CN104297233A - 动物体液中β-受体激动剂类药物的检测方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种动物体液中的β-受体激动剂类药物的检测方法，其中，该方法包括将待测动物体液与乙腈、乙醇或多壁碳纳米管进行第一接触获得样品提取液，将样品提取液与氯金酸溶液和十六烷基三甲基溴化铵溶液在PBS缓冲液中进行第二接触获得反应混合液，将反应混合液在60℃-100℃下孵育4-12分钟后观察反应混合液的颜色变化。本发明还提供了一种β-受体激动剂类药物检测试剂盒。利用本发明所提供的方法能够简便、快速对动物体液中的多种β-受体激动剂类药物进行检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物样品的快速检测方法和检测试剂盒，尤其涉及一种动物体液中β-受体激动剂类药物的检测方法及试剂盒。
背景技术
兽药、添加剂及有害化合物残留是影响我国动物性产品安全的重要因素，国内外在养殖环节非法使用β-受体激动剂类药物(俗称“瘦肉精”)已经造成多起食品安全事件，成了困扰世界范围内食品安全的难题。它不仅威胁着人类的健康，具有致畸、致突变和致癌等作用；同时严重影响畜禽产品的出口贸易，造成巨大的经济损失。我国政府从1997年起就已明令禁止在动物养殖过程中使用“瘦肉精”，经过多年治理，成效显著。但受利益驱使，少部分不法经营者仍在违法使用，“瘦肉精”问题始终难以根除，对我国的食品安全构成极大威胁。其中，监管技术落后是“瘦肉精”屡禁不止的一个重要因素。
目前，市场上快速检测β-受体激动剂类违禁药物的筛选方法主要为酶联免疫试剂盒和胶体金试纸条方法，这两种方法的缺陷在于一次都只能对一种已知种类的β-激动剂类药物进行筛选，而且现在市场上也只有克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇等为数不多的几种β-受体激动剂类药物的快速检测试剂盒或试纸条，且国内相关产品假阳性率高，这样极大得限制了政府和企业快速筛选的范围和速度，为畜禽产品的快速流通带来了很大的影响。因此需要加大力度开展快速、准确、灵敏、方便且易产业化的快速筛选技术研究。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种简便、快速的动物体液中的多种β-受体激动剂类药物的检测方法。
本发明的第二个目的在于提供一种在现场简单、快速的检测动物体液中的β-受体激动剂类药物的检测试剂盒。
为了实现本发明的第一个目的，本发明提供了一种动物体液中的β-受体激动剂类药物的检测方法，其中，该方法包括将待测动物体液与乙腈、乙醇或多壁碳纳米管进行第一接触获得样品提取液，将样品提取液与氯金酸溶液和十六烷基三甲基溴化铵溶液在PBS缓冲液中进行第二接触获得反应混合液，将反应混合液在60℃-100℃下孵育4-12分钟后观察反应混合液的颜色变化。
优选的，以体积份计，所述反应混合液包括：样品提取液0.5-1份、氯金酸溶液0.9-1.1份、十六烷基三甲基溴化铵溶液0.9-1.1份、PBS缓冲液7-7.5份。
优选的，反应混合液中氯金酸溶液的浓度为0.3-1.2×10-3M，十六烷基三甲基溴化铵溶液的浓度为2-8mM，PBS缓冲液的pH值为7-10。
优选的，所述第一接触包括，将待测动物体液与乙腈或乙醇震荡混匀40-60秒后静置4-6分钟获得静置混合物，再将所述静置混合物在11000-12000rpm下离心8-12分钟获得样品提取液。
在所述第一接触中，待测动物体液与乙腈或乙醇的体积比为1：1-3；优选的，所述第一接触为待测动物体液与乙醇接触，待测动物体液与乙醇的体积比为1：2。
优选的，所述第一接触为待测动物体液与多壁碳纳米管接触，第一接触的步骤包括：
