CN104311694A - 一种牡蛎多糖及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种牡蛎多糖及其应用，该多糖由牡蛎经水提醇沉法提取、分离纯化而成。在仔猪上的应用表明牡蛎多糖可以促进仔猪生长，改善免疫应激仔猪的肠道健康，可在仔猪上应用于动物保健品的研制。牡蛎多糖目前未有报道具有促进仔猪生长，改善免疫应激仔猪肠道健康的作用。本发明发现牡蛎多糖能促进仔猪生长，改善免疫应激仔猪肠道健康，与现有猪的其他保健品相比，毒副小，无不良反应，且还有抗氧化、提高机体免疫力等作用，可长期使用；牡蛎原料易得，价廉，提取分离工艺简单，生产方便，开发价值高。

Description

一种牡蛎多糖及其应用

技术领域

本发明属于畜牧业领域，具体涉及一种牡蛎多糖及其应用。

背景技术

多糖（Polysaccharide）又叫多聚糖，是自然界中分子结构复杂且庞大的一类生物，是由多个（10个以上到上万个）单糖分子或单糖衍生物缩合、失水、通过糖苷键连接而成的高分子化合物。从1936年至今，随着世界各国学者逐步深入的研究，多糖的生物活性渐渐出现在人们视野中。近年来，各国学者从各种生物体内提取并研究了大量的生物活性多糖，人类医学研究和动物实验已经证实多糖具有免疫调节和抗肿瘤；抗血栓；抗病毒；降血脂、降血糖、保肝护肝、修复组织；抗氧化和抗衰老；抗寄生虫、抗溃疡、抗辐射、调节造血功能、保肝护肝、修复组织以及改善动物生产性能等一系列作用。其中多糖的免疫调节作用是主要的功能。多糖是国际上公认的天然优良的免疫调节剂，因此又叫生物反应调节剂（Biological response modifier,BRM）、生物活性多糖（Biological active polysaccharide,BAP）或免疫活性多糖（Immunological active polysaccharide）等。

应激，是指动物机体受到刺激后，发生的全身适应性的反应，故又称全身适应综合征，它是非特异性应答反应的总和，最早是由Hans Selye在论文“各种不同有害因素产生的综合征”和“机体胸腺和肾上腺对外伤和中毒的反应”中提出的，其中应激原包括环境温度、各种病原微生物及毒素等各种对机体有害的物质。Johnson认为，不良饲养环境中的病原体能激活动物机体的免疫系统，产生应激反应。而动物免疫应激是指病原微生物、疫苗或异源蛋白等抗原通过刺激动物机体，激活免疫系统，使后者产生了免疫应答，并导致动物群体中少数动物采食量下降，生长缓慢的一种普遍现象。免疫应激在畜牧业的生产实践中普遍存在，诱因主要包括疫苗的使用不当，免疫程序不合理，生产环境恶劣而使病原微生物滋生等。张建峰等曾报告了秦川牛注射口蹄疫油乳剂灭活苗后，部分牛出现精神萎靡不振，体温升高，采食量下降，瘤胃蠕动减弱的症状；刘建明等也报告过羊群在注射牛口蹄疫O型苗后出现精神不振，食欲减退甚至废绝等异常症状，之后有母羊和小羊出现死亡的现象。上述实例充分说明，由于疫苗的安全性不高或者个别畜禽对其反映强烈，部分畜禽在免疫后产生应激反应，出现生长缓慢，采食量下降，体温升高等应激症状，有的甚至出现个别畜禽死亡的现象。由此可知，免疫应激已对养殖业的发展造成了一定的影响。

肠道屏障分别由肠黏膜机械屏障、化学屏障、生物屏障和免疫屏障组成。当外来抗原侵袭时，各个屏障通过自身的分子调控机制和生物学功能协同抵抗。动物机体和外界环境接触面积最大的是肠黏膜。其屏障功能由特异性免疫效应和非特异性屏障组成^[15]。特异性免疫屏障是指由肠黏膜介导的体液和细胞免疫系统，即肠黏膜免疫系统，包括肠相关淋巴组织、免疫效应分子、细胞因子和弥散免疫细胞。肠黏膜免疫系统既要忙碌于对营养物质的消化吸收以维持机体的需要，又要对抗外来抗原物质的侵入，产生正确的免疫应答。

