CN104303866B - 一种鉴定和评价小麦赤霉病扩展抗性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴定和评价小麦赤霉病扩展抗性的方法，该发明的基本特征是在小麦抽穗后，将赤霉菌孢子液注射到穗下节间茎秆内部而非滴入小花，根据第1病小穗出现的时间以及接种后第22-25天的病小穗率，综合评价小麦的赤霉病扩展抗性。该发明最大的优点是不论在大田或温室环境，接种后均无需采取保湿措施，解决了传统单花滴注法鉴定需要套袋或喷雾、喷水等保湿的问题。与传统单花滴注法相比，该发明接种效率更高但成本更低，提高了发病普遍率，并使品种抗、感表型差异最大化，更有利于普通技术人员判断小麦品种的赤霉病扩展抗性。
Description
技术领域
本发明属于植物抗病鉴定评价技术领域，具体地说属于一种鉴定和评价小麦赤霉病扩展抗性的方法。
背景技术
目前赤霉病扩展抗性评价采用的主流方法是单花滴注法鉴定，即在小麦扬花期对穗部的其中一个小花注射孢子液，标记接种时间，然后借助套塑料袋保持湿度，72小时后撕破或去掉塑料袋；或借助提前安装好的喷雾或喷水设备，在接种后定时喷雾或喷水保湿，在接种后18-21天，统计发病率，即病小穗占总小穗数的百分比进行抗病性评价。塑料套袋效率极低，同时容易损毁接种单株，若气温很高，导致袋内高温烧死接种麦穗，而且套袋的塑料不可避免造成环境污染，因此成本高；迷雾或喷雾系统一般适合在室内或温室条件下小规模的鉴定，后者受制于孢子浓度和环境条件，在温湿度适宜情况下，可能导致许多小穗同时发病，会造成抗病品种变感病的假象；高温高湿有利于发病，在病原菌选择压较轻或者温湿度不适合的情况下，往往造成感病品种变抗病的假象。因此只能分析品种抗性的大致情况，鉴定的一致性、稳定性较差，导致精确的表型鉴定非常困难，因此往往需要多年多点的鉴定评价，极大消耗物力、人力和财力，成本高昂且往往难以成功。
发明内容
本发明的目的在于克服传统单花滴注法评价赤霉病抗性中需要保湿措施、受环境影响明显、评价结果重现性差等缺点，提供一种无需保湿措施的，可在大田和温室环境条件下有效、可靠的评价赤霉病抗性的方法。本发明的方法在现有技术中均尚未有报道，是一种全新的可简易、快速评价赤霉病抗性的方法。
本发明的技术方案是通过在小麦抽穗后，将制备好的赤霉菌孢子液接种到小麦茎秆内部，记载接种点褐化情况，并记载从接种到第1病小穗出现的时间，在接种后第22-25天统计病小穗率，依据第1病小穗出现的时间和病小穗率来评价小麦的赤霉病扩展抗性。
本发明的具体步骤、流程和基本特征是：
a)从经过活化的赤霉菌株固体平板培养基上利用圆盘取样器，取3-5块带有赤霉菌株的PDA固体培养基放入150mL经过灭菌的绿豆汤液体培养基中，然后置于摇床上，在180rpm、温度25℃-28℃的条件下摇72-120小时，取样，观察产孢情况并吸取1uL孢子液，滴到血球计数板上，置于显微镜下测定孢子浓度，然后将经过摇床产孢的孢子液稀释或浓缩到100孢子/mL至200孢子/mL，得到用于接种到小麦茎秆内部的赤霉菌孢子液。
b)在小麦抽穗后到灌浆期利用医用注射器和注射针，将制备的赤霉菌孢子液直接注射到穗下节间茎秆内部，不同于单花滴注法方法的滴入小花。然后在穗下节间紧靠倒1小穗处贴上防水标签，标签上记载接种日期和菌株名称。无需借助塑料套袋或喷雾、喷水等措施保湿。
c)在接种3-5天后观察记载接种点的褐化情况。
d)记载从接种到第1病小穗出现的时间。
e)接种后第22-25天记载病小穗率，具体日期根据接种之日起20天内的平均气温情况决定，当平均气温高于25℃，则在接种后第22-23天统计病小穗率；当平均气温低于25℃，则在接种后第24-25天统计病小穗率。
所述的在接种后第22-23天统计病小穗率，若在接种之日的上午接种，则在第22天统计病小穗率；若在接种之日的下午接种，则在第23天统计病小穗率。
所述的在接种后第24-25天统计病小穗率，若在接种之日的上午接种，则在第24天统计病小穗率；若在接种之日的下午接种，则在第25天统计病小穗率。
f)依据接种当日起到第1病小穗出现的时间以及接种后第22-25天统计的病小穗率综合评价小麦赤霉病扩展抗性。
