CN104357441B - 与黄瓜果实苦味性状相关的snp标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种与黄瓜果实苦味性状相关的SNP标记及其应用，其位于编码黄瓜转录因子Csa5G157230基因(Bt基因)起始密码子上游第1601bp处(SNP‑1601)。此处碱基为G的黄瓜果实苦味表型不稳定，易受到外界环境的影响，在逆境条件(如低温、干旱等)下，黄瓜果实易变苦；此处碱基为A的黄瓜则不苦。本发明以控制果实苦味合成的转录因子Bt基因为线索，通过遗传群体分析筛选到与黄瓜果实苦味性状紧密相关的SNP标记，并借助黄瓜无苦味天然突变体阐释了SNP‑1601与Bt基因、Bi基因、逆境胁迫及果实苦味性状之间的关系。本发明进一步揭示了黄瓜果实苦味形成的分子机制，为无苦味黄瓜育种提供了理论依据和分子辅助育种目标，利用SNP‑1601可加快无苦味黄瓜的育种进程。

Description

与黄瓜果实苦味性状相关的SNP标记及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及一种与黄瓜果实苦味性状相关的SNP标记及其应用。
背景技术
黄瓜的苦味是由一类称为葫芦素C的三萜化合物导致的。黄瓜果实中积累葫芦素C会严重影响黄瓜的品质。早期的经典遗传试验发现黄瓜的苦味有Bi和Bt两个基因控制。Bi基因主要控制叶片苦味，Bt基因主要控制黄瓜果实苦味。其中隐性bi基因对Bt基因具有上位效应。通过大规模重测序以及遗传分析我们先后克隆了Bi和Bt基因，它们分别编码氧化角鲨烯环化酶及bHLH类转录因子。Bi基因是苦味合成的关键限速酶，在叶片或黄瓜中参与苦味的合成。Bt基因在黄瓜果实中特异表达，通过调控Bi基因的表达，控制黄瓜果实苦味性状。通过揭示黄瓜苦味合成、调控及驯化的分子遗传机理，为利用分子标记辅助无苦味黄瓜育种打下坚实的基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种与黄瓜果实苦味性状相关的SNP标记及其应用。
为了实现本发明目的，本发明的一种与黄瓜果实苦味性状相关的SNP标记，其位于编码黄瓜转录因子Csa5G157230基因起始密码子上游第1601bp处，此处碱基为G的黄瓜果实表型不稳定，易受到外界环境的影响，在逆境条件下黄瓜果实易变苦，此处碱基为A的黄瓜则不苦。其中，所述逆境条件包括但不限于低温、干旱等逆境条件。
本发明中涉及的黄瓜转录因子Csa5G157230的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。已在CN 103739685A中公开。
本发明还提供用于检测所述与黄瓜果实苦味性状相关的SNP标记的引物对，包括正向引物F5’-TGGTAGGTGTAGCTTAATCATTCTCCTTTG-3’和反向引物R5’-AAGTTGGTGAAGTAATAGTGTCCAACC-3’。
本发明还提供所述与黄瓜果实苦味性状相关的SNP标记在鉴定苦味黄瓜品种中的应用。包括以下步骤：
1)提取待测黄瓜的基因组DNA；
2)以待测黄瓜的基因组DNA为模板，利用权利要求2所述引物F和R，进行PCR扩增反应；
3)检测PCR扩增产物。
其中，步骤2)中PCR反应使用的扩增体系以20μl计为：10-20ng/μl模板DNA 1μl，10pmol/μl引物F和R各1μl，10mmol/L dNTP mix 0.4μl，0.5U/μL Taq DNA聚合酶0.3μl，10×PCR反应缓冲液2μl，余量为水。
PCR反应条件为：94℃5分钟；94℃20秒，58℃20秒，72℃30秒，35个循环；72℃10分钟。
本发明进一步提供所述与黄瓜果实苦味性状相关的SNP标记在黄瓜分子标记辅助育种中的应用，即根据基因型进行苦味或不苦黄瓜品种的选育，从而加快无苦味黄瓜的育种进程。