将待测动物体液与多壁碳纳米管震荡混匀5-10min后以11000-12000r/min的转速离心3-5min弃去上清液获得第一沉淀，将第一沉淀与水震荡混匀1-3min后以11000-12000r/min的转速离心3-5min弃去上清液获得第二沉淀，将第二沉淀与5％氨水甲醇震荡混匀后以11000-12000r/min的转速离心3-5min，吸取上清液获得样品提取液；
其中，所述多壁碳纳米管的表面进行了羧基化修饰、外径大于50nm，长度为20-30μm；所述5％氨水甲醇是将氨水与甲醇按照1:19的体积比混合获得的混合溶液；
其中，相对于1mL的动物体液，多壁碳纳米管的用量为5-10mg、水的用量为0.5-1mL、5％氨水甲醇的用量为0.5-1mL。
优选的，所述β-受体激动剂类药物选自莱克多巴胺、克伦特罗、沙丁胺醇、西马特罗、西布特罗、马布特罗、溴布特罗、班布特罗、非诺特罗、奥西那林、异克舒令、异丙肾上腺、克伦普罗、氯丙那林、特布他林、妥布特罗、齐帕特罗、苯乙醇胺A、皮布特罗、马喷特罗、拉贝特罗、喷布特罗、福莫特罗、沙美特罗、异克伦潘特素中的至少一种。
优选的，所述动物体液为血清、血浆、乳液、尿液。
优选的，观察反应混合液的颜色变化，当反应混合液显淡红色或红色时，表明动物体液中存在β-受体激动剂类药物；当反应混合液不显色时，则表明动物体液中不含有β-受体激动剂类药物或β-受体激动剂类药物的总含量低于2ng/mL。
为了实现本发明的第二个目的，本发明还提供了一种β-受体激动剂类药物检测试剂盒，其中，所述试剂盒包括，
乙腈、乙醇或多壁碳纳米管；
氯金酸溶液；
十六烷基三甲基溴化铵溶液；
PBS缓冲液；以及
阳性对照品和/或阴性对照品。
根据本发明所提供的β-受体激动剂类药物的检测方法，能够同时检测畜禽动物体液(如血液、乳液、尿液)中的多种β-受体激动剂类药物，其定性及半定量的最低检出限为2ng/mL，操作过程简便快捷，因此可以实现实时、在线的检测，提高了实际操作中的检测效率。
附图说明
图1为在猪血清中加入克伦特罗后，生成的纳米金的颜色变化示意图。
图2为在猪尿液中加入克伦特罗后，生成的纳米金的颜色变化示意图。
图3为在牛乳液中加入莱克多巴胺，生成的纳米金的颜色变化示意图。
图4为在猪血清中加入克伦特罗后，生成的纳米金的颜色变化示意图。
具体实施方式
下面将通过具体实施方式对本发明进行详细说明。
根据本发明的一种动物体液中的β-受体激动剂类药物的检测方法，其中，该方法包括将待测动物体液与乙腈、乙醇或多壁碳纳米管(MWCNTs)进行第一接触获得样品提取液，将样品提取液与氯金酸溶液和十六烷基三甲基溴化铵溶液在PBS缓冲液中进行第二接触获得反应混合液，将反应混合液在60℃-100℃下孵育4-12分钟后观察反应混合液的颜色变化。
其中，在本发明所提供的方法中，所述待测动物为可能在养殖过程中摄入β-受体激动剂类药物的畜禽类动物。
为了实现对待测动物进行快速、实时的检测，本发明的主要检测对象可以为取自动物的体液样品，体液的种类包括但不限于动物的血清、血浆、乳液和尿液，优选的情况下，所述体液为动物的血清。值得注意的是，本发明所提供的方法虽然主要是针对取自动物的体液样品进行检测，但是本领域技术人员通过阅读本发明的内容可以得知，在能够通过预处理得到合适的液体样本的前提下，本发明所提供的方法也同样可以适用于其它待测样品，例如动物组织、饲料、兽药、饲料添加剂等可能有β-受体激动剂类药物存在的样品。
在本发明中，所述反应混合液的颜色变化指由于生成的金纳米颗粒所引起的溶液的颜色变化，一般的，当反应混合液中没有金纳米颗粒生成时，反应混合液呈现无色，当有少量的金纳米颗粒生成时，可以呈现淡红色或粉红色，随着金纳米颗粒数量增多，溶液的颜色也随之加深，在金纳米颗粒数量较多时，反应混合液可能呈现红色。
