CN104357478A - 一个水稻锌指蛋白基因的抗白叶枯病基因工程应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程领域，涉及一种锌指蛋白基因ZFP181过量表达转基因水稻的培育方法，重组载体和转化细胞、转基因水稻的鉴定方法及载体、转化细胞、培育方法在水稻抗白叶枯病上的应用。培育方法为(1)重组质粒pMD18T-ZFP181的获得；(2)重组质粒pCAMBIA1304-ZFP181的获得；(3)转基因植株获得。重组载体包括序列如SEQ ID NO.1所示的A20/AN1锌指蛋白基因ZFP181，通过DNA连接酶将基因ZFP181连接到植物表达载体，能够过量表达A20/AN1锌指蛋白，必要时可包括增强子；基因ZFP181参与水稻的抗病应答反应，增强ZFP181的表达能提高水稻抗白叶枯病性。

Description

一个水稻锌指蛋白基因的抗白叶枯病基因工程应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种锌指蛋白基因ZFP181过量表达转基因水稻的培育方法，在培育方法中使用的重组载体和转化细胞、转基因水稻的鉴定方法及以上载体、转化细胞、培育方法在水稻抗白叶枯病上的应用。

背景技术

A20/AN1锌指蛋白是一类具有A20或AN1锌指结构的蛋白，其广泛存在于真核生物中。已有研究结果表明，A20/AN1锌指蛋白在动物体中主要参与NF-κB介导的免疫反应，而在植物体中主要参与非生物胁迫响应。

OSISAP1为植物中分离的第一个A20/AN1锌指蛋白基因。OSISAP1的表达受冷、脱水、盐、水浸没(低氧)、重金属、机械伤害等胁迫及胁迫激素ABA的诱导。过量表达OSISAP1可提高转基因烟草幼苗对盐、冷及干旱的耐受性(Mukhopadhyay et al.，2004)。随着基因组测序的深入开展，人们在水稻、拟南芥、杨树、玉米和番茄基因组中分别鉴定了18、14、19、11和13个A20/AN1型锌指蛋白(Huang et al.，2008；Jin et al.，2007；Solanke et al.，2009；Vij and Tyagi，2006)。进一步分析研究发现植物中大部分A20/AN1家族锌指蛋白基因的表达受一种或多种非生物胁迫诱导(Huang et al.，2008；Jin et al.，2007；Solanke et al.，2009；Stroher et al.，2009；Vij and Tyagi，2006)，可能参与了非生物胁迫响应(Solanke etal.，2009；Vij and Tyagi，2006)

随着植物A20/AN1锌指蛋白家族基因的鉴定，关于该基因家族成员功能的鉴定也逐步展开。OsiSAP8受盐、干旱、脱水、冷、水浸没、伤害、重金属及ABA诱导。过量表达OsiSAP8能提高苗期烟草及水稻对盐，冷及干旱胁迫的耐受性。水稻ZFP177受冷及热胁迫诱导，过量表达ZFP177能提高转基因烟草幼苗对冷、热及氧化胁迫的耐受性，但导致转基因烟草幼苗对盐及干旱胁迫敏感。獐毛AlSAP受盐、冷、热胁迫及ABA、SA诱导，异源表达AlSAP能提高转基因酵母对渗透胁迫及离子胁迫的耐受性。过量表达AlSAP转基因烟草与野生型一样表现正常生长表型，同时能提高转基因烟草植株对冷、热、干旱及盐胁迫的耐受性。过量AlSAP转基因水稻表现与其转基因烟草相似结果，能提高其对冷、干旱及盐胁迫的耐受性。此外，AlSAP能提高转基因小麦的抗旱性及耐盐性(BenSaad et al.，2012a)。AtSAP12受冷及盐诱导，其重组蛋白四级结构随着氧化还原状态改变而改变，高浓度DTT和硫氧还蛋白TrxA，低浓度DTT，硫氧还蛋白与其依赖的NADPH均能降低氧化的AtSAP12聚合体，增加AtSAP12单体蛋白量。在盐及冷胁迫条件下，AtSAP12单体蛋白量显著降低，推测AtSAP12可能通过不同氧化还原状态下功能的改变而来参与非生物胁迫响应(Stroher et al.，2009)。AtSAP10表达受各种胁迫调节，包括金属及非金属离子(Cd、Zn、AsIII、AsIV，Ni和Mn)、ABA、热，盐和冷。AtSAP10能提高转基因拟南芥对高温、Zn、Mn和Ni胁迫耐受性(Dixit and Dhankher，2011)。

