CN104353063A - 预防和控制人呼吸道合胞病毒感染的生物制剂及制备方法 - Google Patents
预防和控制人呼吸道合胞病毒感染的生物制剂及制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种医药技术领域的新型抗病毒生物制剂，具体是涉及一种预防和控制人呼吸道合胞病毒感染的生物制剂及制备方法。本发明为球蛋白类病毒进入/融合抑制剂。其作用在病毒入侵靶细胞的第一阶段，阻断了病毒对细胞的感染，从而达到预防和控制病毒的效果。使用一种活性酸酐来修饰一种分离和纯化的蛋白质表面带正电荷的氨基酸，从而使其具有阻断人呼吸道合胞病毒RSV进入和感染靶细胞的功能。
Description
技术领域
本发明涉及一种医药技术领域的新型抗病毒生物制剂，具体是涉及一种预防和控制人呼吸道合胞病毒感染的生物制剂及制备方法。
背景技术
呼吸道合胞病毒Respiratory Syncytial Virus（RSV）是一种含包膜的非节段负链RNA病毒，于1956年被发现。其属于副粘病毒科，肺病毒属。RSV的基因组长15kb，共表达11种蛋白，包括3个跨膜蛋白，F、G和SH，2个非糖基化的基质蛋白M和M2，3个衣壳蛋白N、P、L及2个非结构蛋白NS1和NS2。其中G蛋白和F蛋白参与了呼吸道合胞病毒（RSV）的进入和膜融合过程。并且，Ｇ蛋白和Ｆ蛋白也是诱导产生抗体的主要表位。G蛋白具有高度变异性，而且被高度糖基化，这是RSV容易逃避宿主免疫攻击的一个重要原因。RSV 分为A、B两个亚型，同一亚型的RSV G蛋白基因核苷酸及氨基酸序列同源性可达90%以上。A、B两型交替流行，部分年份以A型流行为主，部分年份以B型流行为主，有些年份呈共流行。
RSV广泛流行于世界各地，是引起婴幼儿下呼吸道感染最常见的病原微生物之一。几乎所有的3岁儿童都经历过1次或多次RSV感染。RSV感染可以引起鼻炎、中耳炎、支气管炎和肺炎。RSV要感染新生儿以及3岁以下的儿童，以及对免疫力较弱的老年人也能够感染。根据世界卫生组（WHO）官方数据，目前每年全世界范围有大约160000人由于感染RSV而死亡。有1.4到6.2万65岁以上的老人需要住院治疗。RSV感染的显著特征是前次感染在人体内产生的抗体不能提供永久保护。在人的整个生命过程可被RSV重复感染。RSV还是引起流行性喘憋性肺炎（简称流喘肺炎）的主要病原。每隔数年就会爆发流行一次喘憋性肺炎，造成数十万人发病，数万人住院，并造成死亡。在气候温和地区，其爆发流行主要集中在雨季。在我国，RSV感染具有显著的特征。在南方，RSV流行高峰主要在炎热的夏季，而北方主要发生在寒冷的冬季。RSV感染在我国不但有散发流行，而且还曾引起数次大规模流行。
由于RSV感染人体后激发的集体免是不完全免疫、RSV A型和B两亚型间的抗原相关性只有25%，另外加之福尔马林灭活疫苗免疫后能引起RSV疫苗诱导增强性疾病等原因，目前并没有有效的疫苗来预防RSV感染。FDA批准治疗RSV的药物有病毒唑和帕利株单抗。病毒唑在治疗RSV上仍然存在很多争议。例如其治疗效果以及副作用的问题。而帕利株主要用在重病感染的婴儿，如先天免疫缺陷等。所以目前也没有一种有效的药物来预防RSV感染。鉴于此，目前研发一种有效、安全的药物对预防RSV感染有很重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种预防和控制人呼吸道合胞病毒感染的生物制剂及制备方法。
本发明是采用如下技术方案实现的：
一种预防和控制人呼吸道合胞病毒感染的生物制剂，包括活性酸酐和分离纯化的蛋白，所述每10g蛋白用0.02～0.03mol的活性酸酐进行修饰，所述蛋白至少包括赖氨酸和/或精氨酸。
