CN104337836B

CN104337836B - 一种具有降尿酸功效的柴鱼蛋白水解物制备方法

Info

Publication number: CN104337836B
Application number: CN201410520344.5A
Authority: CN
Inventors: 任娇艳; 卢韵君; 赖婷; 刘鹏; 林泽华; 赵谋明
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2014-09-30
Filing date: 2014-09-30
Publication date: 2018-05-15
Anticipated expiration: 2034-09-30
Also published as: CN104337836A

Abstract

本发明涉及一种具有降尿酸功效的柴鱼蛋白水解物制备方法。其主要制备步骤包括：原料热处理、限制性酶解、膜分离‑阴离子交换层析‑凝胶过滤层析分离、浓缩、喷雾干燥得到具有降尿酸功效的柴鱼蛋白水解物。氨基酸分析显示酶解物肽段一级氨基酸序列中含四种氨基酸：组氨酸、精氨酸、赖氨酸及苏氨酸，该四种氨基酸质量含量总和约占酶解物总氨基酸含量的70%。经MALDI‑TOF‑MS质谱确定其主要肽功效组分的分子量均小于700 Da。经体外降尿酸实验证明本发明具有显著抑制尿酸生成的作用，抑制率达到50%以上；经氧嗪酸钾造模的高尿酸血症大鼠动物验证表明，可显著降低大鼠血清尿酸以及血清肌酐水平，表现出较好的肾脏保护功效。

Description

一种具有降尿酸功效的柴鱼蛋白水解物制备方法

技术领域

本发明涉及一种蛋白水解物的制备方法，具体涉及一种具有降尿酸功效的柴鱼蛋白水解物制备方法。

背景技术

高尿酸血症是人体的一种代谢疾病，随着现代社会的发展，高血尿酸已经成为继高血压、高血脂和高血糖之后的第四个重要危险因素。高血尿酸值是引发痛风症的直接原因，其过程是体内嘌呤代谢紊乱以及排泄异常导致人体血液中尿酸值升高，最终尿酸在人体的关节等处形成结晶，从而引起炎症反应，并最终导致痛风的发生。正常人体血清尿酸水平，成年男性为208-428 μmol/L, 成年女性为155-357 μmol/L。

高尿酸血症的发病机制主要有：

（1）尿酸生成过多。人体中尿酸的来源分为内源性尿酸以及外源性尿酸。内源性尿酸主要是细胞内蛋白质分解代谢产生的嘌呤类化合物经特定的酶作用产生的。外源性尿酸主要是食物中的嘌呤类化合物经过人体消化吸收以及特定酶的催化作用后产生的。影响尿酸生成的酶主要有两类，一类是促进尿酸生成的酶，包括：磷酸核糖焦磷酸合成酶（PRPP）、腺嘌呤磷酸核糖转移酶（APRT）以及黄嘌呤氧化酶（XOD）；另一类是抑制尿酸合成的酶：次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）。原发性痛风和继发性痛风的发生部分原因是某些因素使以上这些酶的活性改变，从而使尿酸生成增多而形成的。

（2）尿酸排泄减少。大部分痛风的发生都是因为尿酸排泄减少而导致的。研究发现，近曲小管对尿酸盐的主动分泌和重吸收需要尿酸盐转运蛋白的参与,当编码该蛋白的基因发生变异，导致排泄的尿酸减少，就会发生原发性痛风。继发性痛风主要由于肾脏相关疾病导致肾小球滤出的尿酸减少或者重吸收增加，从而产生高尿酸血症。

目前我国用于治疗高尿酸血症的药物主要有：

（1）抑制尿酸生成的药物。主要是指黄嘌呤氧化酶抑制剂，如：别嘌呤醇（Allopurinol）、奥西嘌呤（Oxypurinol）、非布索坦（Fexbuxostat）、Y-700以及KT-651等。

（2）促进尿酸排泄的药物。主要包括丙磺舒、苯磺唑酮和苯溴马隆。

（3）促进尿酸分解的药物。主要包括拉布立酶（ELITEK, Rasburicase）以及PEG-uricase。

但是以上药物都有较强的副作用和过敏反应，对人体脏器有一定的毒害损伤作用，且价格比较昂贵，因此亟需寻找高效低毒的功效成分，对于高尿酸血症的预防和治疗具有重要的社会和经济意义。