以上研究表明A20/AN1型锌指蛋白在植物抗逆应答反应中发挥了重要的作用，然而该类基因在植物抗病应答反应中的研究还罕见报道。

发明内容

针对目前A20/AN1型锌指蛋白类基因在植物抗病应答反应中研究的空白，公开水稻A20/AN1锌指蛋白基因ZFP181在抗白叶枯病基因工程中的应用，过量表达该基因可以提高植物的抗白叶枯病性，有利于水稻抗病性遗传改良。

本发明的目的具体通过以下技术手段获得：

1.本发明提供一种重组载体，该载体包括序列如SEQ ID NO.1所示的A20/AN1锌指蛋白基因ZFP181，通过DNA链接酶将基因ZFP181连接到载体，能够过量表达A20/AN1锌指蛋白。

所述表达载体可使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体等，该表达载体以任何一种启动子启动表达，例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、Ubiquitin启动子、Actin启动子，自身基因启动子或其它启动子，该表达载体中必要时可包括增强子，不论是转录增强子或翻译增强子。

2.本发明还提供包括上述1重组载体的转化细胞。

3.本发明提供一种锌指蛋白基因ZFP181过量表达转基因水稻的培育方法，该方法包括如下步骤：

(1)重组质粒pMD18T-ZFP181的获得

选用水稻粳稻品种韭菜青，参照Invitrogen公司的Trizol法提取总RNA，参照Ferments公司反转录系统合成韭菜青cDNA第一链；设计基因克隆引物上游引物ZFP181F：5′-AACCCATTCCCAAAAGCA-3′，下游引物ZFP181R：5′-CCATCCAACTTCCAACCTCA-3′，以反转录获得的韭菜青cDNA为模板，通过PCR扩增ZFP181基因全长；通过TA-克隆系统将ZFP181基因片段连接到pMD18-T载体，获得重组质粒pMD18T-ZFP181；

(2)重组质粒pCAMBIA1304-ZFP181的获得

根据ZFP181基因序列，以步骤(1)中获得的重组质粒pMD18T-ZFP181为模板，设计引物对，通过PCR扩增ZFP181基因全长；利用Nco I与BstP I将ZFP181全长正向插入植物双元表达载体pCAMBIA1304的CaMV 35S启动子下游，获得重组质粒pCAMBIA1304-ZFP181；

(3)转基因植株获得

将获得的重组载体pCAMBIA1304-ZFP181转化农杆菌EHA105；以水稻粳稻品种“中花11”为受体，通过农杆菌介导的水稻遗传转化将重组载体pCAMBIA1304-ZFP181中包含目的基因ZFP181的T-DNA区整合到水稻基因组中，从而获得ZFP181过量表达转基因植株。

转化方法可用农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法或其它方法转化植物。

4.权利要求3所述的锌指蛋白基因ZFP181过量表达转基因水稻的培育方法，其特征在于：步骤(1)重组质粒pMD18T-ZFP181的获得过程中使用的引物对，上游引物ZFP181F：5′-AACCCATTCCCAAAAGCA-3′，下游引物ZFP181R：5′-CCATCCAACTTCCAACCTCA-3′；步骤(2)重组质粒pCAMBIA1304-ZFP181的获得过程中，设计的引物对为ZFP181F-30a：5′-TCTCGGATTCGACCATGGC-3′；ZFP181Rs：5′-GAGGTAACCGGAAAATTC AGGTTG-3′。

