CN104313166B - 铜绿假单胞菌多重耐药基因液态芯片检测试剂盒 - Google Patents

铜绿假单胞菌多重耐药基因液态芯片检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种铜绿假单胞菌多重耐药基因液态芯片检测试剂盒，所述铜绿假单胞菌多重耐药基因包括OPRD2、TEM、OXA10、AAC3、AAC6、VIM、VEB、IMP共8个耐药基因，试剂盒包括核酸扩增组份和杂交组份；核酸扩增组份具体包括：预混液、引物混合液、聚合酶、阳性质控品、阴性质控品；杂交组份具体包括：微球杂交液、质控微球和链霉亲和素‑藻红蛋白。本发明提供的是试剂盒可以同时检测铜绿假单胞菌多重耐药基因，不仅可对铜绿假单胞菌的耐药性进行快速、准确检测，从而满足临床治疗的需要；同时，该试剂盒特异性高、可组合筛查、检测通量高，更便于推广应用。

Description

铜绿假单胞菌多重耐药基因液态芯片检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种铜绿假单胞菌多重耐药基因液态芯片检测试剂盒，属于生物检测技术领域。
背景技术
2010年，随着“超级细菌”这一名词频繁地见诸报端，细菌多重耐药、抗生素的合理使用重返人们视线。超级细菌其实并非新事物，它不是一个细菌的名称，而是一类细菌的名称，这一类细菌的共性是对几乎所有的抗生素都有强劲的耐药性，它们一直存在并且随着人类滥用抗生素而进化出强大耐药性。细菌耐药性，尤其是多重耐药性(multidrugresistance，MDR)已经成为非常严重的医疗问题及社会问题。
细菌耐药机理十分复杂，在抗生素的压力选择下，临床细菌耐药状况的日益恶化。细菌耐药性的检测与监测对于正确的目标性抗感染治疗以及监测细菌耐药性变迁和耐药菌感染的流行病学调查，制定防控细菌耐药性增加的措施至关重要。然而，目前临床实验室多采用耐药表型的检测方法，其检测周期长时效性差、检测通量低、影响因素多是最主要的问题，不能满足目前临床抗感染治疗和医院感染控制的要求。
液态芯片(又称流式荧光技术、液相芯片、悬浮阵列等)是在后基因组时代发展起来的新一代标准化开放式高通量技术平台，它有机地整合了编码微球、激光技术、应用流体学、最新的高速数字信号处理器和计算机运算法则，具有高通量、高速度、低成本、灵敏度高、重复性好、线性范围广等优点，可广泛应用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、受体和配体识别分析等研究，也是是目前唯一得到权威机构和医学界共同认可用于临床诊断的生物芯片平台。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：利用液态芯片技术，提供一种铜绿假单胞菌多重耐药基因液态芯片检测试剂盒。
本发明所述铜绿假单胞菌8个多重耐药基因包括OPRD2、TEM、OXA10、AAC3、AAC6、VIM、VEB、IMP。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
铜绿假单胞菌多重耐药基因液态芯片检测试剂盒，所述铜绿假单胞菌多重耐药基因包括OPRD2、TEM、OXA10、AAC3、AAC6、VIM、VEB、IMP共8个耐药基因，其特征在于，试剂盒包括核酸扩增组份和杂交组份；
核酸扩增组份具体包括下列成分：
预混液：含有dATP、dTTP、dCTP、dGTP、MgCl2的Tris-HCl缓冲液；
引物混合液：8对耐药基因的引物混合液；
聚合酶：含甘油和稳定剂配方的DNA聚合酶；阳性质控品：含OPRD2、TEM、OXAl0、AAC3、AAC6、VIM、VEB、IMP基因的阳性菌株混合液；
阴性质控品：灭菌水；
杂交组份具体包括下列成分：
微球杂交液：为8种包被探针的微球混合悬液；
链霉亲和素-藻红蛋白：含链霉亲和素-藻红蛋白的Tris-HCl和EDTA缓冲液；
上述8个耐药基因的引物序列为：
