胞免疫分型的抗体中抗TCRγδ的抗体的荧光标记为BV421或FITC。在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的用于淋巴细胞免疫分型的试剂盒中，针对T淋巴细胞免疫分型的抗体中抗TCRγδ的抗体的荧光标记为FITC。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的用于淋巴细胞免疫分型的试剂盒中，针对T淋巴细胞免疫分型的抗体中抗CD3的抗体的荧光标记为Percp-cy5.5或Pacificblue。在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的用于淋巴细胞免疫分型的试剂盒中，针对T淋巴细胞免疫分型的抗体中抗CD3的抗体的荧光标记为Pacificblue。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的用于淋巴细胞免疫分型的试剂盒中，针对T淋巴细胞免疫分型的抗体中抗CD4的抗体的荧光标记为FITC或APC-Cy7。在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的用于淋巴细胞免疫分型的试剂盒中，针对T淋巴细胞免疫分型的抗体中抗CD4的抗体的荧光标记为APC-Cy7。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的用于淋巴细胞免疫分型的试剂盒中，针对T淋巴细胞免疫分型的抗体中抗CD8的抗体的荧光标记为BV510。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的用于淋巴细胞免疫分型的试剂盒中，针对T淋巴细胞免疫分型的抗体中抗CD27的抗体的荧光标记为APC。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的用于淋巴细胞免疫分型的试剂盒中，针对T淋巴细胞免疫分型的抗体中抗CD45RA的抗体的荧光标记为PE-Cy7。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的用于淋巴细胞免疫分型的试剂盒中的抗体，针对T淋巴细胞免疫分型的抗体，还包括同型对照抗体，具体为：PE标记的同型抗体、BV421标记的同型抗体、APC标记的同型抗体、PE-Cy7标记的同型抗体。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的用于淋巴细胞免疫分型的试剂盒中，针对B淋巴细胞免疫分型的抗体中抗CD19的抗体的荧光标记为APC或APC-Cy7。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的用于淋巴细胞免疫分型的试剂盒中，针对B淋巴细胞免疫分型的抗体中抗IgD的抗体的荧光标记为BV510。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的用于淋巴细胞免疫分型的试剂盒中，针对B淋巴细胞免疫分型的抗体中抗CD38的抗体的荧光标记为Percp-cy5.5。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的用于淋巴细胞免疫分型的试剂盒中，针对B淋巴细胞免疫分型的抗体中抗CD24的抗体的荧光标记为PE。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的用于淋巴细胞免疫分型的试剂盒中，针对B淋巴细胞免疫分型的抗体中抗CD27的抗体的荧光标记为BV450或APC。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的淋巴细胞免疫分型的试剂盒中，针对B淋巴细胞免疫分型的抗体，还包括同型对照抗体，具体为：BV450标记的同型抗体、BV510标记的同型抗体、PE标记的同型抗体、Percp-cy5.5标记的同型抗体。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的淋巴细胞免疫分型的试剂盒中，针对B淋巴细胞免疫分型的抗体中的同型对照抗体，具体为：APC标记的同型抗体、BV510标记的同型抗体、PE标记的同型抗体、Percp-cy5.5标记的同型抗体。
在本发明中，本发明提供的试剂盒中，各个荧光标记的抗体中的荧光标记物不受本发明的限制，本领域技术人员可以根据实际情况选择合适的荧光标记物，以及对应的同型对照。
优选地，本发明提供的试剂盒中，还包括用于将淋巴细胞分为T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK淋巴细胞的抗体，具体为：