在本发明的一种实施方式中，在所述第一接触中待测动物体液与乙腈或乙醇得到充分的混匀，为了达到混合均匀的目的，可以借助漩涡震荡的方式，例如可以将待测动物体液与乙腈或乙醇的混合物在漩涡震荡仪上震荡混匀40-60秒。在震荡混匀之后静置4-6分钟获得静置混合物，再对所述静置混合物进行离心，离心的目的是去掉待测动物体液中大部分蛋白质、脂肪、氨基酸、酸类、糖类等干扰物质获得样品提取液。优选的，所述离心的条件为在10000-12000rpm的转速下离心8-12分钟，特别优选的情况下，所述离心为低温离心，当采用低温离心的方法时，可以在混匀后直接离心，低温离心的温度控制在4℃。其中，所述第一接触中使用的乙腈为无水乙腈，乙醇为无水乙醇。
在本发明的一种实施方式中，第一接触中，待测动物体液与乙腈或乙醇的体积比为1:1-3，优选的，待测动物体液与乙腈或乙醇的体积比为1:1.5-2.5。
在本发明的一种优选的实施方式中，第一接触为待测动物体液与乙醇接触，待测动物体液与乙醇的体积比为1：2。
在本发明的一种实施方式中，所述第一接触为待测动物体液与多壁碳纳米管接触，所述多壁碳纳米管可以是经过或未经过羧基化修饰的多壁碳纳米管，其外径的尺寸可以为5-100nm，长度为0.5-30μm。
优选的，为了获得更好的预处理效果，本发明所述的多壁碳纳米管为表面进行了羧基化修饰的碳纳米管，本发明对于进行羧基修饰的方法没有特别的限制，可以为按照本领域常规的碳纳米管表面羧基修饰方法进行。更加优选的，所述多壁碳纳米管的外径大于50nm，长度为20-30μm。
将待测动物体液与多壁碳纳米管震荡混匀5-10min后以11000-12000r/min的转速离心3-5min弃去上清液获得第一沉淀，将第一沉淀与水震荡混匀1-3min后以11000-12000r/min的转速离心3-5min弃去上清液获得第二沉淀，将第二沉淀与5％氨水甲醇震荡混匀后以11000-12000r/min的转速离心3-5min，吸取上清液获得样品提取液；
其中，所述5％氨水甲醇是将氨水与甲醇按照1:19的体积比混合获得的混合溶液；
其中，相对于1mL的动物体液，多壁碳纳米管的用量为5-10mg、水的用量为0.5-1mL、5％氨水甲醇的用量为0.5-1mL。
其中，震荡混匀的过程可以采用涡旋振荡器进行。
在发明所提供的方法中，以体积份计，所述反应混合液包括：样品液0.5-1份、氯金酸溶液0.9-1.1份、十六烷基三甲基溴化铵溶液0.9-1.1份、PBS缓冲液7-7.5份；优选的，所述反应混合液包括：样品提取液0.5份、氯金酸溶液1份、十六烷基三甲基溴化铵溶液1份、PBS缓冲液7.5份。
其中，氯金酸溶液的浓度为0.3-1.2×10-3M，十六烷基三甲基溴化铵溶液的浓度为2-8mM；优选的，所述氯金酸溶液的浓度为所述氯金酸溶液的浓度为0.4-0.5×10-3M，十六烷基三甲基溴化铵溶液的浓度为6-8mM。
本发明的发明人发现，当在反应的体系中加入十六烷基三甲基溴化铵溶液(CTAB)时，可以提高检测的灵敏度，这可能是由于CTAB作为一种表面携带有负电荷的表面活性剂，能够缠绕在纳米金颗粒的表面，增加了纳米金之间的排斥力，从而使得纳米金在低浓度下也能够在溶液中很好的分散，呈现明显的红色，避免了纳米金发生团聚形成肉眼难以观察的颜色。
本发明中，对于进行第二接触的方式没有特别的限制，只要能够使得各组分在体系中充分混合均匀即可，可以将反应混合液在60-100℃下孵育4-12分钟后观察反应混合液的颜色变化，优选的，可以在65-70℃下孵育4.5-10分钟。特别的，当所述动物体液为尿液时，最为优选的孵育时间为10分钟。
在本发明的一些实施方式中，本发明所提供的方法还包括设置阳性对照品、阴性对照品和空白样品，其中，所述阳性对照品可以为含有β-受体激动剂类药物的动物体液，例如，在本发明的一种实施方式中，当待测动物体液为血清时，可以按照以下方式制备阳性对照品：向1mL不含有β-受体激动剂类药物的血清中加入10μL的β-受体激动剂类药物标准溶液，混匀备用。所述阴性对照品为不含有β-受体激动剂类药物的血清，空白样品可以为pH为8的100mM硼砂缓冲溶液。