5.转锌指蛋白基因ZFP181水稻的鉴定方法，其特征在于：该方法包括如下步骤(1)设计转基因检测引物对：LacZ-F：5′-GGCTCGTATGTTGTGTGGAA-3′，181RT2-R：5′-AGTCGTGGCGGTCGGAGTA-3′，对提取的转基因水稻DNA进行PCR检测，能够扩增出1313bp DNA片段的植株即为ZFP181过量表达转基因水稻阳性植株；从而确定ZFP181过量表达转基因水稻阳性植株；

(2)设计ZFP181基因特异引物181RT4-F：5′-AGGAG CCGACGGAGCTGAGG-3′与181RT4-R：5′-TTGTTGGTCGCCGGGTTGCC-3′及内参基因18SrRNA引物18S-F：5′-ATGGTGGTGACGGGTGAC-3′，18S-R：5′-CAGACACTAAAGCGCCCGGTA-3′，以野生型水稻作对照，对待检测转基因水稻进行实时荧光定量PCR分析；通过与野生型对照相比，ZFP181基因的表达高于野生型对照的植株即为ZFP181过量表达转基因水稻阳性植株；

(3)提取ZFP181过量表达转基因植株DNA并利用EcoR I对各个转基因株系基因组DNA进行酶切，以hptII基因编码区内583bp DNA序列为模板，通过随机引物扩增获得地高辛标记的探针，进行Southern杂交分析，具有阳性检测条带的待检测转基因水稻为ZFP181过量表达转基因水稻阳性植株。

6.序列如SEQ ID NO.1所示的A20/AN1锌指蛋白基因ZFP181在抗白叶枯病水稻育种上的应用，其特征在于：增强所述的A20/AN1锌指蛋白基因ZFP181的表达，能够提高水稻的抗白叶枯病性。

7.权利要求1所述的重组载体在抗白叶枯病水稻育种上的应用。

8.权利要求2所述的转化细胞在抗白叶枯病水稻育种上的应用。

9.权利要求3-4任一项所述培育方法抗白叶枯病上的应用。

10.根据权利要求3-4任一项所述方法制成的转基因水稻在抗白叶枯病上的应用。

有益效果：

1.本发明公开了一种过量表达水稻ZFP181基因的抗白叶枯病性基因工程应用。该基因来自水稻(Oryza sativa L.)，能够在水稻中稳定过量表达，过量表达该基因可以提高水稻的抗白叶枯病性，有利于水稻抗病性遗传改良。

2.本发明人提供的ZFP181基因功能是参与水稻的抗病应答反应，属于诱导性表达，正常情况下，水稻A20/AN1锌指蛋白正常表达，当水稻收到白叶枯病感染后能及时在白叶枯病的诱导下过量表达蛋白，既能提高水稻的抗病性，也避免水稻在正常情况下过表达蛋白而影响产量。

3.利用本发明ZFP181基因作为目的基因构建植物表达载体，其中可用任何一种启动子例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、Ubiquitin启动子、Actin启动子，自身基因启动子或其它启动子，该表达载体中必要时可包括增强子，不论是转录增强子或翻译增强子。为了简化转化细胞的鉴定可使用选择性标记包括对抗生素抗性的酶，对除草剂具有抗性的酶，也可利用颜色变化(例如β-葡糖醛酸糖苷酶GUS)或发光(例如荧光素酶)来识别的化合物的酶类，也可用无标记选择。

附图说明

图1重组质粒pCAMBIA1304-ZFP181载体的构建

A.重组质粒pCAMBIA1304-ZFP181的载体结构图。B.重组质粒pCAMBIA1304-ZFP181双酶切鉴定。M1：DNA分子标记DL2000plus；M2：DNA分子标记DL15k bps；1：重组质粒pCAMBIA1304-ZFP181；2：重组质粒pCAMBIA1304-ZFP181pro经BstP I和Nco I双酶切