抗CD45的抗体、抗CD3的抗体、抗CD16的抗体、抗CD56的抗体、抗CD19的抗体。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的试剂盒中，用于将淋巴细胞分为T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK淋巴细胞的抗体中，抗CD45的抗体荧光标记为Percp。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的试剂盒中，用于将淋巴细胞分为T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK淋巴细胞的抗体中，抗CD3的抗体的荧光标记为FITC。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的试剂盒中，用于将淋巴细胞分为T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK淋巴细胞的抗体中，抗CD16的抗体的荧光标记为PE。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的试剂盒中，用于将淋巴细胞分为T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK淋巴细胞的抗体中，抗CD56的抗体的荧光标记为PE。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的试剂盒中，用于将淋巴细胞分为T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK淋巴细胞的抗体中，抗CD19的抗体的荧光标记为APC。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的试剂盒中，用于将淋巴细胞分为T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK淋巴细胞的抗体中，抗CD4的抗体的荧光标记为APC。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的试剂盒中，用于将淋巴细胞分为T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK淋巴细胞的抗体中，抗CD8的抗体的荧光标记为PE。
在本发明中，流式细胞术检测过程中，通过目标细胞分群是否清楚、目标细胞荧光强度等表示准确性的高低；目标细胞分群清楚、目标细胞荧光强度准确高，通过对同一标本进行多次重复实验，无统计学差异，则表示准确性高。
本发明提供了一种淋巴细胞免疫分型的方法和试剂盒。本发明提供的淋巴细胞免疫分型的方法，包括：T淋巴细胞免疫分型和B淋巴细胞免疫分型；T淋巴细胞免疫分型包括：取不同的荧光标记的抗体，与待检测样品混合，孵育后，经流式细胞术检测，得检测数据，分析所述检测数据；B淋巴细胞免疫分型包括：取不同的荧光标记的抗体，与新的所述待检测样品混合，孵育后，经流式细胞术检测，得检测数据，分析所述检测数据；所述T淋巴细胞免疫分型时，所用的抗体包括：抗TCRαβ的抗体、抗TCRγδ的抗体、抗CD3的抗体、抗CD4的抗体、抗CD8的抗体、抗CD27的抗体和抗CD45RA抗体；所述B淋巴细胞免疫分型时，所用的抗体包括：抗CD19的抗体、抗IgD的抗体、抗CD38的抗体、抗CD24的抗体和抗CD27的抗体；所述T淋巴细胞免疫分型时，所述分析的方法包括：细胞表面标志CD3+TCRαβ+CD4-CD8-代表TCRαβ+双阴性T细胞；细胞表面标志CD3+TCRγδ+代表γδT细胞；细胞表面标志CD3+CD4+CD45RA+CD27+代表辅助初始T细胞；细胞表面标志CD3+CD4+CD45RA+CD27-代表辅助耗竭T细胞；细胞表面标志CD3+CD4+CD45RA-CD27+代表辅助中心记忆T细胞；细胞表面标志CD3+CD4+CD45RA-CD27-代表辅助效应记忆T细胞；细胞表面标志CD3+CD8+CD45RA+CD27+代表细胞毒性初始T细胞；细胞表面标志CD3+CD8+CD45RA+CD27-代表细胞毒性耗竭T细胞；细胞表面标志CD8+CD45RA-CD27+代表细胞毒性中心记忆T细胞；细胞表面标志CD3+CD8+CD45RA-CD27-代表细胞毒性效应记忆T细胞；所述B淋巴细胞免疫分型时，所述分析的方法包括：细胞表面标志CD19+D27+代表记忆B细胞；细胞表面标志CD19+D27-IgD+代表初始B细胞；细胞表面标志CD19+CD24++CD38++代表过渡B细胞；细胞表面标志CD19+CD24-CD38++代表浆母细胞。实验结果证实，本发明设计获得了最优的细胞表面标志的抗体组合，通过流式细胞术，实现了对淋巴细胞进行更加全面的免疫分型和定量分析。在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法，所需待测样品少、操作简单、所需时间短。在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法重复性好、准确性高、可广泛应用于淋巴细胞亚群免疫分型和定量分析。
附图说明
图1示实施例1中淋巴细胞分类结果；
