CN104357328A - 克隆号为macc/p66的扁藻的筛选及培养方法 - Google Patents

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
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Abstract

本发明提供了一种克隆号为MACC/P66的扁藻的筛选及培养方法，涉及藻类培养技术领域。该方法的步骤如下：（1）在显微镜下用毛细管从扁藻属中筛选出克隆号为MACC/P66的扁藻作为藻种；（2）把藻种用修正的厄尔德-施赖伯培养液进行培养。运用本发明提供的方法对克隆号为MACC/P66的扁藻进行筛选和培养，筛选方法简单，而且在培养过程中藻种能够迅速繁殖，并在数天后分泌出含有虾青素的红色色素，虾青素在红色色素中的含量可高达16%，同时虾青素的重量能达到藻种重量的16%，而且该方法不会导致藻种死亡，藻种能继续用于生产虾青素。

Description

克隆号为MACC/P66的扁藻的筛选及培养方法
技术领域
本发明涉及藻类培养技术领域，尤其涉及一种克隆号为MACC/P66的扁藻的筛选及培养方法。 
背景技术
目前，天然的虾青素主要从雨生红球藻中提取，雨生红球藻将虾青素积累储藏到藻体内，提取虾青素时需要破壁，因此生产成本较高。雨生红球藻中的虾青素含量只能达到藻体重量的1.5%～3.0%，虾青素的含量较低。 
发明内容
本发明的目的在于解决目前从雨生红球藻中提取天然虾青素时需要破壁从而导致雨生红球藻死亡，以及雨生红球藻中的虾青素含量不高的问题，提供一种克隆号为MACC/P66的扁藻的筛选及培养方法，运用本发明提供的方法对克隆号为MACC/P66的扁藻进行筛选和培养，筛选方法简单，而且在培养过程中藻种能够迅速繁殖，并在数天后分泌出含有虾青素的红色色素，虾青素在红色色素中的含量可高达16%，同时虾青素的重量能达到藻种重量的16%，而且该方法不会导致藻种死亡，藻种能继续用于生产虾青素。 
为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下： 
本发明提供的克隆号为MACC/P66的扁藻的筛选及培养方法包括以下步骤：
（1）扁藻的筛选
在显微镜下用毛细管从扁藻属中筛选出克隆号为MACC/P66的扁藻作为藻种；
（2）藻种的培养
将维生素用少量蒸馏水溶解，再将pH值调整至4.5～5.0，再用蒸馏水将维生素的含量稀释至小于或等于0.1%，经微孔滤膜过滤后得到维生素水溶液；
将海水煮沸，然后冷却，用于配制厄尔德-施赖伯培养液；
把维生素水溶液加入厄尔德-施赖伯培养液得到修正的厄尔德-施赖伯培养液，其中，修正的厄尔德-施赖伯培养液中维生素的含量小于0.1%；
将藻种用修正的厄尔德-施赖伯培养液进行培养。
优选的，所述显微镜所采用的放大倍数为60X15。 
优选的，所述维生素为水溶性维生素中的一种或几种。 
优选的，所述维生素水溶液中用于调整pH值的酸为盐酸。 
优选的，所述微孔滤膜4.5μm。 
本发明的有益效果： 
本发明提供的克隆号为MACC/P66的扁藻的筛选及培养方法，筛选方法简单，而且在培养过程中藻种能够迅速繁殖，并在数天后直接在修正的厄尔德-施赖伯培养液中分泌出红色色素，经检测，红色色素中含有16%的虾青素，同时虾青素的重量能达到藻种重量的16%，虾青素含量较高，而且从藻种中提取虾青素，无需破壁，不会因此导致藻种死亡，藻种能继续用于生产虾青素，大大降低了提取虾青素的成本；另外，红色色素具有对光和热稳定、水溶性好的特点，红色色素通过凝胶色谱柱层析，即可得到纯天然虾青素；而且该方法是在室内采用密闭的生物反应器内进行的，因此操作过程中的条件易于控制，藻种不会流失而污染周边环境，而外来物种也无法侵入密闭的生物反应器。
具体实施方式
以下对本发明做进一步的说明，以下列举的实施例仅代表一种或几种最佳实施方式，不应该构成对本发明的限制。 
本发明提供的从扁藻中提取虾青素的方法包括以下步骤： 
（1）扁藻的筛选
在放大倍数为16X15的显微镜下用毛细管从扁藻属中筛选出克隆号为MACC/P66的扁藻作为藻种。其中，克隆号为MACC/P66的扁藻呈椭球状，藻体大小为3.0～4.2μm×9.0～10.5μm, 顶部生长有四根鞭毛，绝大多数以单细胞形式存在。
（2）藻种的培养 
将维生素用少量蒸馏水溶解，再用浓度为1N的盐酸将pH值调整至4.5～5.0，再用蒸馏水将维生素的含量稀释至小于或等于0.1%，经4.5μm微孔滤膜过滤后得到维生素水溶液。
将海水煮沸，然后冷却，用于配制厄尔德-施赖伯培养液。 
把维生素水溶液加入厄尔德-施赖伯培养液得到修正的厄尔德-施赖伯培养液，其中，修正的厄尔德-施赖伯培养液中维生素的含量小于0.1%，维生素为水溶性维生素中的一种或几种。 
将藻种加入到修正的厄尔德-施赖伯培养液中，在光照5000Lux, 30°C的条件下进行培养。 
经观察，藻种在培养一周后开始在修正的厄尔德-施赖伯培养液中分泌出一种红色色素。 
采用血球计数板法计算藻种的数量，培养两周后，每毫升的培养液中藻种的数量达到一百万个。 
采用以下方法将红色色素从修正的厄尔德-施赖伯培养液中分离出来： 
将溶解有红色色素的培养液和藻种在3000rpm下离心15分钟，分离得到溶解有红色色素的培养液以及藻种，分离出来的藻种可以放入到新的修正的厄尔德-施赖伯培养液中继续培养，而溶解有红色色素的培养液经国产721型分光光度仪检测，当波长为400nm时，O.D.>0.30。 
将溶解有红色色素的培养液加入到离子交换柱中，控制流速为1L/h，然后用蒸馏水冲洗离子交换柱至无氯离子检出为止，再用浓度为0.5N的氨水洗脱被吸附在离子交换柱上的红色色素，同时收集被洗脱出来的红色色素溶液，然后对红色色素溶液在35℃下进行减压浓缩并干燥，得到红色色素粉末。 
其中，离子交换柱中装有D401离子交换树脂，该离子交换柱在使用之前通过以下方法进行处理：将500g离子交换树脂用1000ml浓度为40%的NaOH溶液在室温下浸泡20～22h，然后用蒸馏水将离子交换树脂上的NaOH溶液洗干净，再把离子交换树脂放入到1000ml浓度为20%的MnSO4溶液中浸泡并搅拌2～3h，然后用蒸馏水清洗D401离子交换树脂，最后将离子交换树脂装入到尺寸为70cm×4.0cm的柱子中。 
通过葡聚糖凝胶 G-10色谱柱能够进一步从红色色素粉末中提取出虾青素。 
以下为对红色色素粉末及从红色色素粉末中分离出来的虾青素进行检测所得到的结果： 
经中国军事医学科学院二所检验，红色色素粉末中虾青素的含量为16%，经过葡聚糖凝胶 G-10色谱柱分离得到的虾青素的分子量为597。
经中科院海洋所通过日立835-50型氨基酸分析仪对红色色素粉末进行分析，红色色素粉末中的氨基酸总量为7.59mg/100mg, 氨基酸组成包括二十一种天然氨基酸中的十五种。 
经中国石油勘探开发研究中心通过质谱、核磁共振与红外光谱对红色色素粉末和从红色色素中分离出来的虾青素进行分析，结果显示, 红色色素粉末在400nm和299nm处有强烈吸收峰,从红色色素中分离出来的虾青素在476nm处有强烈吸收峰。 
经北京大学动物中心对红色色素粉末进行毒理试验，大鼠急性毒理实验选用北京大学动物中心繁殖的健康Wistar大白鼠，体重180～220g，雌雄各半，共20只，经预试设计径口一次灌胃染毒给红色色素100色价液13g/kg，均以10ml/kg体重计，等容量给予，观察7天。 结果显示LD50> 13g/kg。 
小鼠急性毒理性实验选用北京大学动物中心繁殖的健康昆明种小白鼠，体重18～22g， 雌雄各半，共20只，经预试设计径口一次灌胃染毒给红色色素100色价液26g/kg，均以20ml/kg体重计，等容量给予，观察7天。结果显示LD50> 26g/kg。 
解剖存活动物，大、小鼠均未见有病理改变，参照国家化合物急性毒理分级标准，红色色素粉末属无毒产品。 
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。 