应激会使与大分子营养代谢和细胞增殖相关基因的表达量明显下降，而与氧化应激和免疫激活相关的基因的表达量显著上升，刺激仔猪肠道炎性细胞因子如IL-1、IL-6、IL-12等的过量表达，从而引起肠黏膜代谢和生理紊乱，导致肠道损伤。免疫应激会抑制仔猪和鸡的食欲；降低日增重和日采食量；肌肉组织、脂肪组织、体蛋白质和体脂肪的生长或沉积速度降低

目前已有200多种多糖被发现具有增强免疫的功能。关于多糖的生物学活性和功能性研究的逐渐深入，越来越多的多糖产品被开成为具有使用价值的美容和医药产品。通过与淋巴细胞的相互影响发挥免疫调节作用，多糖更是成为现今免疫学研究的宠儿。

牡蛎为牡蛎科动物长牡蛎（Ostrea gigas thunb）或近江牡蛎（Ostrea rivularis gould）等的肉。别名牡蛤《名医别录》，蛎蛤《神农本草经》，蛎房、蠔莆《本草图经》，左壳《中药志》，蠔《本草纲目》。牡蛎生于江河流入大海处，系杂食性动物，以细小的浮游生物为食。牡蛎在世界各国如中国、日本、美国等地都有生产，生长于沿海、河口及内湾。《民间兽医本草》中记载：牡蛎味咸涩，性凉。敛阴潜阳，止汗涩精。《师皇安骥集》：“味咸，微寒。下焦湿感，汗多出，阴下湿气，泄精，心胁痞热用之良。”《抱犊集》：“补肾，补大肠，补小肠。”《兽医药性赋》：“固涩软坚散阴结。”

牡蛎粗多糖(Oyster polysaccharides, OPS)是从牡蛎中提取出来的有效活性成分之一。它可以通过不同的方式抑制病毒的增殖和肿瘤细胞的增长，也可以通过T淋巴细胞的活性介导免疫应答，参与免疫反应。李志研究表明，牡蛎粗多糖中可得到OPS-Ⅰ和OPS-Ⅱ两种多糖，同时对小鼠实验中表明其具有较好的抗氧化作用，且腹腔注射3mg/ml牡蛎粗多糖能提高正常小鼠免疫功能，有效增加脾淋巴细胞和碳廓清洁力。其它研究表明，牡蛎粗提液具有抗肿瘤，抗氧化衰老，抗菌抗病毒，以及提高机体免疫功能等作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种牡蛎多糖及其应用，牡蛎多糖是从牡蛎中提取出来的有效活性成分之一。它可以通过不同的方式抑制病毒的增殖和肿瘤细胞的增长，也可以通过T淋巴细胞的活性介导免疫应答，参与免疫反应。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种牡蛎多糖，由葡萄糖单糖组成，由牡蛎经水提醇沉法提取、分离纯化而获得。

一种牡蛎多糖在断奶仔猪基础日粮中的应用。

所述牡蛎多糖在日粮中的含量为0.5-1.2%。

未见其具有促进仔猪生长，改善免疫应激仔猪肠道健康作用的有文献报道。

牡蛎多糖的提取方法及其理化特性由于已经发表，故不作为专利保护。具体方法见李志的硕士论文《牡蛎多糖的分离纯化及生物学活性研究》。

本发明的优点在于：

1、牡蛎多糖目前未有报道具有促进仔猪生长，改善免疫应激仔猪肠道健康的作用。本发明发现牡蛎多糖能促进仔猪生长，改善免疫应激仔猪肠道健康，与现有猪的其他保健品相比，毒副小，无不良反应，且还有抗氧化、提高机体免疫力等作用，可长期使用； 2、牡蛎原料易得，价廉，提取分离工艺简单，生产方便，开发价值高。

附图说明

图1 十二指肠（左）、空肠（中）和回肠（右）HE染色图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明：