图2示实施例1中T淋巴细胞分型结果；其中，图2-A、图2-B示TCRαβ+双阴性T细胞的细胞分型结果；图2-C示γδT细胞的细胞分型结果；图2-D示辅助T细胞亚类的细胞分型结果；图2-E示细胞毒性T细胞亚类的细胞分型结果；
图3示实施例1中B淋巴细胞分型结果；
图4示实施例2中淋巴细胞分类结果；
图5示实施例2中T淋巴细胞分型结果；其中，图5-A、图5-B示TCRαβ+双阴性T细胞的细胞分型结果；图5-C示γδT细胞的细胞分型结果；图5-D示辅助T细胞亚类的细胞分型结果；图5-E示细胞毒性T细胞亚类的细胞分型结果；
图6示实施例2中B淋巴细胞分型结果；
图7示实施例3中淋巴细胞分类结果；
图8示实施例3中T淋巴细胞分型结果；其中，图8-A、图8-B示TCRαβ+双阴性T细胞的细胞分型结果；图8-C示γδT细胞的细胞分型结果；图8-D示辅助T细胞亚类的细胞分型结果；图8-E示细胞毒性T细胞亚类的细胞分型结果；
图9示实施例3中B淋巴细胞分型结果；
图10示对比例1中CD19、CD38、CD24、IgM相组合时，所得的流式图；
图11示对比例2中CD45RO和CCR7相组合时，所得的流式图。
具体实施方式
本发明公开了一种淋巴细胞免疫分型的方法和试剂盒。本领域技术人员可以参考本文内容，实施该方法，实现其应用，特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的方法及应用已经通过较佳的实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文制备方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的一种淋巴细胞免疫分型的方法和试剂盒中所用到的试剂和原料均可由市场购得。
本发明中用到的荧光标记Percp、FITC、PE、APC、BV421、Percp-cy5.5、BV510、PE-Cy7、BV450均为常见的荧光标记可以由市场购得，各个荧光标记的抗体也可以由市场购得。
为了使本技术领域的技术人员能够更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1淋巴细胞精细免疫分型和定量分析
实验材料：
待测样品：抗凝外周血样品，来源于健康志愿者，为正常人的外周血。
BDBiosciences淋巴细胞分类试剂盒(cat340503)，购买于BDbiosciences，其中混合抗体1包括：荧光标记Percp的抗CD45抗体、抗CD3(FITC)的抗体、抗CD4(APC)的抗体、抗CD8(PE)的抗体；混合抗体2包括：荧光标记Percp的抗CD45抗体、抗CD19(APC)的抗体、抗CD56和CD16(PE)的抗体、抗CD3(FITC)的抗体。BD临床试剂盒自带的红细胞裂解液。
自配的红细胞裂解液：每1L红细胞裂解液中含NH4Cl8.29g、KHCO31g,EDTA0.37g。
实验方法：
取500μL抗凝外周血样品，取200μL待测样品，通过血细胞计数仪测得淋巴细胞绝对数，得淋巴细胞的绝对数为4.22×109个/L。
剩下300μL用于检测淋巴细胞各亚群，进行淋巴细胞免疫分型和定量分析。
淋巴细胞分类
1、取两根流式管，分别标记为L-1、L-2，将BDBiosciences淋巴细胞分类试剂盒(cat340503)中两种混合抗体分别加入到对应的流式管中，其中混合抗体1加入到L-1号流式管中；混合抗体2分别加入对L-2号流式管中。
2、向L-1、L-2号流式管中，各加入50μL待测样品，充分涡旋，室温(25℃)避光孵育30min；
3、用试剂盒中1×BD红细胞裂解液裂解红细胞，5min；
4、加入1mLPBS洗涤一次后(3500rpm/min，2min)，加入200μLPBS流式上机，并分析结果。
T淋巴细胞精细免疫分型
1、取两根流式管，分别标记为T-1、T-2，其中T-1为对照组和同型对照组，T-2为待检测组；按照表1向各个流式管中加入以下抗体：
表1各个流式管中加入的抗体的类别和加入的体积
2、向T-1、T-2号流式管中，各加入50μL待测样品，充分涡旋后，室温(25℃)避光孵育30min；
3、按照表2向各个流式管中加入以下抗体：
表2各个流式管中加入的抗体的类别和加入的体积
4、用自配的红细胞裂解液裂解红细胞后，37℃水浴10min；
5、各加入1mLPBS洗一次后，流式上机并分析结果。
B淋巴细胞精细免疫分型
1、取两个流式管，分别编号为B-1、B-2，其中，B-1为对照组和同型对照组，B-2为待检测组；按照表3向各个流式管中加入以下抗体：
表3各个流式管中加入的抗体的类别和加入的体积
2、向B-1、B-2号流式管中，各加入混匀的50μL待测样品，混匀后室温(25℃)避光孵育30min；
3、用自配的红细胞裂解液裂解红细胞；
4、加入1mLPBS洗一次后，流式上机并分析结果。
结果分析：
通过以上三步，得到各淋巴细胞亚群相对数(百分数)和淋巴细胞绝对数。各淋巴细胞亚群相对数(百分数)×淋巴细胞绝对数，即得到各淋巴细胞亚群绝对数。这里的各淋巴细胞亚群相对数是指：针对淋巴细胞分类时为分别为T、B、NK等细胞占淋巴细胞的百分比；针对T细胞精细免疫分型时为各细胞亚群占T细胞的百分比；针对B细胞精细免疫分型时为各细胞亚群占B细胞的百分比。