所述分离纯化的蛋白优选为人血清白蛋白。
所述人血清白蛋白可用β-乳球蛋白、鸡血清蛋白OVA、兔血清蛋白RSA、猪血清白蛋白PSA、冷水鱼皮明胶G-FS、猪皮明胶G-PS代替。
所述活性酸酐优选为马来酸酐（maleic anhydride，缩写为ML）。
所述马来酸酐可以用马来酸酐衍生物、3-羟基-邻苯二甲酸酐（3-hydroxyphthalicanhydride，缩写为HP）及3-羟基-邻苯二甲酸酐的衍生物、琥珀酸酐（Succinic anhydride，缩写为SU）代替。
上述生物制剂的制备方法，包括如下步骤：
（1）、将活性酸酐溶于溶剂中得到饱和的酸酐溶液；
（2）、将分离纯化的蛋白溶于pH8～9的0.1 M磷酸钠溶液中，得到蛋白终浓度为20mg/mL的蛋白溶液；
（3）、将酸酐溶液分多次加入蛋白溶液中，每次加完后充分混匀，且调节pH至8～9。酸酐在反应体系中的终浓度为40～60mM；
（4）、在温度为20～30℃的条件下，静置1-3小时，然后用pH 7～8的PBS溶液透析后过滤除菌，即可制得成品。
本发明为多肽蛋白类病毒进入/融合抑制剂，作用于病毒入侵靶细胞的第一阶段，阻断了病毒对细胞的感染，从而达到预防和控制病毒的效果。使用一种活性酸酐来修饰一种分离和纯化的蛋白质表面带正电荷的氨基酸，从而使其具有阻断人呼吸道合胞病毒RSV进入和感染靶细胞的功能。
酸酐修饰蛋白浓度测定。合成的酸酐修饰蛋白浓度按照BCA蛋白浓度分析试剂盒的操作步骤测定，具体方法如下：
1、稀释BSA蛋白标准品，使终浓度为0，25，125，250，500，750，1000，2000μg/mL，标准品的稀释与待测蛋白样品溶液相同。
2、分别将25μl各浓度标准品和25μl待测样品加入96孔圆底细胞板中，复孔对照。
3、制备反应工作液，将ReagentA与ReagentB按50：1比例混匀；
4、每孔200μl反应工作液，轻柔震荡30s，混匀。
5、37 ℃孵育30 min，冷却至室温，680型酶标仪测定OD562 nm吸光度。
6、绘制蛋白质浓度标准曲线，根据标准曲线，计算待测样品浓度。
TNBS法及p-HPG法测定蛋白的酸酐修饰比率，及检测正电荷氨基酸--赖氨酸和精氨酸残基的修饰率。
采用2，4，6一三硝基苯磺酸（TNBS）检测修饰后蛋白中的赖氨酸残基被相应酸酐修饰的比率。具体方法如下：
1、系列稀释的待测酸配修饰蛋白样品与阴性对照未修饰的蛋白各25 μl加入96孔圆底细胞培养板中，空白对照孔加入25μl/孔0.1 M磷酸钠溶液。
2、25 μl/孔的0.1 M四硼酸钠Na2B4O7与各待测样品室温混匀5min；各孔加入10 μl的，TNBS，室温混匀，5 min。
3、加入100 μl/孔的终止液（0.1M NaH2PO4和l.5mM Na2SO3），终止反应，测OD420 nm值，根据其与阴性对照蛋白OD值差异，计算赖氨酸的修饰率。
4、赖氨酸修饰率%=[1-(OD420nm样品-OD450nm空白)/(OD420nm阴性-OD450nm空白)]×100。
如图1所示，表示不同酸酐以及不同浓度对HSA修饰的赖氨酸修饰率。利用终浓度为2.5、5、10、20、40和60 mM的3-羟基-邻苯二甲酸酐（HP）、马来酸酐（ML）和琥珀酸酐（SU）对人血清白蛋白进行修饰。利用2，4，6一三硝基苯磺酸（TNBS）跟修饰样品反应，利用酶标仪测量A420，计算赖氨酸修饰率。随着酸酐浓度的升高，赖氨酸的修饰率也逐渐升高。酸酐终浓度达到40 mM后，赖氨酸修饰率也逐渐达到平台。
采用p-HPG检测合成的修饰蛋白末端的精氨酸残基被相应酸酐修饰的比率。具体方法如下：