上述8个耐药基因的探针序列为：
耐药基因 探针序列
OXA10 Ox-PF：NH2-TTTTTTTTTTGATTTGTTGAAATACGGGAAC
TEM Te-PR：NH2-TTTTTTTTTTCGAAGAACGTTTTCCAATG
OPRD2 OP-PF1：NH2-TTTTTTTTCCAGCGGCGAAGACCGGA
VIM VI-PF：NH2-TTTTTTTACGTCCCGTCTGCGA
VEB VE-PF1：NH2-TTTTTTGAGATAGATAAAGGGAATCTTTCTT
AAC6 aac6-PF3：NH2-TTTCAAGCGTTTTAGCGCAAG
AAC3 aac3-PF3：NH2-TTTTTTTTTTGCGGGATCGAACGGCA
IMP IMP-PF1：NH2-TTTTTTCCGTTAACTTCTTCAAACGAAGT
本试剂盒采用通用引物多重PCR扩增，流式荧光杂交检测的方法，同时检测铜绿假单胞菌中OPRD2、TEM、OXA10、AAC3、AAC6、VIM、VEB、IMP共8个耐药基因。试剂盒共设有8个检测微球和1个质控微球。其中，与耐药基因杂交的探针包被在8个检测微球上，对应特异性探针的信号为阳性将被判定为该耐药基因阳性。质控微球是与铜绿假单胞菌外膜脂蛋白基因(opr I)杂交的探针，它的结果提示取样、抽提、PCR和杂交整个过程是否符合要求。检测时，首先PCR扩增待检测样本DNA，得到的PCR产物和微球上交联的探针根据碱基互补配对的原理杂交，加入荧光标记物，最后在流式分析仪上检测荧光信号。如果PCR产物和探针完全配对，则微球上相应探针捕获到标有生物素(Biotin)的PCR产物，加入标记了链霉亲合素(StrepAvidin，SA)的藻红蛋白(R-phycoerythrin，PE)后，形成微球-探针-PCR产物-Biotin-SA-PE复合物，在流式分析仪上即可检测到分类微球的荧光信号。如果PCR产物与探针不配对，则检测微球的荧光信号为背景信号，所得到的数据经分析后可以直接判断结果。
本发明的有益效果：
本发明提供的是试剂盒可以同时检测铜绿假单胞菌多重耐药基因，不仅可对铜绿假单胞菌的耐药性进行快速、准确检测，从而满足临床治疗的需要；同时，该试剂盒特异性高、可组合筛查、检测通量高，更便于推广应用。
具体实施方式
实施例1
铜绿假单胞菌多重耐药基因液态芯片检测试剂盒，所述铜绿假单胞菌多重耐药基因包括OPRD2、TEM、OXA10、AAC3、AAC6、VIM、VEB、IMP共8个耐药基因，其特征在于，试剂盒包括核酸扩增组份和杂交组份；
核酸扩增组份具体包括下列成分：
预混液：含有dATP、dTTP、dCTP、dGTP、MgCl2的Tris-HCl缓冲液；
引物混合液：8对耐药基因的引物混合液；
聚合酶：含甘油和稳定剂配方的DNA聚合酶；阳性质控品：含OPRD2、TEM、OXA10、AAC3、AAC6、VIM、VEB、IMP基因的阳性菌株混合液；
阴性质控品：灭菌水；
杂交组份具体包括下列成分：
微球杂交液：为8种包被探针的微球混合悬液；
链霉亲和素-藻红蛋白：含链霉亲和素-藻红蛋白的Tris-HCl和EDTA缓冲液；
上述8个耐药基因的引物序列为：
上述8个耐药基因的探针序列为：
耐药基因 探针序列
OXA10 Ox-PF：NH2-TTTTTTTTTTGATTTGTTGAAATACGGGAAC
TEM Te-PR：NH2-TTTTTTTTTTCGAAGAACGTTTTCCAATG
OPRD2 OP-PF1：NH2-TTTTTTTTCCAGCGGCGAAGACCGGA
VIM VI-PF：NH2-TTTTTTTACGTCCCGTCTGCGA
VEB VE-PF1：NH2-TTTTTTGAGATAGATAAAGGGAATCTTTCTT
AAC6 aac6-PF3：NH2-TTTCAAGCGTTTTAGCGCAAG
AAC3 aac3-PF3：NH2-TTTTTTTTTTGCGGGATCGAACGGCA