有研究表明从某些植物提取的天然产物有一定降尿酸功效。徐娜研究芹菜籽中黄酮物质，发现木樨草素能有效抑制黄嘌呤氧化酶的活性，具有显著的降尿酸功效。王海东采用氧嗪酸钾灌胃诱导小鼠高尿酸血症模型研究金钱草水提物对其降尿酸效果，发现金钱草水提物高中低剂量具有降低小鼠血清尿酸的效果。夏道宗等人通过给高尿酸血症小鼠喂食青梅醇提物研究其降尿酸效果，结果表明青梅醇提物在中、高剂量能降低高尿酸血症小鼠的血清尿酸水平，抑制其肝脏黄嘌呤氧化酶的活性，具有较好的降尿酸功效。但是目前市场上以天然植物提取物为功效成分的保健食品或药品并不多见，且安全性有待研究。

富含生物活性的蛋白水解物近些年成为世界范围的研究热点，其具有易吸收、活性好、制备简单等特点。生物活性肽分为内源性活性肽以及外源性活性肽，内源性活性肽是指生物体内存在的活性肽，外源性活性肽是指从动植物体蛋白经化学或酶法水解生产的具有活性的肽段。研究发现，一些肽类物质对于降低尿酸值、预防和辅助治疗痛风具有重要贡献，例如临床上，还原型谷胱甘肽（GSH）可用于辅助治疗痛风性肾病。近年来，研究发现一些食源性生物活性肽也具有降低尿酸的作用。张锐等报道酪蛋白磷酸肽结合钙粉对高尿酸血症大鼠血清尿酸水平有显著干预效果，其机制可能是降低了肝脏黄嘌呤氧化酶、血清和肝脏中腺苷脱氨酶活性。尽管如此，目前对于生物活性肽改善痛风症候群的作用机制尚不清楚。

柴鱼，属鲈形总目、金枪鱼亚目，因其鱼体形态像炮弹又俗称为炸弹鱼，是重要的海洋洄游鱼类，主要产于太平洋、印度洋和大西洋，我国东海、南海的捕捞量大。柴鱼肉可鲜食，但我国主要把其加工成柴鱼罐头出口，其附加值不高。相比其他海洋鱼类，柴鱼蛋白质含量高、脂肪含量低，目前尚未深度开发利用。本发明利用柴鱼为原料，利用限制性酶解作为技术手段，集成不同分离技术，筛选出具有显著降尿酸功效的蛋白酶解物，对于开发以天然降尿酸功效因子为核心成分的保健食品甚至药品具有重要的参考价值。

发明内容

本发明的首要目的是利用柴鱼鲜肉制备具有降尿酸活性的柴鱼蛋白水解物的方法。

本发明技术方案如下。

一种具有降尿酸功效的柴鱼蛋白水解物制备方法，包括以下步骤：

（1）原料热处理：新鲜柴鱼，去头、内脏、尾以及脊骨后，获取纯肌肉组织，于绞肉机绞碎至糜状，得到柴鱼肉糜，加水蒸煮，后冷却室温，得到蒸煮后的柴鱼肉糜；

（2）限制性酶解：将蒸煮后的柴鱼肉糜调节pH值至6.5-8.5，按柴鱼肉糜蛋白质量0.5%-2.0%加入蛋白酶，于50-55℃水浴振荡反应，反应结束后将水解液置于沸水中保温10-20 min灭酶，离心分离，取上清液，得柴鱼蛋白水解上清液；

（3）采用膜分离-阴离子交换层析-凝胶过滤层析，三步法分离柴鱼蛋白水解物：第一步：将柴鱼蛋白水解上清液过超滤膜，取透过液，将透过液于60-65℃蒸发浓缩20-45min；第二步：利用DEAE-52纤维素阴离子交换柱进行分离，收集洗脱液，洗脱液于60-65℃蒸发浓缩20-45 min后；第三步：利用Sephadex G-15 凝胶色谱柱进一步分离，收集洗脱液，得到柴鱼蛋白水解分离液；