本发明首先对115份黄瓜核心种质材料进行重测序分析，并对这115份材料进行果实苦味表型鉴定。结果发现一个与黄瓜果实苦味性状关联的SNP位点，位于编码黄瓜转录因子Csa5G157230基因(Bt基因)起始密码子上游第1601bp处(SNP-1601)。115份材料中，有9份不能合成苦味的bi材料，因此果实必然是不苦表型。在剩余106份可以合成苦味的Bi材料中，有69份在SNP-1601处为G，22份为A，剩余15份材料在该位点为杂合或是不明确。其中，22份在SNP-1601为A的材料在两年的田间实验中均未不苦；而69份在SNP-1601为G的材料中，大部分的材料(42份)在两年的田间实验中出现表型不一致情况，即不苦和苦的表型都出现过，说明其苦味表型易受外界环境影响，表型不稳定。随机选取不同基因型材料的果实进行基因表达分析及苦味含量检测，发现在SNP-1601处为A的不苦黄瓜材料中Bi和Bt基因表达非常低，而在在SNP-1601处为G的黄瓜果实中Bi和Bt基因表达相对较高(图1)。因此，SNP-1601有可能通过调节黄瓜果实中的Bt基因表达，来控制其Bi基因的表达及苦味的含量。
此外，还发现了对逆境胁迫不响应的天然突变体han，可以用来进一步解析SNP-1601与Bt基因、Bi基因、逆境胁迫及果实苦味表型之间的关系。在正常生长环境中，野生型HAN及其突变体han均为果实不苦的黄瓜，但在逆境条件下，如低温、干旱等，HAN的果实变苦，而han的果实则仍为不苦。通过对这两种黄瓜进行重测序分析，发现han中的突变就位于SNP-1601，即HAN在SNP-1601中为G；han在SNP-1601中为A。然后构建了一个由223个单株组成的F2群体，通过鉴定这些单株的基因型和果实表型数据，发现SNP-1601与果实苦味表型共分离(图2)。通过检测正常环境下和逆境环境下，HAN和han的果实中Bi和Bt基因的表达量及苦味含量，发现逆境胁迫使HAN的果实中Bt基因的表达升高，从而导致Bi基因表达也升高，最终使果实中苦味含量升高，黄瓜变苦；突变后这种逆境胁迫则不能诱导Bi和Bt基因的表达(图3)。因此SNP-1601对于栽培黄瓜响应逆境胁迫是不可或缺的关键因素之一。
本发明可用于大规模筛选育种材料，大大加快黄瓜的育种进程；也可以用于通过基因工程改良技术提高黄瓜的品质性状。
附图说明
图1为本发明实施例2中用qPCR和HPLC分别检测不同黄瓜核心种质材料果实中Bt(A)、Bi基因(B)的表达情况及苦味物质的含量(C)。
图2为本发明实施例3中223个F2遗传群体进一步确认SNP-1601与果实苦味表型共分离。
图3为本发明实施例3中用qPCR和HPLC分别检测HAN及其天然突变体han在正常和低温胁迫下，果实中Bt(A)、Bi基因(B)的表达情况及苦味物质的含量(C)。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1挖掘与黄瓜果实苦味性状关联的SNP
从世界各地收集了3000多份黄瓜资源，从其中挑选115份作为黄瓜核心种质资源，它们代表了80％的遗传多样性。对每份资源进行重测序，产生5G左右的数据量，平均覆盖10倍黄瓜基因组。同时还对这115份种质资源进行了果实苦味表型鉴定。通过比较不同材料的Bt基因，发现了在其编码黄瓜转录因子Csa5G157230基因(Bt基因)起始密码子上游第1601bp处(SNP-1601)。此处碱基为G的黄瓜果实表型不稳定，易受到外界环境的影响，在逆境条件下，如低温、干旱等，黄瓜果实易变苦，此处碱基为A的黄瓜则不苦(表1)。
表1黄瓜核心种质资源中SNP-1601与果实苦味性状的关系
编号 群体 SNP-1601 果实表型
CG0001 印度 G 极苦
CG0002 印度 G 极苦
CG0004 印度 G 极苦
CG0005 印度 G 极苦
CG0020 印度 G 极苦
CG0003 印度 G 苦
CG0010 印度 G 苦
CG0011 印度 G 苦