1、系列稀释的待测酸配修饰蛋白样品与阴性对照未修饰的蛋白各90 μl加入96孔圆底细胞培养板中，空白对照孔加入90 μL/孔0.1M磷酸钠溶液，调节各孔溶液pH为9.0。
2、10 μL/孔50 mM p-HPG，pH 9.0，与各样品室温避光反应90 min。
3、测OD340nm值，计算精氨酸的修饰率。
4、精氨酸修饰率%=[1-(OD340nm样品-OD340nm空白)/(OD340nm阴性-OD340nm空白)]×100。
如图2所示，表示不同酸酐以及不同浓度对HSA修饰精氨酸的酸修饰率。利用终浓度为2.5、5、10、20、40和60 mM的3-羟基-邻苯二甲酸酐（HP）、马来酸酐（ML）和琥珀酸酐（SU）对人血清白蛋白进行修饰。利用p-HPG跟修饰样品反应，利用酶标仪测量A340，计算精氨酸修饰率。随着酸酐浓度的升高，赖氨酸的修饰率也逐渐升高。酸酐终浓度达到40 mM后，精氨酸修饰率也逐渐达到平台。
培养RSV Long株和A2株病毒的培养。目前RSV Long株和A2株的扩增主要在HEp-2细胞系中进行。具体的方法如下：
1、利用T75培养瓶接种HEp-2细胞，等细胞密度长到70%-80%左右，去掉培养基。按照MOI为0.02的量加入病毒。
2、补充DMEM培养基，10% FBS（Gibco）。在37℃，5% CO2温育30分钟。
3、补加DMEM培养基，10% FBS（Gibco）到15 ml。在37℃，5% CO2培养5天。
4、扩增病毒5天后，培养的细胞出现90%的CPE，将T75的培养瓶猛烈震荡15秒。
5、将细胞浑浊液收集在50ml离心管，5000RPM离心10分钟取上清，分装后于-80℃保存。
6、进行病毒低度的测定：
ⅰ、铺500 μl HEp-2细胞于24孔培养板中，每孔细胞数为0.8×105个，37℃，5% CO2培养24小时。
ⅱ、将扩增的RSV病毒进行10倍梯度稀释，去掉细胞培养基，然后每孔加入200μl系列稀释的病毒液。
ⅲ、将细胞培养板置于37 ℃，5% CO2的培养箱中培养3小时，每15分钟摇一次细胞板。
ⅳ、3小时后，将24孔板的病毒液吸走。然后按照每孔500 μl加入含有0.5%琼脂糖的DMEM，2% FBS，铺板。置于室温20分钟后让琼脂糖凝固。
ⅴ、放在37℃，5% CO2培养5天。
ⅵ、5天后，每孔加入4%的多聚甲醛500 μl固定细胞5小时。
ⅶ、然后去掉琼脂糖，用PBS洗一遍，加入2%的BSA封闭1小时。
ⅷ、按照1：500稀释，每孔加入100 μl一抗（anti-RSV），然后放在4℃过夜。
ⅸ、倒掉一抗，然后用0.05% 吐温PBS溶液洗3遍。按照1：500稀释加入HPR标记的二抗（兔抗鼠）。室温孵育1个小时。
ⅹ、用0.05% 吐温PBS溶液洗3遍，利用4-CN显色；数斑计算病毒低度。
本发明制备的产品对RSV Long株和A2株抑制活性的检测。利用以上扩增的RSV感染HEp-2，检测ML-HSA对RSV Long株和A2的抑制活性，具体方法为：
1、铺100μl HEp-2细胞于96孔培养板中，每孔细胞数为4×103个，37℃，5% CO2培养24小时。
2、MOI 0.02的RSV Long株和A2病毒（50 μl）分别与不同稀释度的ML-HSA（50 μl）进行孵育，37℃，30min；将孵育后的混合物加入预铺的HEp-2细胞中，37℃，5% CO2培养，培养5天。
3、5天后用同仁化学的cck8试剂盒检测，利用Compusyn 1.0和SigmaPlot软件进行计算抑制病毒的IC50。