IMP IMP-PF1：NH2-TTTTTTCCGTTAACTTCTTCAAACGAAGT
实施例2实施例1中引物和探针的特异性验证：
1.分别取OPRD2、TEM、OXA10、AAC3、AAC6、VIM、VEB、IMP耐药的铜绿假单胞菌培养液，提取DNA。利用上述的引物配制多重PCR反应体系(40ul)：
2.配制的反应体系按下述程序扩增：
a)第一阶段：95℃，10min，1个循环。
b)第二阶段：95℃，30sec；56℃，30sec；72℃，30sec；40个循环。
c)第三阶段：72℃，10分钟，1个循环。
3.扩增后的PCR产物利用Luminex流式分析仪进行分析，步骤如下：
a.根据PCR反应的管数，用剪刀剪取相应大小的微孔杂交板。打开Luminex仪器预热，并将仪器上微孔板适配铜板的温度设定在48℃。
b.将微球杂交液试剂瓶置于涡旋仪上振荡30秒，使微球充分混悬在溶液中。并在每一个杂交孔中加入22μl；
c.每个样本吸取PCR扩增产物3μl，并依次加入到相应的上述杂交孔中，并抽吸几次加以混匀；
d.剪取相应大小的封板纸，将微孔杂交板覆盖封口。请用指压封口数次，确保封严，以防在高温变性和杂交时溶液蒸发；
e.将杂交板置于金属恒温浴(可以用PCR仪代替)，把仪器的盖子压紧已封口的杂交板，以防封板膜在加热后张开，导致液体蒸发。变性和杂交过程运行如下程序：
95℃ 5分钟 变性
48℃ 30分钟 杂交
f.小心将封板纸撕下，每孔加入荧光素SA-PE 75μl，并抽吸几次加以混匀。加完后将封板纸重新粘好，继续在48℃下孵育15分钟；
g.将微孔杂交板快速转移至预热好的Luminex流式分析仪上进行阅读，得到检测结果。
4.OPRD2、TEM、OXA10、AAC3、AAC6、VIM、VEB、IMP耐药铜绿假单胞菌杂交检测结果如下表，结果表明设计的引物和检测探针具有良好的特异性。
实施例3实施例1中引物和探针的灵敏度验证
分别取OPRD2、TEM、OXA10、AAC3、AAC6、VIM、VEB、IMP耐药的铜绿假单胞菌培养液，菌落计数后，统一稀释到1000/ml，然后梯度稀释并提取DNA，按实施例2中的步骤进行检测分析，结果如下表，表明设计的引物和检测探针均能检出125/ml的菌。
实施例4试剂盒应用验证
利用实施例1中的试剂盒进行了一定数量的临床标本检测分析，具体结果见下表。从检测结果来看，40份标本中，18份耐药基因阳性，其中含多耐药基因的标本9份(50％)。
标本来源于解放军第401医院、青岛市立医院、青岛大学附属医院、青岛市中心医院临床各科室，标本种类主要是痰液和伤口分泌物，其它有血液、尿液、静脉置管、胸水、腹水、咽拭子、胆汁。
操作流程：
样品检验操作包括以下三个主要步骤：标本处理，PCR扩增，杂交检测，最后是上机检测。
1.标本处理(在样品处理室进行)：
铜绿假单胞菌的分离、鉴定及细菌DNA提取：首先进行标本中铜绿假单胞菌的分离纯化，再进行革兰染色、氧化酶试验初步鉴定，最后采用法国梅里埃公司的ATB Expression进行生化鉴定，鉴定系统为ID 32GN。质控菌株为ATCC 27853。细菌DNA提取按照细菌DNA提取试剂盒操作说明进行，具体如下：
1)细菌培养：细菌接种于5ml液体培养基中，37℃摇床(300rpm)培养过液。2)细菌收集：取1ml培养物于1.5ml EP管中，室温8000rpm离心5min，弃上清，沉淀重新悬浮于1mlTE(pH8.0)中。3)菌体裂解：加入6μl 50mg/ml的溶菌酶，37℃作用2h。再加2mol/LNaCl50μl，10％SDS 110μl，20mg/ml的蛋白酶K 3μl，50℃作用3h或37℃过夜。4)抽提：菌液均分到两个1.5ml EP管，加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，室温放置5-10min。12000rpm离心10min。抽提两次。5)沉淀：加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。1 2000rpm离心10min。6)洗涤：沉淀用75％的乙醇洗涤。7)抽(凉)干后，溶于50μl ddH20中。