CG0014 印度 G 苦
CG0015 印度 G 苦
CG0016 印度 G 苦
CG0017 印度 G 苦
CG1031 东亚 G 苦
CG3007 东亚 G 苦
CG5234 欧亚 G 苦
CG5483 欧亚 G 苦
CG5539 欧亚 G 苦
CG7086 欧亚 G 苦
CG8119 印度 G 苦
CG1043 东亚 G 不苦
CG3087 东亚 G 不苦
CG5797 欧亚 G 不苦
CG7023 欧亚 G 不苦
CG7702 印度 G 不苦
CG8094 印度 G 不苦
CG8160 印度 G 不苦
CG8163 印度 G 不苦
CG3010 东亚 G 不确定
CG3076 东亚 G 不确定
CG4182 东亚 G 不确定
CG4357 东亚 G 不确定
CG5232 欧亚 G 不确定
CG5420 欧亚 G 不确定
CG5670 欧亚 G 不确定
CG5756 欧亚 G 不确定
CG6562 欧亚 G 不确定
CG6586 欧亚 G 不确定
CG6600 欧亚 G 不确定
CG6663 欧亚 G 不确定
CG7017 欧亚 G 不确定
CG7110 欧亚 G 不确定
CG7704 欧亚 G 不确定
CG7747 印度 G 不确定
CG7748 印度 G 不确定
CG8039 印度 G 不确定
CG8093 印度 G 不确定
CG8099 印度 G 不确定
CG8216 印度 G 不确定
CG8712 印度 G 不确定
CG8724 印度 G 不确定
CG8916 印度 G 不确定
CG9143 西双版纳 G 不确定
CG9146 西双版纳 G 不确定
CG9153 西双版纳 G 不确定
CG9160 西双版纳 G 不确定
CG9164 西双版纳 G 不确定
CG9165 西双版纳 G 不确定
CG9169 西双版纳 G 不确定
CG9174 西双版纳 G 不确定
CG9185 西双版纳 G 不确定
CG9187 西双版纳 G 不确定
CG9191 西双版纳 G 不确定
CG9192 西双版纳 G 不确定
CG9197 西双版纳 G 不确定
CG9198 西双版纳 G 不确定
CG9199 西双版纳 G 不确定
CG9201 西双版纳 G 不确定
CG9203 西双版纳 G 不确定
CG9207 西双版纳 G 不确定
CG1071 东亚 A 不苦
CG1077 东亚 A 不苦
CG1083 东亚 A 不苦
CG1247 东亚 A 不苦
CG1292 东亚 A 不苦
CG1373 东亚 A 不苦
CG1541 东亚 A 不苦
CG1602 东亚 A 不苦
CG1697 东亚 A 不苦
CG1778 东亚 A 不苦
CG1811 东亚 A 不苦
CG1876 东亚 A 不苦
CG3085 东亚 A 不苦
CG3143 东亚 A 不苦
CG4041 东亚 A 不苦
CG4210 东亚 A 不苦
CG4353 东亚 A 不苦
CG4358 东亚 A 不苦
CG4359 东亚 A 不苦
CG4360 东亚 A 不苦
CG5801 东亚 A 不苦
CG3011 东亚 A 不苦
黄瓜转录因子Csa5G157230的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
用于检测所述与黄瓜果实苦味性状相关的SNP标记的引物对，包括正向引物F5’-TGGTAGGTGTAGCTTAATCATTCTCCTTTG-3’和反向引物R5’-AAGTTGGTGAAGTAATAGTGTCCAACC-3’。
利用上述SNP标记鉴定苦味黄瓜，包括以下步骤：
1)提取待测黄瓜的基因组DNA；
2)以待测黄瓜的基因组DNA为模板，利用权利要求2所述引物F和R，进行PCR扩增反应；
3)检测PCR扩增产物。
其中，步骤2)中PCR反应使用的扩增体系以20μl计为：10-20ng/μl模板DNA 1μl，10pmol/μl引物F和R各1μl，10mmol/L dNTP mix 0.4μl，0.5U/μL Taq DNA聚合酶0.3μl，10×PCR反应缓冲液2μl，余量为水。