如图3所示，不同酸酐以及不同浓度修饰后的HSA抗RSV Long株的活性。将不同浓度的利用2.5、5、10、20、40和60mM的3-羟基-邻苯二甲酸酐（HP）、马来酸酐（ML）和琥珀酸酐（SU）修饰的人血清白蛋白（图中分别标记为HP-HSA、ML-HSA和SU-HSA）加入HEp-2细胞中，然后加入TCID90的RSV Long株，5天后测细胞活性计算各种修饰蛋白的抗病毒活性（半抑制浓度IC50）。随着对人血清白蛋白赖氨酸和精氨酸修饰率的提高，其抗RSV Long株的活性也逐渐增强。
如图4所示，不同酸酐以及不同浓度修饰后的HSA抗RSV A2株的活性。将不同浓度的利用2.5、5、10、20、40和60 mM的3-羟基-邻苯二甲酸酐（HP）、马来酸酐（ML）和琥珀酸酐（SU）修饰的人血清白蛋白（图中分别标记为HP-HSA、ML-HSA和SU-HSA）加入都HEp-2细胞中，然后加入TCID90的RSV A2株，5天后测细胞活性计算各种修饰蛋白的抗病毒活性（半抑制浓度，IC50）。随着对人血清白蛋白赖氨酸和精氨酸修饰率的提高，其抗RSV A2株的活性也逐渐增强。
利用马来酸酐（ML）、琥珀酸酐（SU）及3-羟基-邻苯二甲酸酐（HP）分别修饰的β-乳球蛋白β-Lactoglobulin、牛血清蛋白BSA、鸡血清蛋白OVA和人血清白蛋白HSA。并检测其对RSV A2株和Long株抑制活性效果。如表1所示，表1表示酸酐化蛋白抗RSV活性的检测。β-乳球蛋白β-Lactoglobulin、牛血清蛋白BSA、鸡血清蛋白OVA和人血清白蛋白HSA经过ML、SU和HP三种酸酐分别修饰后，均获得了很好的抗RSV A2株和Long株的活性。
表1酸酐化蛋白抗RSV活性的检测
从表1和图3-4中可以发现酸酐修饰后的ML-HSA对RSV Long株和A2株病毒具有显著的抑制活性，其IC50（半数抑制浓度）分别约为0.002μM 和0.009μM。
从不同修饰度的ML-HSA对RSV病毒的抑制上看，如图1-4所示，该活性蛋白的抑制活性与其上正电荷氨基酸被修饰的程度密切相关，随着正电荷氨基酸被修饰程度的增加，其抑制活性逐渐增高。由原先的结果发现修饰的蛋白对不同种类的病毒，例如人免疫缺陷病毒（HIV）、猴免疫缺陷病毒（SIV）以及单纯疱疹病毒（HSV-1，HSV-2）以及人类乳头瘤病毒（HPV）等都有显著的抑制活性，因此推测该活性蛋白对RSV的作用机制不是特异性的，很可能与其酸酐化修饰后所带的电性相关。那么，本酸酐方法所修饰后的蛋白也可以用于其它病毒的控制。
本发明制备的产品在Balb/c小鼠模型上对RSV Long株感染预防和控制能力的检测如下：
以马来酸酐修饰的人血清白蛋白（ML-HSA）为例，利用Balb/c小鼠RSV感染模型对该生物制剂的预防效果进行检测，具体实施如下：
1、攻毒前第六天，利用环磷酰胺（100mg/kg）腹腔注射，对Balb/c小鼠进行免疫抑制。攻毒前一天，再次利用环磷酰胺（100mg/kg）腹腔注射，对Bal/c小鼠进行免疫抑制。
2、利用戊巴比妥钠（40mg/kg）对小鼠麻醉。用ML-HSA （100mg/kg）在攻毒前15及30分钟分别对小鼠通过滴鼻用药。
3、每只小鼠按照1×106 PFU的病毒剂量攻毒。
4、4天后，取小鼠肺，配置10%的肺研磨液。并按照检测RSV滴度的方法（如上所述）检测小鼠肺的病毒滴度。
如图5所示，马来酸酐化的HSA在Balb/c鼠模型上具有显著的预防RSV感染的效果。将马来酸酐化的HSA（ML-HSA）按照100mg/kg的剂量在30分钟（min），15分钟（min）对小鼠进行滴鼻。然后将1×106空斑形成单位（PFU）RSV Long株感染小鼠。4天后检测小鼠肺中RSV滴度。结果显示该制剂在100mg/kg的剂量下在感染前30分钟和15分钟使用，能有效降低小鼠肺中RSV的感染。