2.PCR试剂配制及PCR扩增(在试剂配制室和PCR扩增室内进行)：
将PCR相关试剂从冰箱中取出，室温下放置30分钟，使冷冻试剂完全融解；根据样品数目准备相应数量的PCR反应管。
(1)配制多重PCR反应体系(40ul)：
(2)配制的反应体系按下述程序扩增：
第一阶段：95℃，10min，1个循环。
第二阶段：95℃，30sec；56℃，30sec；72℃，30sec；40个循环。
第三阶段：72℃，10分钟，1个循环。
3.杂交检测(在扩增产物分析区进行)：
扩增后的PCR产物利用Luminex流式分析仪进行分析，步骤如下：
a.根据PCR反应的管数，用剪刀剪取相应大小的微孔杂交板。打开Luminex仪器预热，并将仪器上微孔板适配铜板的温度设定在48℃。
b.将微球杂交液试剂瓶置于涡旋仪上振荡30秒，使微球充分混悬在溶液中。并在每一个杂交孔中加入22μl；
c.每个样本吸取PCR扩增产物3μl，并依次加入到相应的上述杂交孔中，并抽吸几次加以混匀；
d.剪取相应大小的封板纸，将微孔杂交板覆盖封口。请用指压封口数次，确保封严，以防在高温变性和杂交时溶液蒸发；
e.将杂交板置于金属恒温浴(可以用PCR仪代替)，把仪器的盖子压紧已封口的杂交板，以防封板膜在加热后张开，导致液体蒸发。变性和杂交过程运行如下程序：
95℃ 5分钟 变性
48℃ 30分钟 杂交
f.小心将封板纸撕下，每孔加入荧光素SA-PE 75μl，并抽吸几次加以混匀。加完后将封板纸重新粘好，继续在48℃下孵育15分钟；
g.将微孔杂交板快速转移至预热好的Luminex流式分析仪上进行阅读，得到检测结果如下表。
部分临床标本检测结果：NC为阴性对照，S1-S40为检测标本，P1-P7为阳性对照，检测信号≥150为阳性。
球号 OP TE OX AAC3 AAC6 VI VE IMP Total Events
S1 215 63 92 52 50 61 27 22 968
S2 557 31 29 56 134 40 39 41 910
S3 571 40 28 45 36 63 27 25 998
S4 493 42 22 25 48 77 54 31 1072
S5 178 41 27 86 199 55 34 35 931
S6 184 65 49 20 23 31 36 24 947
S7 29 39 508 30 563 63 42 32 1028
S8 655 35 16 4 36 68 39 31 1004
S9 552 54 33 34 40 40 31 24 881
S10 389 12 30 25 12 48 19 24 979
S11 596 36 42 55 20 57 5 28 948
S12 33 64 39 47 54 69 48 22 979
S13 585 16 22 1 75 69 34 35 944
S14 609 65 100 20 64 75 2 45 938
S15 646 42 2775 28 782 5053 900 63 961
S16 41 46 1139 40 823 64 27 40 986
S17 37 39 32 35 44 76 23 28 934
S18 672 0 29 8 861 49 47 49 960
S19 670 48 24 36 771 76 1 18 969
S20 563 79 176 77 49 71 41 11 913
S21 186 31 60 52 20 69 54 28 923
S22 200 40 11 9 35 68 16 47 928
S23 218 25 31 61 35 73 51 35 957
S24 589 42 63 60 20 88 34 34 1098
S25 233 300 1207 413 230 58 45 28 991