实施例1 牡蛎多糖的提取与纯化

利用水提醇沉法提取牡蛎粗多糖，在单因素分析(提取时间、料液比、提取温度)的基础上进行正交分析，优化提取条件。正交试验结果显示，多糖提取的最佳工艺为温度为90℃，料液比为1：80，时间为3 h。采用苯酚—硫酸法测得牡蛎粗多糖总糖含量为72.43％。牡蛎粗多糖经除蛋白、透析、DEAE-52离子交换柱和Sephadex G-100凝胶层析柱，得到OPSII和OPSIIb两种多糖组分。紫外光谱分析(UV)显示，在260 m和280 nIIl均无核酸和蛋白质吸收峰。高效液相色谱(HPLC)法检测OPSIIb，有一个吸收峰，说明OPSIIb为均一多糖，可对其进行组成和结构分析。OPSIIb通过高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)、红外光谱(IR)、薄层色谱(TLC)和其他物理化学分析方法初步鉴定多糖的理化性质，结果表明OPSIIb具有多糖的特征吸收峰而且OPSIIb是由葡萄糖一种组分组成。

实施例2 牡蛎粗多糖对断奶仔猪生长性能的影响

1 材料和方法

1.1 材料

LPS（大肠杆菌血清型O55：B5，Sigma公司)，ELISA试剂盒（Cusabio Biotech Co.,LTD）； Trizol Prime Script® RT reagent Kit Perfect Real Time（TaKaRa Biotechnology Co.,Ltd），荧光试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司），琼脂糖。

试验动物与设计

选取体重相近的30头日龄在（28±1）d的断奶杜洛克×长白×大白三元已阉割公仔猪，随机分为空白对照组（A组），应激对照组（B组），牡蛎粗多糖高（C组）、中（D组）、低剂量（E组）组，每组6个重复，每个重复1头猪。空白对照组和免疫应激组饲喂基础日粮，牡蛎粗多糖高、中、低剂量组分别饲喂含有1.2%、0.8%、0.5%牡蛎粗多糖的基础日粮，饲喂周期为30d。试验前12h断水断料，试验各组腹腔注射100μg/kg BW LPS，空白对照组注射等量生理盐水。于注射3h后采血，剖检。

测定方法

（ 1 ）生长性能指标

始重：试验期第一天所称的重量（kg）

末重：结束试验当天所称的重量（kg）

平均日增重（ADG）：（末重-始重）（g）/试验天数（d）

平均日采食量（ADFI）：全期采食量（g）/试验天数（d）

料肉比（F/G）：饲料消耗（kg）/增重(kg)

（ 2 ）数据统计分析

采用SPSS13.0统计软件Compare Means中的单因素方差分析，用LSD和S-N-K进行方差异显著性分析，结果采用平均值±标准差（Mean±S.D）表示。本试验各实施例数据都按如上统计方法进行分析。

结果分析

2.1 仔猪生长性能

表1 仔猪生长性能结果

注：同行肩注不同大写字母者为差异极显著（P＜0.01），肩注不同小写字母者为差异显著（P＜0.05），肩注相同字母为差异不显著（P＞0.05）。

从表1可得，A/B、C、D、E各组间仔猪始重差异不显著（P＞0.05），说明各组仔猪分配的随机性。各组仔猪末重差异不显著（P＞0.05），但平均值高低顺序为E＞D＞C＞A/B。ADG值各组差异不显著（P＞0.05），但平均值高低顺序为E＞D＞C＞A/B，其中C、D、E组的平均值分别比A/B组提高了2.27%、9.82%、16.12%。各组的ADFI值相比，E＞D＞C＞A/B。各组F/G平均值高低顺序为A/B＞C＞D＞E。

讨论

3.1 牡蛎粗多糖对断奶仔猪生长性能的影响

关于牡蛎粗多糖对动物生长性能影响的研究报道较少，也未见系统的研究报道添加牡蛎粗多糖对断奶仔猪生产性能的影响和作用机理，其结果还有待证实。但就目前报道来看，添加多糖能提高断奶仔猪的生产性能。目前研究证实：果寡糖(FOS)可以提高猪的生产性能和疾病抵抗力；甘露寡糖(Mis—MOS)可以提高猪的生产性能。