（4）浓缩、喷雾干燥：将柴鱼蛋白水解分离液真空浓缩后，喷雾干燥，得到具有降尿酸功效的柴鱼蛋白水解物。

上述方法中，步骤（1）中，柴鱼肉糜1:5-1:8 （w/w）加水于 80-100℃ 下蒸煮 10-30 min。

上述方法中，步骤（1）中，所述柴鱼肉糜蛋白质质量百分比含量为 24%~28% （w/w）。

上述方法中，步骤（2）中，所用蛋白酶为木瓜蛋白酶，酶活力8.0×10⁵ U/g，酶解时间为6.0-12.0 h。

上述方法中，步骤（3）中，第一步分离所用超滤膜的膜通量为0-10 kDa; 第二步DEAE-52纤维素阴离子交换柱分离时以0-0.3 mol/L的NaCl溶液为洗脱剂；第三步SephadexG-15 凝胶色谱柱分离时以超纯水为洗脱剂。

上述方法中，步骤（4）中，所述具有降尿酸功效的柴鱼蛋白水解物的肽段一级氨基酸序列中主要含四种氨基酸：组氨酸为41.84%（w/w）、精氨酸为10.67%（w/w）、赖氨酸为8.45%（w/w）及苏氨酸为8.53%（w/w），该四种氨基酸质量含量总和约占酶解物总氨基酸含量的70% （w/w）；经MALDI-TOF-MS质谱确定其主要肽功效组分的分子量均小于 700 Da。

与现有技术相比，本发明的优势在于：

（1）本发明利用酶法限制性水解与膜分离、色谱分离方法结合，制备的柴鱼蛋白水解物具有功效显著、纯度高、鱼腥味淡等优点。

（2）本发明所得酶解物具有特殊的肽链氨基酸组成比例及独特的分子量分布。具体而言，该酶解物肽段一级氨基酸序列中主要含四种氨基酸：组氨酸（41.84%，w/w）、精氨酸（10.67%，w/w）、赖氨酸（8.45%，w/w）及苏氨酸（8.53%，w/w），该四种氨基酸质量含量总和约占酶解物总氨基酸含量的70% （w/w）。经MALDI-TOF-MS质谱确定其主要肽功效组分的分子量均小于700 Da。

（3）经体外黄嘌呤氧化酶抑制实验以及大鼠动物实验证明，本发明抑制尿酸生成作用显著，黄嘌呤氧化酶活性抑制率达到50%以上，并且能明显降低大鼠血清尿酸值以及肌酐水平，具有显著的降尿酸功效以及保护肾脏功能。

附图说明

图1实施例对黄嘌呤氧化酶抑制作用效果。

图2为实施例对高尿酸血症大鼠血清尿酸的影响。

图3为实施例对高尿酸血症大鼠血清肌酐的影响。

图4为实施例3MALDI-TOF-MS一级质谱图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

（1）原料热处理：新鲜柴鱼，去头、内脏、尾以及脊骨后，获取纯肌肉组织，于绞肉机绞碎至糜状，取柴鱼肉糜100 g，按比例1:5（w/w）加水于 80℃ 下蒸煮 10 min，后冷却室温。

（2）限制性酶解：将蒸煮后的柴鱼肉糜调节pH值至6.5，按柴鱼肉糜蛋白质量（柴鱼蛋白质含量26%， w/w）加入木瓜蛋白酶（酶活力8.0×10⁵ U/g,加酶量为占柴鱼蛋白质量0.5%），于50℃水浴振荡反应6.0 h。反应结束后将水解液置于沸水中保温10 min灭酶，离心分离，取上清液，得柴鱼蛋白水解上清液。

（3）“膜分离-阴离子交换层析-凝胶过滤层析”三步法分离柴鱼蛋白水解物：第一步：将柴鱼蛋白水解上清液过膜通量为10 kDa的超滤膜，取透过液，将透过液于60℃蒸发浓缩20 min；第二步：利用DEAE-52纤维素阴离子交换柱进行分离，以0.3 mol/L的NaCl溶液为洗脱剂，收集洗脱液，洗脱液于60℃蒸发浓缩20 min后；第三步：利用Sephadex G-15 凝胶色谱柱进一步分离，以超纯水为洗脱剂，收集洗脱液，得到柴鱼蛋白水解分离液。