PCR反应条件为：94℃5分钟；94℃20秒，58℃20秒，72℃30秒，35个循环；72℃10分钟。
实施例2解析SNP-1601与果实苦味形成的分子机制
检测21份核心种质材料黄瓜果实中Bi、Bt基因的表达量以及苦味的含量(图1)。基因表达分析用荧光定量PCR仪ABI7900，方法参照罗氏qPCR试剂盒。Bi基因的检测利用正向引物5’-CATGTGCACAGGAGGATTTG-3’和反向引物5’-TCATTGCCTTTTCCCTCAAC-3’；Bt基因的检测利用正向引物5’-GTTGCTGATCACCCTCCATTGATCG-3’和反向引物5’-GCCTTCTTTGGCGTTCAACATCTCT-3’进行PCR扩增。黄瓜果实苦味含量测定利用高效液相色谱安捷伦1200，方法参考Balkema-Boomstra等(A.G.Balkema-Boomstra et al.,Role ofcucurbitacin C in resistance to spider mite(Tetranychus urticae)in cucumber(Cucumis sativus L.).J.Chem.Ecol.29,225-235(2003))。
实施例3利用天然突变体解析SNP-1601与逆境胁迫的关系
在正常环境条件下，黄瓜材料HAN(从韩国引进的黄瓜品种)的果实中不能积累苦味物质，但在逆境胁迫条件下，果实中易积累苦味物质。在多代种植过程中，发现了其天然突变体han。突变体在逆境环境中果实也不能积累苦味物质。因此，本实施例对野生型黄瓜HAN及其天然突变体han进行重测序，通过生物信息学方法寻找HAN与突变体han之间的突变位点。在确定han中的突变为SNP-1601后进一步进行了遗传分离实验。构建了一个由223个单株组成的F2群体，通过鉴定这些单株的基因型和果实表型数据，发现SNP-1601与果实苦味表型共分离(图2)。
进一步用之前介绍的基因表达量及苦味含量检测方法，分别对正常条件和低温胁迫下HAN及其han果实中的Bi、Bt基因表达及苦味含量进行检测(图3)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (4)

1.用于检测与黄瓜果实苦味性状相关的SNP标记的引物对，所述引物对为：正向引物F5’-TGGTAGGTGTAGCTTAATCATTCTCCTTTG-3’和反向引物R5’-AAGTTGGTGAAGTAATAGTGTCCAACC-3’；
所述与黄瓜果实苦味性状相关的SNP标记位于编码黄瓜转录因子Csa5G157230基因起始密码子上游第1601bp处，此处碱基为G的黄瓜果实表型不稳定，易受到外界环境的影响，在逆境条件下黄瓜果实易变苦，此处碱基为A的黄瓜则不苦；其中，所述逆境条件包括但不限于低温、干旱。
2.权利要求1所述引物对在鉴定苦味黄瓜品种中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取待测黄瓜的基因组DNA；
2)以待测黄瓜的基因组DNA为模板，利用所述引物F和R，进行PCR扩增反应；
3)检测PCR扩增产物；
其中，步骤2)中PCR反应使用的扩增体系以20μl计为：10-20ng/μl模板DNA 1μl，10pmol/μl引物F和R各1μl，10mmol/L dNTP mix 0.4μl，0.5U/μL Taq DNA聚合酶0.3μl，10×PCR反应缓冲液2μl，余量为水；
PCR反应条件为：94℃5分钟；94℃20秒，58℃20秒，72℃30秒，35个循环；72℃10分钟。
4.权利要求1所述引物对在黄瓜分子标记辅助育种中的应用。
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