试验表明日粮中添加1.2%、0.8%、0.5%牡蛎粗多糖促进仔猪生长，提高采食量，降低料肉比，虽然各组间差异不显著，但是作用效果为添加量0.5%＞0.8%＞1.2%＞空白对照组。

结论

在断奶仔猪基础日粮中添加牡蛎粗多糖有利于改善断奶仔猪生产性能，缓解由脂多糖（LPS）刺激引起的免疫应激。

实施例3 牡蛎粗多糖对断奶仔猪小肠段二糖酶活性的影响

仔猪断奶面临着供给的食物，由流质的母乳到颗粒狀的教槽料、粉状的乳猪料的变化。食物原料和形态的急剧变化带给仔猪行为上变化的同时，从更深层次上是对消化道造成了改变。小肠绒毛变短，隐窝变深，乳糖酶、蔗糖酶、麦芽糖酶等消化酶的活性降低，小肠吸收功能下降。机体对碳水化合物消化吸收的关键酶是二糖酶，其中尤以麦芽糖酶、蔗糖酶和乳糖酶三种为重，分别水解麦芽糖、蔗糖和乳糖成单糖而被机体吸收。

本试验通过分析日粮中添加1.2%、0.8%和0.5%的牡蛎粗多糖对断奶仔猪十二指肠、空肠段和回肠段麦芽糖酶、乳糖酶和蔗糖酶的活性，来研究牡蛎粗多糖是否能改善对LPS刺激断奶仔猪产生免疫应激引起肠道酶活性的改变。

材料和方法

1.1 材料

LPS（大肠杆菌血清型O55：B5，Sigma公司)；乳糖酶测定试剂盒、蔗糖酶测定试剂盒、麦芽糖测定试剂盒和蛋白定量测试盒（南京建成生物工程研究所）。

样品处理

采用颈静脉放血的办法处死，打开腹腔，将小肠从其肠系膜处取下后立即放入冰块中。挤出食糜，剖开小肠。十二指肠取样距胃贲门5cm处；空肠于1/2处取样；回肠于1/2处取样。于0.9%的生理盐水中轻轻冲洗除去肠壁上的内容物，放置于滤纸上吸干水分，刮取十二指肠、空肠和回肠黏膜各1.0g左右，加入9 ml 生理盐水冰浴匀浆，3000 r/min离心10 min，取上清液用于测定酶活性和蛋白质含量。

测定方法

乳糖酶、蔗糖酶、麦芽糖酶和蛋白按照试剂盒说明书进行测定。

结果

表2 牡蛎粗多糖对断奶仔猪小肠段二糖酶活性的影响

注：同列不同的大写字母表示差异极显著（P＜0.01），不同的小写字母表示差异显著（P＜0.05），相同字母表示差异不显著（P＞0.05）。

十二指肠中，麦芽糖酶A组和D组差异不显著（P＞0.05），其余各组差异极显著（P＜0.01）；蔗糖酶D组和E组差异不显著（P＞0.05），其余各组差异极显著（P＜0.01）；乳糖酶各组差异均极显著（P＜0.01）。

空肠中，麦芽糖酶和乳糖酶各组差异均极显著（P＜0.01）；蔗糖酶D组和E组差异不显著（P＞0.05），其余各组差异极显著（P＜0.01）。

回肠段中，麦芽糖酶D组和E组差异不显著（P＞0.05），其余各组差异极显著（P＜0.01）；蔗糖酶D组和E组差异不显著（P＞0.05），其余各组差异极显著（P＜0.01）；乳糖酶D组和E组差异不显著（P＞0.05），其余各组差异极显著（P＜0.01）。

讨论

有研究报道，麦芽糖酶、蔗糖酶和乳糖酶的活性变化及分布规律为：新生仔猪肠道中主要的二糖酶是乳糖酶，在空肠前段活性为最高，出生时较高，后随日龄逐步下降；而蔗糖酶和麦芽糖酶则不同，在空肠中段活性最高，出生时很低，后随日龄增长逐步升高。