淋巴细胞免疫分型和定量分析结果(采用BD自动分析软件分析)
淋巴细胞分型结果见图1，从图中可知，T细胞、Tc细胞、Th细胞、B细胞、NK细胞的相对数(百分数)；根据淋巴细胞的绝对数、和各个细胞亚群的相对数(百分数)，计算获得各个细胞亚群的绝对数，具体实验结果见表4。
表4各个细胞亚群免疫分型所用的细胞表面标志、各个细胞亚群的相对数和绝对数
T细胞精细免疫分型和定量分析结果(采用BDDiva软件分析)
T淋巴细胞分型结果见图2-A、2-B、2-C、2-D和2-E，从图中可知，各类T细胞亚群的相对数(百分数)，该相对数为相对于T细胞数目的百分数；根据淋巴细胞的绝对数、和各个细胞亚群的相对数(百分数)，计算获得各个细胞亚群的绝对数。
1、TCRαβ+双阴性T细胞(TCRαβ+DNT细胞)
由图2-A，图2-B可知，TCRαβ+DNT(即，CD3+TCRαβ+CD4-CD8-)即为目标细胞。由流式细胞仪可测得目标细胞占T细胞的1.82％，可由血细胞计数仪测得的淋巴细胞绝对数算出，TCRαβ+双阴性T细胞的绝对数为50个/μL。
2、γδT细胞
由图2-C可知，CD3+TCRγδ+即为目标细胞。由流式细胞仪可测得目标细胞占T细胞的3.4％，可由血细胞计数仪测得的淋巴细胞绝对数算出，γδT细胞的绝对数为93个/μL。
3、辅助T细胞亚类
从图2-D可得，以下四个细胞亚群：①辅助初始T细胞(即CD4+ CD3+CD4+CD45RA+CD27+)，相对数34.36％，绝对数936个/μL；②辅助耗竭T细胞(即图中Q4-2，CD3+CD4+CD45RA+CD27-)相对数0.12％，绝对数3个/μL；③辅助中心记忆T细胞(即CD4+CM，CD3+CD4+CD45RA-CD27+)相对数6.34％，绝对数173个/μL；④辅助效应记忆T细胞(即CD4+EM，CD3+CD4+CD45RA-CD27-)相对数0.37％，绝对数10个/μL。
4、细胞毒性T细胞亚类
由图2-E可得，以下四个细胞亚群：①细胞毒性初始T细胞(即CD8+ CD3+CD8+CD45RA+CD27+)，相对数17.68％，绝对数482个/μL；②细胞毒性耗竭T细胞(即CD8+TEMRA，CD3+CD8+CD45RA+CD27-)相对数2.69％，绝对数73个/μL；③细胞毒性中心记忆T细胞(即CD8+CM，CD8+CD45RA-CD27+)相对数1.09％，绝对数30个/μL；④细胞毒性效应记忆T细胞(即CD8+EM，CD3+CD8+CD45RA-CD27-)相对数0.28％，绝对数8个/μL。
B细胞精细免疫分型和定量分析结果(采用BDDiva软件分析)
B淋巴细胞分型结果见图3-A和图3-B，从图中可知，各类B细胞亚群的相对数(百分数)，该相对数为相对于B细胞数目的百分数；根据淋巴细胞的绝对数、和各个细胞亚群的相对数(百分数)，计算获得各个细胞亚群的绝对数。
由图3可知，待测样品中以下四个细胞亚群和该亚群的细胞数目：①记忆B细胞(CD19+D27+)，相对数12.0％，绝对数127个/μL；②初始B细胞(CD19+D27-IgD+)，相对数69.5％，绝对数605个/μL；③过渡B细胞(CD19+CD24++CD38++)，相对数9.0％，绝对数95个/μL；④浆母细胞(CD19+CD24-CD38++)，相对数3.4％，绝对数37个/μL。
根据文献报道，正常人的淋巴细胞中的各个细胞亚群的相对数的参考范围见表5所示。
表5正常人的淋巴细胞中各个细胞亚群相对数
其中，※代表该数据并没有通用的参考范围，仅是目前研究报道的实验结果；
根据图1可知，本实施例所用的方法能够成功将淋巴细胞分为T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞，并且进行定量分析，获得了各个细胞的相对数和绝对数。从表5中结果可知，各个细胞亚群的相对数完全落入正常人的参考范围，与待检测样品的实际情况相一致，说明本发明实验结果稳定、准确。
根据图2-A、图2-B、图2-C、图2-D、图2-E可得，本实施例所用的方法能够准确地将T淋巴细胞分为TCRαβ+双阴性T细胞、γδT细胞、辅助初始T细胞、辅助耗竭T细胞、辅助中心记忆T细胞、辅助效应记忆T细胞、细胞毒性初始T细胞、细胞毒性耗竭T细胞、细胞毒性中心记忆T细胞、细胞毒性效应记忆T细胞，并且进行定量分析，获得了各个细胞亚群的相对数和绝对数。从表5中结果可知，各个细胞亚群的相对数与正常人的参考范围基本一致，与待检测样品的实际情况相一致，说明本发明实验结果稳定、准确。
根据图3可知，本实施例所用的方法能够准确地将B淋巴细胞分为记忆B细胞、初始B细胞、过渡B细胞、浆母细胞，并且进行定量分析，获得了各个细胞亚群的相对数和绝对数。从表5中结果可知，各个细胞亚群的相对数与正常人的参考范围基本一致，与待检测样品的实际情况相一致，说明本发明实验结果稳定、准确。
综上所述，本发明提供的方法采用较少的待测样品就实现了对待测样品的淋巴细胞免疫分型，并统计出了每个细胞亚群的含量；且本发明提供的方法能够准确将各个细胞亚群进行免疫分型。
实施例2淋巴细胞精细免疫分型和定量分析
实验材料：
待测样品：抗凝外周血样品，来源于来我院就诊患儿静脉血样品(已签知情同意书)，为拟诊系统性红斑狼疮(SLE)患儿的外周血。