图2重组质粒pTCK303-ZFP181载体的构建

A.重组质粒pTCK303-ZFP181的载体结构图。B.重组质粒pTCK303-ZFP181双酶切鉴定。M1：DNA分子标记DL2000plus；M2：DNA分子标记DL15k bps；1：重组质粒pTCK303-ZFP181经Kpn I和BamH I双酶切；2：重组质粒pTCK303-ZFP181经Sac I和Spe I双酶切；3重组质粒pTCK303-ZFP181经SacI和BamHI双酶切；4：重组质粒pTCK303-ZFP181

图3 ZFP181过量表达转基因水稻的PCR鉴定

1-14：ZFP181过量表达转基因水稻T₀代株系；WT，-，+：分别为野生型(中花11)，阴性对照，阳性对照；M：DNA分子标记DL2000plus。

图4 ZFP181RNAi干涉抑制表达转基因水稻的PCR鉴定

1-33：ZFP181干涉抑制表达转基因水稻T₀代株系；WT，-，+：分别为野生型(中花11)，阴性对照，阳性对照；M：DNA分子标记DL2000plus。

图5 ZFP181转基因水稻植株的Real-time PCR和Southern blot鉴定

A.Real-time PCR鉴定ZFP181过量表达转基因水稻。B.Real-time PCR鉴定ZFP181RNAi转基因水稻。C.Southern blot鉴定ZFP181过量表达转基因水稻。D.Southern blot鉴定ZFP181RNAi抑制表达转基因水稻。Ox1-Ox8：ZFP181过量表达转基因株系；Wild type：野生型植株；Kd1-Kd8：ZFP181RNAi转基因株系。

图6 ZFP181转基因水稻白叶枯病抗性鉴定

A.ZFP181转基因水稻白叶枯病抗性鉴定；B.ZFP181转基因水稻剑叶经白叶枯侵染14后病斑长度统计。

Ox3，Ox4：ZFP181过量表达转基因水稻株系；WT：野生型植株；Kd2，Kd4：ZFP181 RNAi转基因株系。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。

实施例1.

锌指蛋白基因ZFP181过量表达转基因水稻的培育

(1)重组质粒pMD18T-ZFP181的获得

选用水稻粳稻品种韭菜青，于人工气候培养箱(16h光照/8h黑暗，白天30℃夜晚26℃)中水培生长，营养液采用国际水稻所常规营养液配方。待幼苗生长至3-4叶期时，取幼苗于液氮中速冻并于-80℃冰箱中保存备用。取保存的水稻幼苗样品，参照Invitrogen公司的Trizol法提取总RNA的提取。总RNA的质量以及浓度通过1％琼脂糖凝胶电泳分析，获得符合质量的总RNA即28s rRNA和18s sRNA条带清晰，进一步用于合成cDNA第一链。cDNA第一链的合成参照Ferments公司反转录系统的操作手册进行。

设计基因克隆引物ZFP181F：5′-AACCCATTCCCAAAAGCA-3′及ZFP181R：5′-CCATCCAACTTCCAACCTCA-3′，以反转录获得的韭菜青cDNA为模板，通过PCR扩增ZFP181基因全长。PCR扩增使用Prime star HS DNA聚合酶(Takara)，PCR程序如下：98℃预变性5min，98℃变性5s，56℃复性10s，72℃延伸40s，30个循环后，72℃10min。然后在PCR产物中加入普通DNA聚合酶72℃保温30min，通过电泳检测PCR扩增结果并利用DNA片段纯化试剂盒回收所扩增的DNA片段。进一步通过TA-克隆系统将DNA片段连接到pMD18-T载体，利用CaCl₂转化法将其转入大肠杆菌DH5α中获得重组质粒pMD18T-ZFP181。重组质粒经测序后获得具有完整ORF的水稻A20/AN1锌指蛋白基因ZFP181的cDNA序列SEQ ID NO.1。ZFP181的ORF全长516bp，编码171个氨基酸。