从图5中可以看出，100mg/kg 的ML-HSA在感染前15分钟和30分钟使用均能够有效的降低感染老鼠肺中的病毒滴度，起到预防RSV病毒感染的效果。感染病毒对照小鼠跟30分钟前用药和15分钟前用药具有显著统计学差别，P值分别为0.045和0.031。因此在动物模型上验证ML-HSA对RSV具有预防作用。
本专利发明人之一的姜世勃教授是国际著名病毒学家，长期从事抗病毒药物的研究，其在国际上发现了第一个抗艾滋病病毒的 C-多肽-SJ-2176，用于开发抗HIV药物—恩夫韦肽（Enfuvirtide，T-20）。Enfuvirtide在2003年被美国FDA批准上市成为全世界第一个多肽类艾滋病病毒（HIV）进入/融合抑制剂，该药物的发现被视为艾滋病药物研究领域的一个里程碑，姜世勃教授也因此开辟了多肽蛋白类病毒进入/融合抑制剂的新领域。病毒进入/融合抑制剂就是作用在病毒入侵靶细胞的第一阶段，阻断了病毒对细胞的感染，从而达到预防和控制病毒的效果，Enfuvirtide在美国临床上使用的成功证明了该策略对治疗病毒所引发的疾病是非常有效的。本发明专利建立在姜世勃教授多年研究的基础上，是将预防及控制艾滋病病毒的成功经验运用到了对人呼吸道合胞病毒RSV的预防和控制上，经过实验检测该蛋白制剂对RSV的感染具有显著的抑制活性。
本发明药物具有阻断RSV病毒进入细胞、阻止病毒扩大感染，其具有安全无毒副作用、稳定性高、成本低廉等显著优势。本发明可用于开发成为以其为主要活性成分的预防和控制RSV感染的各种剂型，制备方法简单，易于推广。
附图说明
图1表示不同酸酐以及不同浓度对HSA修饰的赖氨酸修饰率。
图2表示不同酸酐以及不同浓度对HSA修饰精氨酸的酸修饰率。
图3表示不同酸酐以及不同浓度修饰后的HSA抗RSV Long株的活性。
图4表示不同酸酐以及不同浓度修饰后的HSA抗RSV A2株的活性。
图5表示马来酸酐酸酐化的HSA在Balb/c鼠模型上具有显著的预防RSV感染的效果。
具体实施方式
实验例1
一种预防和控制人呼吸道合胞病毒感染的生物制剂的制备方法，以HSA为例，购买人血清白蛋白；利用活性酸酐对购买的蛋白质进行酸酐化，透析后再次纯化活性蛋白；包括以下步骤：
（1）、将马来酸酐（ML）溶于二甲基亚砜DMSO中，浓度达到饱和；
（2）、将人血清白蛋白（HSA）溶于pH8.5的0.1M磷酸钠溶液中，得到蛋白终浓度为20mg/mL的蛋白溶液；
（3）、将ML溶液分多次加入蛋白溶液中，每次加完后充分混匀，且调节pH至8.5，酸酐在反应体系中的终浓度为60mM；
（4）、在温度为25℃的条件下，静置1小时，pH 7.4的PBS溶液4 ℃透析。再用0.45μM微孔滤膜过滤除菌，4℃保存，然后按照现有方法制成凝胶剂。
依照上述方法制备的生物制剂中，每10g人血清白蛋白（HSA）用0.03mol马来酸酐（ML）进行修饰。
实验例2
一种预防和控制人呼吸道合胞病毒感染的生物制剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）、将马来酸酐的衍生物溶于二甲基亚砜DMSO中得到饱和的酸酐溶液；
（2）、将鸡血清蛋白OVA溶于pH 8的0.1 M磷酸钠溶液中，得到蛋白终浓度为20mg/mL的蛋白溶液；
（3）、再将上述ML溶液分为五等份，每12min加入蛋白溶液中，充分混匀，1M NaOH调节pH为8，酸酐在反应体系中的终浓度为40mM；
（4）、在温度为20℃的条件下，静置1小时，pH 7的PBS溶液4℃透析过夜。再用0.45μM微孔滤膜过滤除菌，4℃保存，然后按照现有方法制成膏剂。
依照上述方法制备的生物制剂中，每10g鸡血清蛋白OVA用0.02mol马来酸酐的衍生物进行修饰。
实验例3