在孵育结束后对反应混合液的颜色变化进行观察，在保证阳性样品显红色，阴性和空白样本不显色的前提下，如果反应混合液显淡红色或红色，则表明动物体液中存在β-受体激动剂类药物，若反应混合液不显色，则表明动物体液中不含有β-受体激动剂类药物或总含量低于2ng/mL；也可以利用分光光度计检测孵育后的反应混合液在520nm处的可见吸收光谱，若在520nm处的吸收光度值大于阴性样本的2倍，则认为待测动物体液中存在β-受体激动剂类药物。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述PBS缓冲液的pH值为7-10；特别优选的，所述PBS缓冲液的pH值为9。
本发明所提供的方法的适用范围广泛，并非仅仅针对某一种或几种β-受体激动剂类药物进行检测，只要待测动物体液中有总浓度不低于2ng/mL的β-受体激动剂类药物均能通过本发明的方法检测出来。
在本发明中，所述β-受体激动剂类药物可以为任何本领域已知的和未知的β-受体激动剂类药物，例如，所述β-受体激动剂类药物可以选自莱克多巴胺(ractopamine)、克伦特罗(clenbuterol)、沙丁胺醇(salbutamol)、西马特罗(cimaterol)、西布特罗(cimbuterol)、马布特罗(mabuterol)、溴布特罗(brombuterol)、班布特罗(bambuterol)、非诺特罗(fenoterol)、奥西那林(metaproterenol)、异克舒令(isoxsuprine)、异丙肾上腺素(isoproterenol)、克伦普罗(Clenproperol)、氯丙那林(Clorprenaline)、特布他林(Terbutaline)、妥布特罗(Tulobuterol)、齐帕特罗(Zilpaterol)、苯乙醇胺A(phenylethanolaMine A)、皮布特罗(pirbuterol)、马喷特罗(Mapenterol)、拉贝特罗(labetalol)、喷布特罗(Penbutolol)、福莫特罗(Formoterol)、沙美特罗(Salmeterol)和异克伦潘特(Clenisopenterol)中的至少一种。
本发明还提供了一种β-受体激动剂类药物检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括，
乙腈、乙醇或多壁碳纳米管；
氯金酸溶液；
十六烷基三甲基溴化铵溶液；
PBS缓冲液；以及
任选地，阳性对照品和/或阴性对照品。
其中，氯金酸溶液的浓度为0.3-1.2×10-3M，十六烷基三甲基溴化铵溶液的浓度为2-8mM。特别优选的，所述氯金酸溶液的浓度为0.4×10-3M，十六烷基三甲基溴化铵溶液的浓度为6mM。
在所述试剂盒中，所述PBS缓冲液的pH值为7-10；特别优选的，所述PBS缓冲液的pH值为9。
下面通过实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。
实施例1
实施例1用于说明当本发明所提供的方法用于检测含有不同浓度的β-受体激动剂类药物的动物体液时的效果。
待测的不同浓度样品的准备：向1mL不含有β-受体激动剂类药物的猪血清中加入克伦特罗，分别配置成浓度为1.6、1.2、0.8、0.4、0.2、0.1、0.02、0.01、0μg/mL的待测样品。
取上述各浓度的待测猪血清300μL于1.5mL离心管中，每个样品做两个重复；加入无水乙醇600μL，漩涡震荡1min，静置5min；
将离心管在4℃下12000rpm低温离心10min获得上清液；
在1.5mL的离心管中，加入80μL浓度为0.4×10-3M的HAuCl4溶液，80μL浓度为60mM的CTAC溶液，40μL的上述上清液，600μL的pH 9的PBS溶液，混合均匀；