BDBiosciences淋巴细胞分类试剂盒(cat340503)，购买于BDbiosciences，其中混合抗体1包括：荧光标记Percp的抗CD45抗体、抗CD3(FITC)的抗体、抗CD4(APC)的抗体、抗CD8(PE)的抗体；混合抗体2包括：荧光标记Percp的抗CD45抗体、抗CD19(APC)的抗体、抗CD56和CD16(PE)的抗体、抗CD3(FITC)的抗体。BD临床试剂盒自带的红细胞裂解液。
自配的红细胞裂解液：每1L红细胞裂解液中含NH4Cl8.29g、KHCO31g,EDTA0.37g。
实验方法：
取500μL抗凝外周血样品，取200μL待测样品，通过血细胞计数仪测得淋巴细胞绝对数，得淋巴细胞的绝对数为0.68×109个/L。
剩下300μL用于检测淋巴细胞各亚群，进行淋巴细胞免疫分型和定量分析。
淋巴细胞分类
与实施例1中记载的淋巴细胞分类方法相同，其中孵育时的温度为室温(20℃)，孵育时间为35min。
T淋巴细胞精细免疫分型
与实施例1中记载的T淋巴细胞分类方法相同，其中加入PE标记的抗TCRαβ抗体、BV421标记的抗TCRγδ抗体后，孵育的温度为室温(20℃)，孵育时间为35min；加入剩余抗体后，孵育的温度为室温(20℃)，孵育时间为35min；用自配的红细胞裂解液裂解红细胞后，36.5℃水浴11min。
B淋巴细胞精细免疫分型
1、取两个流式管，分别编号为B-1、B-2，其中，B-1为对照组和同型对照组，B-2为待检测组；按照表6向各个流式管中加入以下抗体：
表6各个流式管中加入的抗体的类别和加入的体积
2、向B-1、B-2号流式管中，各加入混匀的50μL待测样品，混匀后室温(20℃)避光孵育30min；
3、用自配的红细胞裂解液裂解红细胞；
4、加入1mLPBS洗一次后，流式上机并分析结果。
结果分析：
通过以上三步，得到各淋巴细胞亚群相对数(百分数)和淋巴细胞绝对数。具体分析方法与实施例1提供的方法相同。
淋巴细胞免疫分型和定量分析结果(采用BD自动分析软件分析)
淋巴细胞分型结果图4，从图中可知，T细胞、Tc细胞、Th细胞、B细胞、NK细胞的相对(百分数)；根据淋巴细胞的绝对数、和各个细胞亚群的相对数(百分数)，计算获得各个细胞亚群的绝对数，具体实验结果见表7。
表7各个细胞亚群免疫分型所用的细胞表面标志、各个细胞亚群的相对数和绝对数
T细胞精细免疫分型和定量分析结果(采用BDDiva软件分析)
T淋巴细胞分类结果见图5-A、5-B、5-C、5-D和图5-E，从图中可知，各类T细胞亚群的相对数(百分数)，该相对数为相对于T细胞数目的百分数；根据淋巴细胞的绝对数、和各个细胞亚群的相对数(百分数)，计算获得各个细胞亚群的绝对数。
1、TCRαβ+双阴性T细胞(TCRαβ+DNT细胞)
由图5-A，图5-B可知，TCRαβ+DNT(即CD3+TCRαβ+CD4-CD8-)即为目标细胞。由流式细胞仪可测得目标细胞占T细胞的3.04％，可由血细胞计数仪测得的淋巴细胞绝对数算出，TCRαβ+双阴性T细胞的绝对数为14个/μL。
2、γδT细胞
由图5-C可知，CD3+TCRγδ+即为目标细胞。由流式细胞仪可测得目标细胞占T细胞的1.32％，可由血细胞计数仪测得的淋巴细胞绝对数算出，γδT细胞的绝对数为6个/μL。
3、辅助T细胞亚类
从图5-D可得，以下四个细胞亚群：①辅助初始T细胞(即CD4+ CD3+CD4+CD45RA+CD27+)，相对数16.87％，绝对数77个/μL；②辅助耗竭T细胞(即图中Q4-2，CD3+CD4+CD45RA+CD27-)相对数0.09％，绝对数0.3个/μL；③辅助中心记忆T细胞(即CD4+CM，CD3+CD4+CD45RA-CD27+)相对数22.16％，绝对数101个/μL；④辅助效应记忆T细胞(即CD4+EM，CD3+CD4+CD45RA-CD27-)相对数6.43％，绝对数29个/μL。
4、细胞毒性T细胞亚类
由图5-E可得，以下四个细胞亚群：①细胞毒性初始T细胞(即CD8+ CD3+CD8+CD45RA+CD27+)，相对数12.33％，绝对数56个/μL；②细胞毒性耗竭T细胞(即CD8+TEMRA，CD3+CD8+CD45RA+CD27-)相对数1.97％，绝对数9个/μL；③细胞毒性中心记忆T细胞(即CD8+CM，CD8+CD45RA-CD27+)相对数3.78％，绝对数17个/μL；④细胞毒性效应记忆T细胞(即CD8+EM，CD3+CD8+CD45RA-CD27-)相对数2.24％，绝对数10个/μL。
B细胞精细免疫分型和定量分析结果(采用BDDiva软件分析)
B淋巴细胞分型结果见图6-A和图6-B，从图中可知，各类B细胞亚群的相对数(百分数)，该相对数为相对于B细胞数目的百分数；根据淋巴细胞的绝对数、和各个细胞亚群的相对数(百分数)，计算获得各个细胞亚群的绝对数。
由图6可知，待测样品中以下四个细胞亚群和该亚群的细胞数目：①记忆B细胞(CD19+D27+)，相对数28.0％，绝对数59个/μL；②初始B细胞(CD19+D27-IgD+)，相对数48.5％，绝对数102个/μL；③过渡B细胞(CD19+CD24++CD38++)，相对数0.5％，绝对数1个/μL；④浆母细胞(CD19+CD24-CD38++)，相对数13.8％，绝对数29个/μL。