一种预防和控制人呼吸道合胞病毒感染的生物制剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）、将马来酸酐（ML）溶于二甲基亚砜DMSO中，浓度达到饱和；
（2）、将从牛奶制品中分离及纯化β-乳球蛋白（β-LG）为主的稳定性蛋白质溶于pH 9的0.1 M磷酸钠溶液中，得到蛋白终浓度为20mg/mL的蛋白溶液；
（3）、再将上述ML溶液分为五等份，每12min加入蛋白溶液中，充分混匀，1M NaOH调节pH为9，酸酐在反应体系中的终浓度为50mM；
（4）、在温度为30℃的条件下，静置1小时，pH 8的PBS溶液4℃透析过夜。再用0.45μM微孔滤膜过滤除菌，4℃保存，然后按照现有方法制成凝胶剂。
依照上述方法制备的生物制剂中，每10gβ-乳球蛋白（β-LG）用0.025mol马来酸酐（ML）进行修饰。
实验例4
一种预防和控制人呼吸道合胞病毒感染的生物制剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）、将马来酸酐（ML）溶于二甲基亚砜DMSO中，浓度达到饱和；
（2）、将猪血清白蛋白PSA溶于pH 8.5的0.1 M磷酸钠溶液中，得到蛋白终浓度为20mg/mL的蛋白溶液；
（3）、再将上述ML溶液分为五等份，每12min加入蛋白溶液中，充分混匀，1M NaOH调节pH为8.5，酸酐在反应体系中的终浓度为40mM；
（4）、在温度为28℃的条件下，静置1小时，pH7.5的PBS溶液4℃透析过夜。再用0.45μM微孔滤膜过滤除菌，4℃保存，然后按照现有方法制成喷剂。
依照上述方法制备的生物制剂中，每10g猪血清白蛋白PSA用0.02mol马来酸酐（ML）进行修饰。
实验例5
一种预防和控制人呼吸道合胞病毒感染的生物制剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）、将3-羟基-邻苯二甲酸酐的衍生物溶于二甲基亚砜DMSO中，浓度达到饱和；
（2）、将冷水鱼皮明胶G-FS溶于pH 8.2的0.1 M磷酸钠溶液中，得到蛋白终浓度为20mg/mL的蛋白溶液；
（3）、再将上述酸酐溶液分为五等份，每12min加入蛋白溶液中，充分混匀，1M NaOH调节pH为8.2，酸酐在反应体系中的终浓度为60mM；
（4）、在温度为25℃的条件下，静置1小时，pH7.3的PBS溶液4℃透析过夜，再用0.45μM微孔滤膜过滤除菌，4℃保存，然后按照现有方法制成凝胶剂。
依照上述方法制备的生物制剂中，每10g冷水鱼皮明胶G-FS用0.03mol的3-羟基-邻苯二甲酸酐的衍生物进行修饰。
实验例6
一种预防和控制人呼吸道合胞病毒感染的生物制剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）、将琥珀酸酐（SU）溶于二甲基亚砜DMSO中，浓度达到饱和；
（2）、将猪皮明胶G-PS溶于pH8.3的0.1 M磷酸钠溶液中，得到蛋白终浓度为20mg/mL的蛋白溶液；
（3）、再将上述酸酐溶液分为五等份，每12min加入蛋白溶液中，充分混匀，1M NaOH调节pH为8.3，酸酐在反应体系中的终浓度为40mM；
（4）、在温度为23℃的条件下，静置1小时，pH 7.8的PBS溶液4℃透析过夜。再用0.45μM微孔滤膜过滤除菌，4℃保存，然后按照现有方法制成膏剂。
依照上述方法制备的生物制剂中，每10g猪皮明胶G-PS用0.02mol琥珀酸酐（SU）进行修饰。
实验例7