(2)重组质粒pCAMBIA1304-ZFP181的获得

根据ZFP181基因序列，设计一对载体构建引物ZFP181F-30a：5′-TCTCGGATTCGACCATGGC-3′与ZFP181Rs：5′-GAGGTAACCGGAAAATTCAGGTTG-3′，以实施例1中获得的重组质粒pMD18T-ZFP181为模板通过PCR扩增ZFP181基因全长。利用Nco I与BstP I将ZFP181全长正向插入植物双元表达载体pCAMBIA1304的CaMV 35S启动子下游，获得重组质粒pCAMBIA1304-ZFP181并通过测序验证其正确性(图1)。

(3)转基因植株获得

将获得的重组载体通过冻融法转化农杆菌EHA105。以水稻粳稻品种“中花11”为受体，通过农杆菌介导的水稻遗传转化将重组载体pCAMBIA1304-ZFP181中目的基因ZFP181的T-DNA区整合到水稻基因组中，从而获得ZFP181过量表达转基因植株。

实施例2

锌指蛋白基因ZFP181RNAi转基因水稻的培育

步骤(1)重组质粒pMD18T-ZFP181的获得如实施例1

(2)重组质粒pTCK303-ZFP181的获得

利用在线RNAi靶定位点预测软件(http：//bioinfo.clontech.com/rnaidesignerhttp：//www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)，对ZFP181全长cDNA序列的可能siRNA位点进行预测，选取可能siRNA位点最多且序列特异性最好的cDNA片段，长度为254bp，作为干涉区段插入植物干涉表达载体。根据选取的干涉区段设计引物RNAi-181F1：5′-GGTACCGTTAGGTTCTAAAAGGATAATAC-3′与RNAi-181R1：5′-TTGGATCCTCAACCACCACTACA-3′，以重组质粒pMD18T-ZFP181为模板扩增干涉DNA区段并通过BamHI和Kpn I酶切位点将该序列反向插入pTCK303植物干涉表达载体MCS1中获得pTCK303-C1。同时，设计引物RNAi-181F2：5′-CCA AACTAGTTAGGTTCTAAAAGGATAATAC-3′与RNAi-181R2：5′-GAGCTCAACCTCAACCACCACTA-3′，以重组质粒pMD18T-ZFP181为模板扩增干涉DNA区段并通过Spe I与Sac I酶切位点将该序列正向插入pTCK303-C1植物干涉表达载体MCS2中，从而获得重组质粒pTCK303-ZFP181并通过测序验证其正确性(图2)。

(3)转基因植株获得

将获得的重组载体通过冻融法转化农杆菌EHA105。以水稻粳稻品种中花11为受体，通过农杆菌介导的水稻遗传转化将重组载体pTCK303-ZFP181中包含目的片段的T-DNA区整合到水稻基因组中，从而获得ZFP181 RNAi转基因植株。

实施例3

ZFP181过量表达转基因水稻分子鉴定

取T3代转基因水稻叶片，通过SDS小量DNA提取法提取水稻基因组DNA。以提取的DNA为模板，通过引物LacZ-F：5′-GGCTCG TATGTTGTGTGGAA-3′与181RT2-R：5′-AGTCGTGGCGGTCGGAGTA-3′进行PCR检测，其中能够扩增出1313bp DNA片段的植株即为ZFP181过量表达转基因水稻阳性植株，结果所检测的14株水稻植株中有13株为ZFP181过量表达转基因水稻阳性植株(图3)。

设计ZFP181基因特异引物181RT4-F：5′-AGGAGCCGACGGAGCTGAGG-3′与181RT4-R：5′-TTGTTGGTCGCCGGGTTGCC-3′及内参基因18S rRNA引物18S-F：5′-ATGGTGGTGACGGGTGAC-3′，18S-R：5′-CAGACACTAAAGCGCCCGGTA-3′，对ZFP181过量表达转基因水稻阳性植株进行实时荧光定量PCR分析，结果表明所检测的8个阳性转基因水稻株系除Ox6和Ox7外，其余6个阳性转基因水稻株系中ZFP181基因的表达均高于野生型对照(图5-A)