根据文献报道，正常人的淋巴细胞中的各个细胞亚群的相对数的参考范围见表5所示。
根据图4可知，本实施例所用的方法能够成功将淋巴细胞分为T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞，并且进行定量分析，获得了各个细胞的相对数和绝对数。从结果可知，待测样品中的NK细胞(CD16+CD56+)含量明显低于正常参考范围下限(7％-40％)，而B细胞(CD19+)高于正常参考范围上限(5-18％)，其余无明显异常，提示该待测样品中B细胞异常活化或增殖。
根据图5可知，本实施例所用的方法能够准确地将T淋巴细胞分为TCRαβ+双阴性T细胞、γδT细胞、辅助初始T细胞、辅助耗竭T细胞、辅助中心记忆T细胞、辅助效应记忆T细胞、细胞毒性初始T细胞、细胞毒性耗竭T细胞、细胞毒性中心记忆T细胞、细胞毒性效应记忆T细胞，并且进行定量分析，获得了各个细胞亚群的相对数和绝对数。从结果可知，各个细胞亚群的相对数与正常人的参考范围基本一致，无明显异常。
根据图6可知，本实施例所用的方法能够准确地将B淋巴细胞分为记忆B细胞、初始B细胞、过渡B细胞、浆母细胞，并且进行定量分析，获得了各个细胞亚群的相对数和绝对数。从结果可知，待测样品中过渡B细胞(TransitionalBcell)仅占B细胞的0.05％，几乎没有，提示其体液免疫过渡活化或失调。
综上所述，本发明提供的方法采用较少的待测样品就实现了对待测样品的淋巴细胞免疫分型，并统计出了每个细胞亚群的含量；且本发明提供的方法能够准确将各个细胞亚群进行免疫分型。
实施例3淋巴细胞精细免疫分型和定量分析
实验材料：
待测样品：抗凝外周血样品，来源于来我院就诊患儿静脉血样品(已签知情同意书)，为拟诊高IgM综合征患儿的外周血。
BDBiosciences淋巴细胞分类试剂盒(cat340503)，购买于BDbiosciences，其中混合抗体1包括：荧光标记Percp的抗CD45抗体、抗CD3(FITC)的抗体、抗CD4(APC)的抗体、抗CD8(PE)的抗体；混合抗体2包括：荧光标记Percp的抗CD45抗体、抗CD19(APC)的抗体、抗CD56和CD16(PE)的抗体、抗CD3(FITC)的抗体。BD临床试剂盒自带的红细胞裂解液。
自配的红细胞裂解液：每1L红细胞裂解液中含NH4Cl8.29g、KHCO31g,EDTA0.37g。
实验方法：
取500μL抗凝外周血样品，取200μL待测样品，通过血细胞计数仪测得淋巴细胞绝对数，得淋巴细胞的绝对数为0.89×109个/L。
剩下300μL用于检测淋巴细胞各亚群，进行淋巴细胞免疫分型和定量分析。
淋巴细胞分类
与实施例1中记载的淋巴细胞分类方法相同，其中孵育时的温度为室温(22℃)，孵育时间为30min。
T淋巴细胞精细免疫分型
与实施例1中记载的T淋巴细胞分类方法相同，其中加入PE标记的抗TCRαβ抗体、BV421标记的抗TCRγδ抗体后，孵育的温度为室温(22℃)，孵育时间为25min；加入剩余抗体后，孵育的温度为室温(22℃)，孵育时间为25min；用自配的红细胞裂解液裂解红细胞后，37.5℃水浴9min。
B淋巴细胞精细免疫分型
与实施例1中记载的B淋巴细胞分类方法相同，其中其中孵育时的温度为室温(22℃)，孵育时间为25min。
结果分析：
通过以上三步，得到各淋巴细胞亚群相对数(百分数)和淋巴细胞绝对数。具体分析方法与实施例1提供的方法相同。
淋巴细胞免疫分型和定量分析结果(采用BD自动分析软件分析)
淋巴细胞分型结果见图7，从图中可知，T细胞、Tc细胞、Th细胞、B细胞、NK细胞的相对(百分数)；根据淋巴细胞的绝对数、和各个细胞亚群的相对数(百分数)，计算获得各个细胞亚群的绝对数，具体实验结果见表8。
表8各个细胞亚群免疫分型所用的细胞表面标志、各个细胞亚群的相对数和绝对数
T细胞精细免疫分型和定量分析结果(采用BDDiva软件分析)
T淋巴细胞分类结果见图8-A、8-B、8-C、8-D和图8-E，从图中可知，各类T细胞亚群的相对数(百分数)，该相对数为相对于T细胞数目的百分数；根据淋巴细胞的绝对数、和各个细胞亚群的相对数(百分数)，计算获得各个细胞亚群的绝对数。
1、TCRαβ+双阴性T细胞(TCRαβ+DNT细胞)
由图8-A，图8-B可知，TCRαβ+DNT(即CD3+TCRαβ+CD4-CD8-)即为目标细胞。由流式细胞仪可测得目标细胞占T细胞的1.24％，可由血细胞计数仪测得的淋巴细胞绝对数算出，TCRαβ+双阴性T细胞的绝对数为8个/μL。
2、γδT细胞
由图8-C可知，CD3+TCRγδ+即为目标细胞。由流式细胞仪可测得目标细胞占T细胞的18.1％，可由血细胞计数仪测得的淋巴细胞绝对数算出，γδT细胞的绝对数为113个/μL。
3、辅助T细胞亚类