Claims (5)

1.克隆号为MACC/P66的扁藻的筛选及培养方法，其特征在于，该方法的步骤如下：
（1）扁藻的筛选
在显微镜下用毛细管从扁藻属中筛选出克隆号为MACC/P66的扁藻作为藻种；
（2）藻种的培养
将维生素用少量蒸馏水溶解，再将pH值调整至4.5～5.0，再用蒸馏水将维生素的含量稀释至小于或等于0.1%，经微孔滤膜过滤后得到维生素水溶液；
将海水煮沸，然后冷却，用于配制厄尔德-施赖伯培养液；
把维生素水溶液加入厄尔德-施赖伯培养液得到修正的厄尔德-施赖伯培养液，其中，修正的厄尔德-施赖伯培养液中维生素的含量小于0.1%；
将藻种用修正的厄尔德-施赖伯培养液进行培养。
2.根据权利要求1所述的从扁藻中提取虾青素的方法，其特征在于：所述显微镜所采用的放大倍数为60X15。
3.根据权利要求1所述的从扁藻中提取虾青素的方法，其特征在于：所述维生素为水溶性维生素中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的从扁藻中提取虾青素的方法，其特征在于：所述维生素水溶液中用于调整pH值的酸为盐酸。
5.根据权利要求1所述的从扁藻中提取虾青素的方法，其特征在于：所述微孔滤膜4.5μm。
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