（4）浓缩、喷雾干燥：将柴鱼蛋白水解分离液真空浓缩后，喷雾干燥，得到具有降尿酸功效的柴鱼蛋白水解物1。

实施例2

（1）原料热处理：新鲜柴鱼，去头、内脏、尾以及脊骨后，获取纯肌肉组织，于绞肉机绞碎至糜状，取柴鱼肉糜100 g，按比例1:8（w/w）加水于100℃下蒸煮30 min，后冷却室温。

（2）限制性酶解：将蒸煮后的柴鱼肉糜调节pH值至8.5，按柴鱼肉糜蛋白质量（柴鱼蛋白质含量为24%，w/w）加入木瓜蛋白酶（酶活力8.0×10⁵ U/g，加酶量为占柴鱼蛋白质量2.0%），于50-55℃水浴振荡反应12.0 h。反应结束后将水解液置于沸水中保温15 min灭酶，离心分离，取上清液，得柴鱼蛋白水解上清液。

（3）“膜分离-阴离子交换层析-凝胶过滤层析”三步法分离柴鱼蛋白水解物：第一步：将柴鱼蛋白水解上清液过膜通量为5 kDa的超滤膜，取透过液，将透过液于63℃蒸发浓缩30 min；第二步：利用DEAE-52纤维素阴离子交换柱进行分离，以0.2 mol/L的NaCl溶液为洗脱剂，收集洗脱液，洗脱液于63℃蒸发浓缩30 min后；第三步：利用Sephadex G-15 凝胶色谱柱进一步分离，以超纯水为洗脱剂，收集洗脱液，得到柴鱼蛋白水解分离液。

（4）浓缩、喷雾干燥：将柴鱼蛋白水解分离液真空浓缩后，喷雾干燥，得到具有降尿酸功效的柴鱼蛋白水解物2。

实施例3

（1）原料热处理：新鲜柴鱼，去头、内脏、尾以及脊骨后，获取纯肌肉组织，于绞肉机绞碎至糜状，取柴鱼肉糜100 g，按比例1:6（w/w）加水于90℃下蒸煮15 min，后冷却室温。

（2）限制性酶解：将蒸煮后的柴鱼肉糜调节pH值至6.8，按柴鱼肉糜蛋白质量（柴鱼蛋白质含量为28%，w/w）加入木瓜蛋白酶（酶活力8.0×10⁵ U/g，加酶量为占柴鱼蛋白质量1.0%），于50℃水浴振荡反应8.0 h。反应结束后将水解液置于沸水中保温20 min灭酶，离心分离，取上清液，得柴鱼蛋白水解上清液。

（3）“膜分离-阴离子交换层析-凝胶过滤层析”三步法分离柴鱼蛋白水解物：第一步：将柴鱼蛋白水解上清液过膜通量为3 kDa的超滤膜，取透过液，将透过液于65℃蒸发浓缩35 min；第二步：利用DEAE-52纤维素阴离子交换柱进行分离，以0.1 mol/L的NaCl溶液为洗脱剂，收集洗脱液，洗脱液于65℃蒸发浓缩35 min后；第三步：利用Sephadex G-15 凝胶色谱柱进一步分离，以超纯水为洗脱剂，收集洗脱液，得到柴鱼蛋白水解分离液。

（4）浓缩、喷雾干燥：将柴鱼蛋白水解分离液真空浓缩后，喷雾干燥，得到具有降尿酸功效的柴鱼蛋白水解物3。

以下通过实验来证明实施例的降尿酸功效。

一、体外黄嘌呤氧化酶抑制活性实验。通过黄嘌呤氧化酶抑制活性实验说明柴鱼蛋白水解物抑制尿酸生成作用。

实验方法：配制0.1 mol/l pH 7.5 磷酸盐缓冲液（PBS）；配制0.43μmol/mL的黄嘌呤溶液；配制0.4U/mL黄嘌呤氧化酶溶液。将待测样品稀释或者配制成10 mg/mL，向96孔酶标板中，每孔加入50 μL待测样品以及50μL黄嘌呤氧化酶溶液，以10 μg/mL的别嘌呤醇为阳性对照。37℃保温15 min，加入200 μL黄嘌呤溶液，在292nm波长下每30 s读数一次，共读数80次反应40 min。得出吸光值后，计算样品抑制率。