提取ZFP181过量表达转基因植株DNA并利用EcoR I对各个转基因株系基因组DNA进行酶切，以hptII基因编码区内583bp DNA序列为模板，通过随机引物扩增获得地高辛标记的探针，从而进行Southern杂交分析，实验方法参照Southern杂交试剂盒(Roche)，结果显示所检测的转基因株系成功整合了外源目的DNA(图5-C)

实施例4

锌指蛋白基因ZFP181RNAi转基因水稻的分子鉴定

设计多克隆插入位点MCS2两侧载体特异性引物LacZ-F：5′-GGCTCG TATGTTGTGTGGAA-3′与P303C2-R：5′-TGGTCCAGTCTTTCCGCTGATA-3′，以提取的DNA为模板进行PCR阳性验证，其中能够扩增出934bp DNA片段的植株即为ZFP181 RNAi转基因水稻阳性植株，结果所检测的33株水稻中有23株为ZFP181 RNAi转基因水稻阳性植株(图4)。

设计ZFP181基因特异引物181RT4-F：5′-AGGAGCCGACGGAGCTGAGG-3′(SEQ ID NO.12)与181RT4-R：5′-TTGTTGGTCGCCGGGTTGCC-3′(SEQ ID NO.13)及内参基因18S rRNA引物18S-F：5′-ATGGTGGTGACGGGTGAC-3′(SEQ IDNO.14)，18S-R：5′-CAGACACTAAAGCGCCCGGTA-3′(SEQ ID NO.15)，对ZFP181 RNAi转基因水稻阳性植株进行实时荧光定量PCR分析。结果表明所检测的8个阳性转基因水稻株系中ZFP181基因的表达均低于野生型对照(图5-B)。

提取ZFP181 RNAi转基因植株DNA并利用EcoR I对各个转基因株系基因组DNA进行酶切，以hptII基因编码区内583bp DNA序列为模板，通过随机引物扩增获得地高辛标记的探针，从而进行Southern杂交分析，实验方法参照Southern杂交试剂盒(Roche)，结果显示所检测的转基因株系成功整合了1-3个拷贝外源目的DNA(图5-D)

实施例5

转基因植株抗病性鉴定

分别将ZFP181过量表达转基因水稻和ZFP181 RNAi转基因水稻播种并种植于大田中生长到孕穗期，对水稻植株剑叶进行剪叶接种白叶枯病菌，具体方法如下：首先将白叶枯菌系Z173划线于牛肉汁蛋白胨培养基(蛋白胨5-10g/L，牛肉浸膏3g/L，酵母浸膏1g/L，蔗糖10g/L，琼脂15/L，PH 6.8-7.0)，28-30℃恒温培养箱中培养2-5天至长出菌落。然后将白叶枯菌落用去离子水重悬并稀释至OD₆₀₀＝0.5(菌液浓度约为5X 10⁸cfu/mL)，用于进一步水稻叶片接菌。接种时将剪刀进入白叶枯菌悬液1-2s，再用沾有菌液的剪刀从距剑叶顶部1-2cm处剪去叶尖，每株水稻接菌3-5片剑叶，每个株系接菌3-5株植株，接菌2-3周后，统计发病情况。结果显示ZFP181过量表达转基因水稻接菌叶片病斑长度显著低于野生型水稻，而ZFP181 RNAi干涉抑制转基因水稻接菌叶片病斑长度与野生型无明显差异，表明ZFP181过量表达能增强水稻对白叶枯病的抗性(图6)。

可以知道，上述实施例仅为了说明发明原理而采用的示例性实施方式，然而本发明不仅限于此，本领域技术人员在不脱离本发明实质情况下，可以做出各种改进和变更，这些改进和变更也属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种重组载体，其特征在于：该载体包括序列如SEQ ID NO.1所示的A20/AN1锌指蛋白基因ZFP181，通过DNA连接酶将基因ZFP181连接到植物表达载体，能够过量表达A20/AN1锌指蛋白ZFP181。

2.包括权利要求1所述重组载体的转化细胞。

3.一种锌指蛋白基因ZFP181过量表达转基因水稻的培育方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