有关二糖酶在小肠中的分布，本试验结果与其他人较一致。脂多糖（LPS）刺激断奶仔猪产生免疫应激极显著的降低了小肠中二糖酶的活性，而日粮中添加牡蛎粗多糖在一定程度上增加了二糖酶的活性，缓解了免疫应激。其中添加0.8%牡蛎粗多糖效果最好，最接近空白对照组。

小结

在断奶仔猪基础日粮中添加1.2%、0.8%、0.5%牡蛎粗多糖能增强由脂多糖（LPS）刺激免疫应激引起的肠道二糖酶的活性，显著的提高十二指肠、空肠和回肠段麦芽糖酶、蔗糖酶和乳糖酶的活性，且添加量为0.8%时缓解效果较好。

实施例4 牡蛎粗多糖对断奶仔猪肠黏膜机械屏障的影响

小肠的功能行使依赖于其完整性，一般通过测定绒毛的高度和隐窝的深度来体现。免疫应激导致绒毛高度的下降以及隐窝深度的增加，其中绒毛萎缩是由细胞凋亡的速度加快和细胞更新的速度降低共同引起的，隐窝深度则反映了上皮细胞生成的速度。

本试验通过分析日粮中添加1.2%、0.8%和0.5%的牡蛎粗多糖对断奶仔猪肠道形态发育，来研究牡蛎粗多糖对LPS刺激断奶仔猪产生免疫应激引起肠道损伤的保护机制。

材料和方法

1.1 材料

酒精、石蜡、玻片、二甲苯等。

4%多聚甲醛的配制：900ml 蒸馏水加入500ul 1N NaOH 在65-70℃水浴锅加热；加40g多聚甲醛，继续加热直至溶解；冷却至室温，补100ml 10*PBS溶液，并调PH至7.3。

10*PBS溶液（0.1mol/L）：取KH₂PO₄ 1.36g，加入0.1mol/L NaOH溶液79ml，稀释至200ml。

测定方法

（ 1 ） 样品处理

每组随机取2头剖检，小肠从其肠系膜处取下后立即放入冰块中。十二指肠取样距胃贲门5cm处；空肠于1/2处取样；回肠于1/2处取样。十二指肠、空肠、回肠各取1cm投入4%多聚甲醛，用于制作切片，HE染色拍照。挤出食糜，剖开消化道，用0.9%的生理盐水轻轻冲洗除去肠壁上的内容物，用滤纸吸干水分，用刀背分别刮取十二指肠、空肠上段和回肠的黏膜，用锡箔纸包裹放入-80℃冰箱中，用于Occludin mRNA、ZO-1 mRNA、Claudin-1 mRNA表达水平的测定。

（ 2 ） 肠道形态结构测定

①取经过4%中性甲醛液固定的十二指肠、空肠和回肠段，流水冲洗24h。

②组织脱水，包埋

50%酒精（2h）→60%酒精（2h）→70%酒精（2h）→85%酒精过夜→95%酒精（2h）→无水乙醇（2h）→无水乙醇（2h）→乙醇：二甲苯1:1(1h) →二甲苯（30min）→50-52℃石蜡（30min）→52-54℃石蜡（30min）→54-56℃石蜡（30min）→56-58℃石蜡（加适量蜂蜡）包埋

③组织切片：在室温下切成5μm切片。

④组织脱蜡：

二甲苯Ⅰ（15min）→二甲苯Ⅱ（15min）→无水乙醇（5min）→95%酒精（5min）→85%酒精（5min）→75%酒精（5min）→65%酒精（5min）→5%酒精（5min）→水洗（3h）。

⑤HE染色法：苏木素-伊红对比染色法。

苏木素液（10min）→水洗1%盐酸酒精分化（30s-1min）→流水充分洗涤→0.5-1%伊红酒精溶液复染(2-3min)→流水充分洗涤→置37℃烘箱中烘干→中性树胶封片。