实验结果：黄嘌呤氧化酶是促进黄嘌呤转化成为尿酸的关键酶，抑制黄嘌呤氧化酶的活性可以抑制尿酸生成，降低血清尿酸含量。如果样品对黄嘌呤氧化酶活性有抑制作用，则说明样品具有抑制尿酸生成的功效。

三种柴鱼蛋白水解物均表现出良好的黄嘌呤氧化酶抑制活性，虽然与药物别嘌呤醇相比，有效剂量不在一个数量级上，但是柴鱼蛋白水解物是从食源性蛋白获得，具有安全无毒、无副作用等优点，且对黄嘌呤氧化酶抑制活性良好，可用于保健食品的生产。其中柴鱼蛋白水解物3表现出最优的抑制率，柴鱼蛋白水解物3与其它两个水解物相比，主要差别体现在其水解时间长，并通过通量为3000 Da超滤膜，分子量相比其它实施例小，说明水解程度高，分子量小的柴鱼蛋白水解物具有更优的抑制尿酸生成活性(见图1)。

二、动物试验。本发明实施例降尿酸功效动物实验方法如下：

（1）实验材料

动物：SPF级SD大鼠108只，雄性，体重200±20(g)，广州中医药大学实验动物中心提供（许可证号：SCXK（粤）2013-0020）。试剂：别嘌醇片（广东彼迪药业有限公司，批准文号：国药准字H44021368）；氧嗪酸钾（山东中科泰斗化学有限公司，批号：Batch No.120901）；羧甲基纤维素钠（上海赛璐珞厂，产品标准号：GB2760）；尿酸、尿素氮（BUN）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，生产批号：20140306）。

（2）实验方法

动物分组与造模：108只大鼠随机分为正常对照组（12只）和造模组（96只），造模组大鼠胃灌胃氧嗪酸钾一周（每天一次），利用3%戊巴比妥钠（30 mg·kg^-1）腹腔注射麻醉，眼眶后静脉丛采血（0.5 ml），以4℃、3000rpm、离心15min，取上层血清测定尿酸含量；正常对照组大鼠灌胃给予等容积的溶媒。将尿酸含量高于110 μmol·L^-1的大鼠确定为造模成功。将造模成功的大鼠按尿酸含量随机分为模型对照组（等容积溶媒）、柴鱼蛋白水解物1（150mg·kg^-1）、柴鱼蛋白水解物2（150mg·kg^-1）、柴鱼蛋白水解物（150mg·kg^-1）和别嘌醇组（25mg·kg^-1），每组大鼠12只，灌胃给药（给药容积10ml/kg），模型大鼠给予等容积的蒸馏水。上述样品处理7d、14d时，于末次给药50min，3%戊巴比妥钠（30mg·kg^-1）腹腔注射麻醉后，眼眶后静脉丛取血（0.5ml），测定血清尿酸含量；样品处理第21d时，3%戊巴比妥钠麻醉后腹主动脉取血 5ml，除测定血清尿酸含量外，同时测定血清肌酐含量。

血清尿酸测定：采用钨酸法并严格按照试剂盒说明进行操作和测定。

血清肌酐测定：采用苦味酸法测定血清肌酐含量，具体操作严格按试剂盒说明进行测定。

统计学处理：所有数据均以(±s )表示，采用spss16.0统计软件处理。

实验结果：氧嗪酸钾是一种尿酸酶抑制剂，可抑制尿酸分解，提高大鼠体内的尿酸水平，诱导大鼠造成高尿酸血症。从图2得知，模型组大鼠的血清尿酸水平约为正常组的3倍，证实造模成功。由大鼠血清尿酸测定结果得知，服食柴鱼蛋白水解物1、柴鱼蛋白水解物2以及柴鱼蛋白水解物3大鼠的血清尿酸值在第7以及21天对比于模型组大鼠以及给药前大鼠的血清尿酸值具有明显下降，尽管效果不如药物别嘌呤醇，但柴鱼蛋白水解物确实起到了降低血清尿酸的作用。其中柴鱼蛋白水解物3效果最佳，且给药21天里没有出现明显的反弹，能有效控制大鼠血清尿酸水平。

由图3可知，柴鱼蛋白水解物均有一定降低血清肌酐的效果，但没有明显的差异。血清肌酐值是反应肾功能的指标之一，该值升高意味着肾功能的损害。本发明实验结果说明柴鱼蛋白水解物具有一定保护肾脏的作用。