S26 695 33 43 57 813 72 23 2765 886
S27 29 32 34 34 387 85 52 2603 938
S28 257 397 1793 1067 324 32 54 24 932
S29 606 33 62 45 88 70 38 20 984
S30 198 96 328 90 82 88 38 45 1010
S31 2381 75 56 53 38 80 23 38 967
S32 684 39 37 47 859 64 27 27 1051
S33 597 46 55 30 72 71 25 35 848
S34 276 47 119 14 79 71 51 30 930
S35 599 59 49 36 27 69 39 49 916
S36 55 9 50 32 188 64 34 3364 942
S37 1394 31 34 30 12 84 46 32 972
S38 518 143 407 95 45 65 49 30 1029
S39 211 2041 3072 2662 51 41 40 68 984
S40 200 26 44 57 39 68 16 44 1010
P1 641 64 54 49 36 71 67 50 916
P2 154 987 2592 2450 46 50 36 69 940
P3 557 84 59 2565 1636 101 53 52 955
P4 1653 72 31 57 93 95 67 53 966
P5 501 51 41 53 2127 7111 65 23 957
P6 491 44 3030 22 1624 6112 1206 48 887
P7 576 62 30 48 2159 112 29 2932 891
NC 73 116 56 54 57 41 39 33 1482
18份阳性标本的耐药基因与耐药表型分析结果一致(见下表)。
耐药基因阳性标本的耐药表型分析

Claims (1)

1.铜绿假单胞菌多重耐药基因液态芯片检测试剂盒，所述铜绿假单胞菌多重耐药基因包括OPRD2、TEM、OXA10、AAC3、AAC6、VIM、VEB、IMP共8个耐药基因，其特征在于，试剂盒包括核酸扩增组份和杂交组份；
核酸扩增组份具体包括下列成分：
预混液：含有dATP、dTTP、dCTP、dGTP、MgCl2的Tris-HCl缓冲液；
引物混合液：8对耐药基因的引物混合液；
DNA聚合酶；
阳性质控品：含OPRD2、TEM、OXA10、AAC3、AAC6、VIM、VEB、IMP基因的阳性菌株混合液；
阴性质控品：灭菌水；
杂交组份具体包括下列成分：
微球杂交液：分别包被针对8个耐药基因的探针的8种微球混合悬液；
质控微球：包被与铜绿假单胞菌外膜脂蛋白基因(opr I)杂交的探针
链霉亲和素-藻红蛋白：含链霉亲和素-藻红蛋白的Tris-HCl和EDTA缓冲液；
上述8个耐药基因的引物序列为：
上述8个耐药基因的探针序列为：
耐药基因 探针序列 OXA10 Ox-PF：NH2-TTTTTTTTTTGATTTGTTGAAATACGGGAAC TEM Te-PR：NH2-TTTTTTTTTTCGAAGAACGTTTTCCAATG OPRD2 OP-PF1：NH2-TTTTTTTTCCAGCGGCGAAGACCGGA VIM VI-PF：NH2-TTTTTTTACGTCCCGTCTGCGA VEB VE-PF1：NH2-TTTTTTGAGATAGATAAAGGGAATCTTTCTT AAC6 aac6-PF3：NH2-TTTCAAGCGTTTTAGCGCAAG′ AAC3 aac3-PF3：NH2-TTTTTTTTTTGCGGGATCGAACGGCA IMP IMP-PF1：NH2-TTTTTTCCGTTAACTTCTTCAAACGAAGT
。
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