判断赤霉病扩展抗性评价方法体系的优劣的主要技术指标有：是否受温湿度等气候环境影响大，即评价结果的稳定性和一致性；发病的普遍率，赤霉菌是腐生菌，只要接种方法得当且温湿度适宜，理论或理想发病普遍率应达100%；表型差异最大化，适宜普通技术人员判别；对受体的破坏性以及是否环境友好；接种方法的易操作性、效率和成本；
对比传统的单花滴注法包括结合套袋、喷雾保湿的方法，和本发明在上述5个技术指标方面的差异，得出本发明方法的优势和积极效果为：
（1）单花滴注法易受外界湿度的影响，重复间相关系数通常介于0.2-0.7之间；本发明直接将孢子液注射到穗下节间茎秆内部，发病的湿度由植株体内来保证，无需套袋或喷雾（水）来保湿，提高了稳定性和一致性，重复间相关系数大于0.85；
（2）在无保湿措施且气候干燥的条件下，本发明接种方法穗部发病普遍率显著高于单花滴注法，单花滴注法普遍率一般为50-80%，本发明达到90-100%；单花滴注法在有保湿措施的条件下，本发明和单花滴注法的发病普遍率没有显著差异；
（3）单花滴注法主要根据发病小穗数占总小穗数的百分比衡量，因此是一种数量化度量，在孢子浓度高且高温高湿条件下，即高选择压下，单花滴注法可使抗病和感病品种的多个小花或小穗同时感染病菌，缩小了抗、感品种的差异，即容易出现抗性品种的假感性；在孢子浓度低或在气候干燥且无保湿条件下，单花滴注法同样可使抗病和感病品种表型差异缩小，易导致感病品种的假抗性，从而影响评价品种本来真实的抗性情况；而本发明通过观察接种点上部小穗是否出现病症，出现为感，不出现为抗，使不同抗感品种表型差异最大化，更易于普通技术人员判断品种的抗性，同时也可在接种后22-25天计算病小穗率；
（4）传统单花滴注法在塑料套袋保湿情况下，若气温很高，导致袋内高温烧死接种麦穗，同时烧死病原菌，导致接种失败，同时塑料袋中水分积聚充满空气，穗头承重增加，导致在大风天气很容易折断接种穗，而且袋子本身对环境存在白色污染；而本发明无需套袋保湿，因此不存在破坏受体穗和污染环境的情况；
（5）传统单花滴注法往往需要结合套袋、迷雾或大田喷雾设施进行保湿，因此增加额外成本；而本发明无需上述设施，因此成本低、接种效率高，比在用塑料套袋保湿方法快4-5倍，普通技术人员培训后即可实施。
具体实施方式
本发明对已知的公认的高抗赤霉病品种NP154和高感赤霉病品种NP516，在大田无保湿情况下使用本发明进行赤霉病接种和抗性评价情况。根据接种后第1病小穗出现的时间以及统计的病小穗率两个指标上评价其抗性材料间的抗性差异。
为了更好的理解该发明实施方式，我们列出了该发明的实验材料信息：NP154是中国高抗赤霉病品种，该品种携带赤霉病抗性基因，而NP516是美国引进的感赤霉病病品种，不携带任何已知抗赤霉病基因。在单花滴注法且有保湿的情况下，NP154的病小穗率介于0.05-0.16，而NP516后者介于0.75-1.00间。
本发明鉴定和评价小麦赤霉病扩展抗性的方法的步骤是：从经过活化的赤霉菌株固体平板培养基上利用圆盘取样器，取3-5块带有赤霉菌株的PDA固体培养基放入150mL经过灭菌的绿豆汤液体培养基中，然后置于摇床上，在180rpm、温度25℃-28℃的条件下摇72-120小时，取样，观察产孢情况并吸取1uL孢子液，滴到血球计数板上，置于显微镜下测定孢子浓度，然后将经过摇床产孢的孢子液稀释或浓缩到100孢子/mL至200孢子/mL，得到用于接种到小麦茎秆内部的赤霉菌孢子液。在小麦抽穗后到灌浆期利用医用注射器和注射针，将制备的赤霉菌孢子液直接注射到穗下节间茎秆内部，然后在穗下节间紧靠倒1小穗处贴上防水标签，标签上记载接种日期和菌株名称，无需借助塑料套袋或喷雾、喷水等措施保湿。在接种3-5天后观察记载接种点的褐化情况。记载从接种到第1病小穗出现的时间。接种后第22-25天记载病小穗率，具体日期根据接种之日起20天内的平均气温情况决定，当平均气温高于25℃，则在接种后第22-23天统计病小穗率；当平均气温低于25℃，则在接种后第24-25天统计病小穗率。所述的在接种后第22-23天统计病小穗率，若在接种之日的上午接种，则在第22天统计病小穗率；若在接种之日的下午接种，则在第23天统计病小穗率。所述的在接种后第24-25天统计病小穗率，若在接种之日的上午接种，则在第24天统计病小穗率；若在接种之日的下午接种，则在第25天统计病小穗率。依据接种当日起到第1病小穗出现的时间以及接种后第22-25天统计的病小穗率综合评价小麦赤霉病扩展抗性。