从图8-D可得，以下四个细胞亚群：①辅助初始T细胞(即CD4+ CD3+CD4+CD45RA+CD27+)，相对数23.36％，绝对数146个/μL；②辅助耗竭T细胞(即图中Q4-2，CD3+CD4+CD45RA+CD27-)相对数0.17％，绝对数1个/μL；③辅助中心记忆T细胞(即CD4+CM，CD3+CD4+CD45RA-CD27+)相对数9.47％，绝对数59个/μL；④辅助效应记忆T细胞(即CD4+EM，CD3+CD4+CD45RA-CD27-)相对数0.71％，绝对数4个/μL。
4、细胞毒性T细胞亚类
由图8-E可得，以下四个细胞亚群：①细胞毒性初始T细胞(即CD8+ CD3+CD8+CD45RA+CD27+)，相对数15.66％，绝对数98个/μL；②细胞毒性耗竭T细胞(即CD8+TEMRA，CD3+CD8+CD45RA+CD27-)相对数10.15％，绝对数63个/μL；③细胞毒性中心记忆T细胞(即CD8+CM，CD8+CD45RA-CD27+)相对数1.20％，绝对数7个/μL；④细胞毒性效应记忆T细胞(即CD8+EM，CD3+CD8+CD45RA-CD27-)相对数0.81％，绝对数5个/μL。
B细胞精细免疫分型和定量分析结果(采用BDDiva软件分析)
B淋巴细胞分型结果见图9-A和图9-B，从图中可知，各类B细胞亚群的相对数(百分数)，该相对数为相对于B细胞数目的百分数；根据淋巴细胞的绝对数、和各个细胞亚群的相对数(百分数)，计算获得各个细胞亚群的绝对数。
由图9可知，待测样品中以下四个细胞亚群和该亚群的细胞数目：①记忆B细胞(CD19+D27+)，相对数0.5％，绝对数1个/μL；②初始B细胞(CD19+D27-IgD+)，相对数95.3％，绝对数216个/μL；③过渡B细胞(CD19+CD24++CD38++)，相对数28.3％，绝对数64个/μL；④浆母细胞(CD19+CD24-CD38++)，相对数0.9％，绝对数2个/μL。
根据文献报道，正常人的淋巴细胞中的各个细胞亚群的相对数的参考范围见表5所示。
根据图7可知，本实施例所用的方法能够成功将淋巴细胞分为T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞，并且进行定量分析，获得了各个细胞的相对数和绝对数。从结果可知，待测样品中的NK细胞(CD16+CD56+)为2.22％，明显低于正常参考范围下限(7-40％)，而B细胞(CD19+)为25.42％，高于正常参考范围上限(5-18％)，其余无明显异常，提示B细胞异常活化或增殖。
根据图8可知，本实施例所用的方法能够准确地将T淋巴细胞分为TCRαβ+双阴性T细胞、γδT细胞、辅助初始T细胞、辅助耗竭T细胞、辅助中心记忆T细胞、辅助效应记忆T细胞、细胞毒性初始T细胞、细胞毒性耗竭T细胞、细胞毒性中心记忆T细胞、细胞毒性效应记忆T细胞，并且进行定量分析，获得了各个细胞亚群的相对数和绝对数。从结果可知，待测样品中细胞毒性耗竭T细胞(CD8+TEMRA)的含量占T细胞的36.5％，显著高于正常同龄儿童，提示患儿可能存在长期慢性病毒感染；待测样品中记忆T细胞(各类中心/效应记忆T)均低于正常参考范围，提示该患儿可能存在细胞免疫异常；待测样品中γδT细胞的含量占T细胞的18.1％，远高于正常参考范围(低于5％)，提示患儿病毒感染、T细胞异常活化或增值。
根据图9可知，本实施例所用的方法能够准确地将B淋巴细胞分为记忆B细胞、初始B细胞、过渡B细胞、浆母细胞，并且进行定量分析，获得了各个细胞亚群的相对数和绝对数。从结果可知，初始B细胞过多，而记忆B细胞(memoryB)仅占B细胞的0.5％，远低于正常下限，提示患儿体液免疫功能障碍。
综上所述，本发明提供的方法采用较少的待测样品就实现了对待测样品的淋巴细胞免疫分型，并统计出了每个细胞亚群的含量；且本发明提供的方法能够准确将各个细胞亚群进行免疫分型。
对比例1不同的B淋巴细胞表面标记对B淋巴细胞精细免疫分型和定量分析的影响
在B细胞精细免疫分型方法建立过程中，也需要选择合适的表面标志(即，表面抗原组合)和准确简易的划门策略。以过渡B细胞(transitionalBcell)为例，目前有多种过渡B细胞的特异性表面抗原组合，如CD19+CD38++CD24++IgM++/CD19+CD38++CD24++(+表示阳性，++表示强阳性)。
以CD19、CD38、CD24、IgM相组合，以抗CD19的抗体、抗CD38的抗体、抗CD24的抗体、抗IgM的抗体作为检测抗体，对待测样品进行淋巴细胞免疫分型。数据分析时，第一步在CD19+的细胞中圈出CD24++IgM++的细胞P1，得图10-A；第二步，以P1为门圈出CD24++CD38++的目标细胞(TransitionalBcell)，得图10-B。从结果可知，由于IgM和CD24均为连续表达，P1细胞群分界不清，无法准确界定表达阳性/强阳性。
对比例2不同的T淋巴细胞表面标记对T淋巴细胞精细免疫分型和定量分析的影响
不同的淋巴细胞亚群具有不同的细胞表面标志，但是，并不是任何细胞表面标志的抗体都可以用于淋巴细胞的免疫分型和定量分析。在T细胞精细免疫分型中，以辅助中心/效应记忆T细胞为例，可用CD45RA和CD45RO表面标志(即抗原)区分辅助初始T细胞和辅助记忆T细胞，CCR7/CD62L/CD27任意一个标记区分辅助中心T细胞、辅助效应记忆T细胞。但CD62L易受PBMC提取过程中梯度离心和环境温度的影响；CCR7和CD45RA/CD45RO均为连续表达，用同型对照或者FMO对照划门很可能影响结果准确性和可操作性，导致无法准确区分各个细胞亚群。