⑥拍照

采用高清晰彩色病理图文分析系统，每个实验组测量6根绒毛（每组选取3张制作好的切片，每张取2个视野，每个视野取1根最长的、完整的、走向平直的且伸展良好的绒毛）的高度、宽度和隐窝深度。绒毛高度为肠腺开口至绒毛顶端垂直距离，绒毛宽度选取绒毛最宽的地方，隐窝深度为肠腺开口至最底部垂直距离，肠道绒腺比为绒毛长度与隐窝深度的比值。

结果

2.1 肠道 HE 染色结果

表3 小肠HE染色结果

注：同列肩注不同大写字母为差异极显著（P＜0.01），不同小写字母为差异显著（P＜0.05），相同字母为差异不显著（P＞0.05）。

十二指肠中，绒毛长度：A组和B组差异不显著（P＞0.05），D组和E组间差异不显著（P＞0.05），C组和D组差异显著（P＜0.05），其余差异极显著（P＜0.01）。隐窝深度：A组与B、C、D、E组差异极显著（P＜0.01），其余各组组间差异不显著（P＜0.05）。绒毛宽度：A组和E组差异显著（P＜0.05），其余各组差异不显著（P＞0.05）。绒毛/隐窝：A组和B组差异极显著（P＜0.01），A组和C组差异显著（P＜0.05），B组与D、E组组间差异显著（P＜0.05），其余各组差异均不显著（P＞0.05）。

空肠中，绒毛长度：A组与D组差异极显著（P＜0.01），A组和E组差异显著（P＜0.05），B组与D、E组差异极显著（P＜0.01），B组和C组差异显著（P＜0.05），其余各组差异不显著（P＞0.05）。隐窝深度：A组与B、C、D、E组差异极显著（P＜0.01），其余各组差异不显著（P＞0.05）。绒毛宽度：A、B、C、D、E各组组间差异均不显著（P＞0.05）。绒毛/隐窝：A组和B组差异极显著（P＜0.01），A组和C组差异显著（P＜0.05），B组较E组差异显著（P＜0.05），B组与D组差异极显著（P＜0.01），其余各组差异不显著（P＞0.05）。

回肠中，绒毛长度：A组与B、C、D、E组差异极显著（P＜0.01）， B组与D、E组差异极显著（P＜0.01），其余各组差异不显著（P＞0.05）。隐窝深度：A组与B、C、D、E组差异极显著（P＜0.01），其余各组组间差异不显著（P＜0.05）。绒毛宽度：A、B、C、D、E各组组间差异均不显著（P＞0.05）。绒毛/隐窝：B组与A、D、E组差异显著（P＜0.05），其余各组差异不显著（P＞0.05）。

讨论

3.1 牡蛎粗多糖对肠道绒毛结构的影响

绒毛高度和隐窝深度是评定小肠完整性的指标，是决定仔猪对腹泻敏感性强弱的因素之一。有研究表明，如给猪腹膜注入LPS后，肠黏膜血流量减少50％，肠黏膜通透性明显增加；Sukhotnik等也发现LPS刺激损害肠黏膜的完整性。LPS免疫应激会损害肠黏膜的完整性，破坏肠道结构和功能，使隐窝变深，降低绒毛高度与隐窝比。本试验结果表明LPS应激导致肠隐窝高度变深，而日粮中添加1.2%、0.8%和0.5%牡蛎粗多糖显著的提高小肠绒毛的高度，降低免疫应激带来的隐窝深度值的升高，从而升高了绒腺比。这表明牡蛎粗多糖在一定程度上改善了免疫应激改变的绒毛形态结构，增加了绒毛吸收细胞，减少了分泌细胞。

小结

在断奶仔猪基础日粮中添加0.8%的牡蛎粗多糖，能极显著的维护LPS应激反应后的肠道形态结构、提高肠黏膜紧密连接性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (3)

1.一种牡蛎多糖，其特征在于：所述牡蛎多糖由葡萄糖单糖组成，由牡蛎经水提醇沉法提取、分离纯化而获得。

2.一种如权利要求1所述的一种牡蛎多糖在断奶仔猪基础日粮中的应用。

3.根据权利要求2所述的一种牡蛎多糖在断奶仔猪基础日粮中的应用，其特征在于：所述牡蛎多糖在日粮中的含量为0.5-1.2%。