一种预防和控制人呼吸道合胞病毒感染的生物制剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）、将3-羟基-邻苯二甲酸酐（HP）溶于二甲基亚砜DMSO中，浓度达到饱和（1.19M）；
（2）、将兔血清蛋白RSA溶于pH8.7的0. 1M磷酸钠溶液中，得到蛋白终浓度为20mg/mL的蛋白溶液；
（3）、再将上述酸酐溶液分为五等份，每12min加入蛋白溶液中，充分混匀，1M NaOH调节pH为8.7，酸酐在反应体系中的终浓度为60mM；
（4）、在温度为27℃的条件下，静置1小时，pH 7.5的PBS溶液4℃透析过夜。再用0.45μM微孔滤膜过滤除菌，4℃保存，然后按照现有方法制成喷剂。
依照上述方法制备的生物制剂中，每10g兔血清蛋白RSA用0.03mol的3-羟基-邻苯二甲酸酐（HP）进行修饰。
Claims (10)
1.一种预防和控制人呼吸道合胞病毒感染的生物制剂，其特征在于：包括活性酸酐和分离纯化的蛋白，所述每10g蛋白用0.02～0.03mol的活性酸酐进行修饰，所述蛋白至少包括赖氨酸和/或精氨酸。
2.根据权利要求1所述的预防和控制人呼吸道合胞病毒感染的生物制剂，其特征在于：所述活性酸酐为马来酸酐或者马来酸酐的衍生物。
3.根据权利要求1所述的预防和控制人呼吸道合胞病毒感染的生物制剂，其特征在于：所述活性酸酐为3-羟基-邻苯二甲酸酐或者3-羟基-邻苯二甲酸酐的衍生物。
4.根据权利要求1所述的预防和控制人呼吸道合胞病毒感染的生物制剂，其特征在于：所述活性酸酐为琥珀酸酐。
5.根据权利要求1-4任一所述的预防和控制人呼吸道合胞病毒感染的生物制剂，其特征在于：所述分离纯化的蛋白为人血清白蛋白、β-乳球蛋白、鸡血清蛋白、兔血清蛋白、猪血清白蛋白、冷水鱼皮明胶或者猪皮明胶。
6.根据权利要求5所述的预防和控制人呼吸道合胞病毒感染的生物制剂，其特征在于：生物制剂为凝胶制剂、膏剂或者喷剂。
7.一种预防和控制人呼吸道合胞病毒感染的生物制剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）、将活性酸酐溶于溶剂中得到饱和的酸酐溶液；
（2）、将分离纯化的蛋白溶于pH 8～9的0.1 M磷酸钠溶液中，得到蛋白终浓度为20mg/mL的蛋白溶液；
（3）、将酸酐溶液分多次加入蛋白溶液中，每次加完后充分混匀，且调节pH至8～9，酸酐在反应体系中的终浓度为40～60mM；
（4）、在温度为20～30℃的条件下，静置，pH 7～8的PBS溶液透析后过滤除菌，即可制得成品。
8.根据权利要求7所述的预防和控制人呼吸道合胞病毒感染的生物制剂的制备方法，其特征在于：所述活性酸酐为马来酸酐、马来酸酐的衍生物、3-羟基-邻苯二甲酸酐、3-羟基-邻苯二甲酸酐的衍生物或者琥珀酸酐；所述分离纯化的蛋白为人血清白蛋白、β-乳球蛋白、鸡血清蛋白、兔血清蛋白、猪血清白蛋白、冷水鱼皮明胶或者猪皮明胶。
9.根据权利要求7或8所述的预防和控制人呼吸道合胞病毒感染的生物制剂的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，磷酸钠溶液的pH为8.5；步骤（3）中，每次加完后调节pH至8.5，酸酐在反应体系中的终浓度为60mM；步骤（4）中，在温度为25℃的条件下，放置l小时，pH 7.4的PBS溶液在4℃透析后过夜，再用0.45μM微孔滤膜过滤除菌，4℃保存，即可制得成品。
10.根据权利要求9所述的预防和控制人呼吸道合胞病毒感染的生物制剂的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述溶剂为二甲基亚砜。
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