三、结构鉴定。

对降尿酸功效最优的实施例3采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）测定其分子量，并结合氨基酸分析推测其结构。结果如图4以及表1所示。

由图4可以看出柴鱼蛋白水解物3在分子量为378.83处有很高的吸收峰，说明柴鱼蛋白水解物3主要含有分子量为378.83的物质。

氨基酸分析结果表明，实施例3中酶解物肽段一级氨基酸序列中主要含四种氨基酸：组氨酸（41.84%，w/w）、精氨酸（10.67%，w/w）、赖氨酸（8.45%，w/w）及苏氨酸（8.53%，w/w），该四种氨基酸质量含量总和约占酶解物总氨基酸含量的70%（w/w）。经MALDI-TOF-MS质谱确定其主要肽功效组分的分子量均小于 700 Da。

表1 各氨基酸在柴鱼蛋白水解物3中含量

氨基酸	含量/%	氨基酸	含量/%
				天冬氨酸(Asp)	1.19	酪氨酸(Tyr)	1.63
谷氨酸(Glu)	1.78	缬氨酸(Val)	1.50
				丝氨酸(Ser)	4.98	蛋氨酸(Met)	0.29
甘氨酸(Gly)	3.49	半胱氨酸(Cys)	0.17
				组氨酸(His)	41.84	异亮氨酸(Ile)	1.25
精氨酸(Arg)	10.67	亮氨酸(Leu)	2.07
				苏氨酸(Thr)	8.53	苯丙氨酸(Phe)	6.33
丙氨酸(Ala)	3.44	赖氨酸(Lys)	8.45
				脯氨酸(Pro)	2.38	总量	100.00

本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims

1.一种具有降尿酸功效的柴鱼蛋白水解物制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）原料热处理：新鲜柴鱼，去头、内脏、尾以及脊骨后，获取纯肌肉组织，于绞肉机绞碎至糜状，得到柴鱼肉糜，柴鱼肉糜按质量比1:5-1:8加水于 80-100℃ 下蒸煮 10-30 min后冷却室温，得到蒸煮后的柴鱼肉糜；

（2）限制性酶解：将蒸煮后的柴鱼肉糜调节pH值至6.5-8.5，按柴鱼肉糜蛋白质量0.5%-2.0%加入蛋白酶，于50-55℃水浴振荡反应，反应结束后将水解液置于沸水中保温10-20min灭酶，离心分离，取上清液，得柴鱼蛋白水解上清液；所用蛋白酶为木瓜蛋白酶，酶活力8.0×10⁵ U/g，酶解时间为6.0-12.0 h；

（3）采用膜分离-阴离子交换层析-凝胶过滤层析，三步法分离柴鱼蛋白水解物：第一步：将柴鱼蛋白水解上清液过超滤膜，取透过液，将透过液于60-65℃蒸发浓缩20-45 min；第二步：利用DEAE-52纤维素阴离子交换柱进行分离，收集洗脱液，洗脱液于60-65℃蒸发浓缩20-45 min后；第三步：利用Sephadex G-15 凝胶色谱柱进一步分离，收集洗脱液，得到柴鱼蛋白水解分离液；

（4）浓缩、喷雾干燥：将柴鱼蛋白水解分离液真空浓缩后，喷雾干燥，得到具有降尿酸功效的柴鱼蛋白水解物；所述具有降尿酸功效的柴鱼蛋白水解物的肽段一级氨基酸序列中主要含四种氨基酸：其中组氨酸的质量百分比为41.84%、精氨酸的质量百分比为10.67%、赖氨酸的质量百分比为8.45%及苏氨酸的质量百分比为8.53%，该四种氨基酸质量含量总和占酶解物总氨基酸含量的质量百分比为70%；经MALDI-TOF-MS质谱确定其主要肽功效组分的分子量均小于 700 Da。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1）中，所述柴鱼肉糜蛋白质质量百分比含量为 24%~28%。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（3）中，第一步分离所用超滤膜的膜通量为3-10 kDa; 第二步DEAE-52纤维素阴离子交换柱分离时以0.1-0.3 mol/L的NaCl溶液为洗脱剂；第三步Sephadex G-15 凝胶色谱柱分离时以超纯水为洗脱剂。