在大田无保湿情况下使用本发明进行赤霉病接种和抗性评价情况，根据接种后第1病小穗出现的时间以及统计的病小穗率两个指标上评价其抗性材料间的抗性差异，经过实验验证，得到的结果是：
（1）接种点褐化时间：接种点褐化情况是衡量接种是否成功的重要指标，接种成功的话则出现褐化，接种失败则不出现褐化，后者情况下不再记载第1病小穗出现的时间以及统计后续的病小穗率，NP154和NP516均在接种后第4-5天接种点出现褐化情况，品种间无差异。
（2）接种后第1病小穗出现的时间：抗病品种NP154从接种之日起到接种后第24天，均未有病小穗出现；而NP516在接种后第12-15天在穗部出现病小穗；因此从第1病小穗出现的时间可有效区分抗病品种NP154和感病品种NP516在赤霉病扩展抗性方面的差异，使得抗、感品种差异表型最大化。
（3）接种后第24天的病小穗率：抗病品种NP154从接种之日起到接种后第24天，均未有病小穗出现，因此病小穗率等于0；而感病品种NP516病小穗率则介于0.21-0.33之间，因此对抗感品种进行数量化度量，仍可有效区分NP154和NP516之间的差异。
上述实验结果证明，本发明鉴定和评价小麦赤霉病扩展抗性的方法便于实施，实验过程快速，鉴定方便，使不同抗感品种表型差异最大化，更易于普通技术人员判断品种的抗性，并且无需保湿措施，环境友好，能够在大田和温室环境条件下准确、有效、可靠的评价赤霉病抗性。
Claims (9)
1.一种鉴定和评价小麦赤霉病扩展抗性的方法，其特征是：在小麦抽穗后，将制备好的赤霉菌孢子液接种到小麦茎秆内部，记载接种点褐化情况，并记载从接种到第1病小穗出现的时间，在接种后第22-25天统计病小穗率，评价小麦的赤霉病扩展抗性，将制备好的赤霉菌孢子液接种到茎秆内部是指利用医用注射器和注射针将赤霉菌孢子液直接注射到紧临穗基部小穗下面的茎秆内腔。
2.根据权利要求1所述的鉴定和评价小麦赤霉病扩展抗性的方法，其特征是：在穗下节间紧靠基部小穗处用防水标签标注接种日期和菌株名称。
3.根据权利要求1或2所述的鉴定和评价小麦赤霉病扩展抗性的方法，其特征是：所述的赤霉菌孢子液的制备是从经过活化的赤霉菌株固体平板培养基上利用圆盘取样器，取3-5块带有赤霉菌株的PDA固体培养基放入150mL经过灭菌的绿豆汤液体培养基中，然后置于摇床上，在180rpm、温度25℃-28℃的条件下摇72-120小时，取样，观察产孢情况并吸取1uL孢子液，滴到血球计数板上，置于显微镜下测定孢子浓度，然后将经过摇床产孢的孢子液稀释或浓缩到100孢子/mL至200孢子/mL。
4.根据权利要求1所述的鉴定和评价小麦赤霉病扩展抗性的方法，其特征是：所述的记载接种点褐化情况是指在接种3-5天后观察记载接种点的褐化情况。
5.根据权利要求1所述的鉴定和评价小麦赤霉病扩展抗性的方法，其特征是：所述的第1病小穗指位于接种点上面首次出现赤霉病病症的小穗。
6.根据权利要求1所述的鉴定和评价小麦赤霉病扩展抗性的方法，其特征是：所述的在接种后第22-25天统计病小穗率，具体日期根据接种之日起20天内的平均气温情况决定，当平均气温高于25℃，则在接种后第22-23天统计病小穗率；当平均气温低于25℃，则在接种后第24-25天统计病小穗率。
7.根据权利要求6所述的鉴定和评价小麦赤霉病扩展抗性的方法，其特征是：所述的在接种后第22-23天统计病小穗率，若在接种之日的上午接种，则在第22天统计病小穗率；若在接种之日的下午接种，则在第23天统计病小穗率。
8.根据权利要求6所述的鉴定和评价小麦赤霉病扩展抗性的方法，其特征是：所述的在接种后第24-25天统计病小穗率，若在接种之日的上午接种，则在第24天统计病小穗率；若在接种之日的下午接种，则在第25天统计病小穗率。
9.根据权利要求1所述的鉴定和评价小麦赤霉病扩展抗性的方法，其特征是：所述的评价小麦的赤霉病扩展抗性的依据是从接种当日起到第1病小穗出现的时间和接种后第22-25天统计的病小穗率。
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