图11为以CD45RO和CCR7相组合，以抗CD45RO的抗体和抗CCR7的抗体作为检测抗体，对待测样品进行淋巴细胞免疫分型，所得的流式图，从图中可知，相比本发明用CD45RA和CD27划分上述四群细胞，用CD45RO和CCR7组合划分的方式分群不清晰，对同型对照抗体滴度要求高，划门难度大。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种用于淋巴细胞免疫分型的方法，其特征在于，包括T淋巴细胞免疫分型和B淋巴细胞免疫分型；
所述T淋巴细胞免疫分型包括：
取不同的荧光标记的抗体，与待检测样品混合，孵育后，经流式细胞术检测，得检测数据，分析所述检测数据；
所述B淋巴细胞免疫分型包括：
取不同的荧光标记的抗体，与新的所述待检测样品混合，孵育后，经流式细胞术检测，得检测数据，分析所述检测数据；
所述T淋巴细胞免疫分型时，所用的抗体包括：
抗TCRαβ的抗体、抗TCRγδ的抗体、抗CD3的抗体、抗CD4的抗体、抗CD8的抗体、抗CD27的抗体和抗CD45RA抗体；
所述B淋巴细胞免疫分型时，所用的抗体包括：
抗CD19的抗体、抗IgD的抗体、抗CD38的抗体、抗CD24的抗体和抗CD27的抗体；
所述T淋巴细胞免疫分型时，所述分析的方法包括：
细胞表面标志CD3+TCRαβ+CD4-CD8-代表TCRαβ+双阴性T细胞；
细胞表面标志CD3+TCRγδ+代表γδT细胞；
细胞表面标志CD3+CD4+CD45RA+CD27+代表辅助初始T细胞；
细胞表面标志CD3+CD4+CD45RA+CD27-代表辅助耗竭T细胞；
细胞表面标志CD3+CD4+CD45RA-CD27+代表辅助中心记忆T细胞；
细胞表面标志CD3+CD4+CD45RA-CD27-代表辅助效应记忆T细胞；
细胞表面标志CD3+CD8+CD45RA+CD27+代表细胞毒性初始T细胞；
细胞表面标志CD3+CD8+CD45RA+CD27-代表细胞毒性耗竭T细胞；
细胞表面标志CD8+CD45RA-CD27+代表细胞毒性中心记忆T细胞；
细胞表面标志CD3+CD8+CD45RA-CD27-代表细胞毒性效应记忆T细胞；
所述B淋巴细胞免疫分型时，所述分析的方法包括：
细胞表面标志CD19+CD27+代表记忆B细胞；
细胞表面标志CD19+CD27-IgD+代表初始B细胞；
细胞表面标志CD19+CD24++CD38++代表过渡B细胞；
细胞表面标志CD19+CD24-CD38++代表浆母细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括统计所述待检测样品中各个淋巴细胞亚群的数目的步骤，包括：
检测所述待检测样品中淋巴细胞的总数；
检测所述待检测样品中T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK淋巴细胞占所述淋巴细胞的百分比；
通过计算，即得所述待检测样品中T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK淋巴细胞的数目。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，检测所述待检测样品中的T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK淋巴细胞占所述淋巴细胞的百分比的步骤，包括：
取不同的荧光标记的抗体，与新的所述待检测样品混合，孵育后，经流式细胞术检测，得检测数据，分析所述检测数据；
将淋巴细胞分为T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK淋巴细胞时，所用的抗体包括：
抗CD45的抗体、抗CD3的抗体、抗CD16的抗体、抗CD56的抗体、抗CD19的抗体。
4.一种用于如权利要求1所述的淋巴细胞免疫分型的方法的试剂盒，其特征在于，其包括用于T淋巴细胞免疫分型的抗体、用于B淋巴细胞免疫分型的抗体；
所述用于T淋巴细胞免疫分型的抗体包括如下不同的荧光标记的抗体：
抗TCRαβ的抗体、抗TCRγδ的抗体、抗CD3的抗体、抗CD4的抗体、抗CD8的抗体、抗CD27的抗体、抗CD45RA抗体；
所述用于B淋巴细胞免疫分型的抗体包括如下不同的荧光标记的抗体；
抗CD19的抗体、抗IgD的抗体、抗CD38的抗体、抗CD24的抗体、抗CD27的抗体。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，其还包括用于将淋巴细胞分为T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK淋巴细胞的抗体，具体为：
抗CD45的抗体、抗CD3的抗体、抗CD16的抗体、抗CD56的抗体、抗CD19的抗体。
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