(1)重组质粒pMD18T-ZFP181的获得

选用水稻粳稻品种韭菜青，参照Invitrogen公司的Trizol法提取总RNA，参照Ferments公司反转录系统合成韭菜青cDNA第一链；设计基因克隆引物，以反转录获得的韭菜青cDNA为模板，通过PCR扩增ZFP181基因全长；通过TA-克隆系统将ZFP181基因片段连接到pMD18-T载体，获得重组质粒pMD18T-ZFP181；

(2)重组质粒pCAMBIA1304-ZFP181的获得

根据ZFP181基因序列，以步骤(1)中获得的重组质粒pMD18T-ZFP181为模板，设计引物对，通过PCR扩增ZFP181基因全长；利用Nco I与BstP I将ZFP181全长正向插入植物双元表达载体pCAMBIA1304的CaMV 35S启动子下游，获得重组质粒pCAMBIA1304-ZFP181；

(3)转基因植株获得

将获得的重组载体pCAMBIA1304-ZFP181转化农杆菌EHA105；以水稻粳稻品种中花11为受体，通过农杆菌介导的水稻遗传转化将重组载体pCAMBIA1304-ZFP181中包含目的基因ZFP181的T-DNA区整合到水稻基因组中，从而获得ZFP181过量表达转基因植株。

4.权利要求3所述的锌指蛋白基因ZFP181过量表达转基因水稻的培育方法，其特征在于：步骤(1)重组质粒pMD18T-ZFP181的获得过程中使用的引物对，上游引物ZFP181F：5′-AACCCATTCCCAAAAGCA-3′，下游引物ZF 181R：5′-CCATCCAACTTCCAACCTCA-3′；步骤(2)重组质粒pCAMBIA1304-ZFP181的获得过程中，设计的引物对为ZFP181F-30a：5′-TCTCGGATTCGACCATGGC-3′；ZFP181Rs：5′-GAGGTAACCGGAAAATTC AGGTTG-3′。

5.转锌指蛋白基因ZFP181水稻的鉴定方法，其特征在于：该方法包括如下步骤(1)设计转基因检测引物对：LacZ-F：5′-GGCTCGTATGTTGTGTGGAA-3′，181RT2-R：5′-AGTCGTGGCGGTCGGAGTA-3′；对待检测的转基因水稻DNA进行PCR检测，能够扩增出1313bp DNA片段的植株即为ZFP181过量表达转基因水稻阳性植株；

(2)设计ZFP181基因特异引物181RT4-F：5′-AGGAG CCGACGGAGCTGAGG-3′与181RT4-R：5′-TTGTTGGTCGCCGGGTTGCC-3′及内参基因18SrRNA引物18S-F：5′-ATGGTGGTGACGGGTGAC-3′，18S-R：5′-CAGACACTAAAGCGCCCGGTA-3′，以野生型水稻作对照，对待检测转基因水稻进行实时荧光定量PCR分析；通过与野生型对照相比，ZFP181基因的表达高于野生型对照的植株即为ZFP181过量表达转基因水稻阳性植株；

(3)提取待检测转基因植株DNA并利用EcoR I对各个转基因株系基因组DNA进行酶切，以hptII基因编码区内583bp DNA序列为模板，通过随机引物扩增获得地高辛标记的探针，进行Southern杂交分析，具有阳性检测条带的待检测转基因水稻为ZFP181过量表达转基因水稻阳性植株。

6.序列如SEQ ID NO.1所示的A20/AN1锌指蛋白基因ZFP181在抗白叶枯病水稻育种上的应用，其特征在于：增强所述的A20/AN1锌指蛋白基因ZFP181的表达，能够提高水稻的抗白叶枯病性。

7.权利要求1所述的重组载体在抗白叶枯病水稻育种上的应用。

8.权利要求2所述的转化细胞在抗白叶枯病水稻育种上的应用。

9.权利要求3-4任一项所述培育方法在抗白叶枯病转基因水稻育种上的应用。

10.根据权利要求3-4任一项所述方法制成的转基因水稻在抗白叶枯病上的应用。