同时分别取阳性对照品、阴性对照品、空白样品各40μL，分别加入80μL HAuCl4，80μL CTAC，600μL的pH 9的PBS溶液，混合均匀；
将反应溶液同时放置于70℃水浴锅中水浴反应5min；
反应结束后，将离心管从水浴锅中取出。观察生成纳米金的颜色变化，检测结果见图1。利用TU-1901UV-vis型分光光度计对各样品在520nm波长处的吸光值，结果列于表1。
从图1的结果可以看出，随着猪血清中克伦特罗浓度的增加，反应混合液的颜色呈现逐渐加深的趋势。
实施例2
按照与实施例1相同的方法对动物体液样本进行检测，不同的是，待测的不同浓度样品的准备方式为：向不含有β-受体激动剂类药物的猪尿液中加入克伦特罗，分别配置成浓度为1.6、1.2、0.8、0.4、0.2、0.1、0.02、0.01、0μg/mL的待测样品。观察生成纳米金的颜色变化，检测结果见图2。利用TU-1901UV-vis型分光光度计对各样品在520nm波长处的吸光值，结果列于表1。
从图2的结果可以看出，随着猪尿液中克伦特罗浓度的增加，反应混合液的颜色呈现逐渐加深的趋势。
实施例3
按照与实施例1相同的方法对动物体液样本进行检测，不同的是，待测的不同浓度样品的准备方式为：向1mL不含有β-受体激动剂类药物的牛乳液中加入莱克多巴胺，分别配置成浓度为1.6、1.2、0.8、0.4、0.2、0.1、0.02、0.01、0μg/mL的待测样品。观察生成纳米金的颜色变化，检测结果见图3。利用TU-1901UV-vis型分光光度计对各样品在520nm波长处的吸光值，结果列于表1。
从图3的结果可以看出，随着牛乳液中莱克多巴胺的增加，反应混合液的颜色由淡红色至红色呈现逐渐加深。
实施例4
按照与实施例1相同的方法对动物体液样本进行检测，不同的是，利用多壁碳纳米管对待测猪血清进行处理，取动物体液10mL，加入50mg多壁碳纳米管(购于南京先锋纳米材料科技有限公司。外径为55nm，长度为25μm)，涡旋震荡混匀5-10min，以12000r/min离心5min，弃去上清液，加入5mL水后涡旋震荡混匀2min，以12000r/min离心3min弃去上清液，加入5mL5％氨水甲醇(0.5：9.5v/v)，涡旋1min后以12000r/min离心5min获得样品提取液。观察生成纳米金的颜色变化，检测结果见图4。利用TU-1901UV-vis型分光光度计对各样品在520nm波长处的吸光值，结果列于表1。
表1
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种动物体液中的β-受体激动剂类药物的检测方法，其特征在于，该方法包括将待测动物体液与乙腈、乙醇或多壁碳纳米管进行第一接触获得样品提取液，将样品提取液与氯金酸溶液和十六烷基三甲基溴化铵溶液在PBS缓冲液中进行第二接触获得反应混合液，将反应混合液在60℃-100℃下孵育4-12分钟后观察反应混合液的颜色变化。
2.根据权利要求1所述的动物体液中的β-受体激动剂类药物的检测方法，其特征在于，以体积份计，所述反应混合液包括：样品提取液0.5-1份、氯金酸溶液0.9-1.1份、十六烷基三甲基溴化铵溶液0.9-1.1份、PBS缓冲液7-7.5份。
3.根据权利要求2所述的动物体液中的β-受体激动剂类药物的检测方法，其特征在于，反应混合液中氯金酸溶液的浓度为0.3-1.2×10-3M，十六烷基三甲基溴化铵溶液的浓度为2-8mM，PBS缓冲液的pH值为7-10。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的β-受体激动剂类药物的检测方法，其特征在于，所述第一接触包括，将待测动物体液与乙腈或乙醇震荡混匀40-60秒后静置4-6分钟获得静置混合物，再将所述静置混合物在11000-12000rpm下离心8-12分钟获得样品提取液。
5.根据权利要求4所述的动物体液中的β-受体激动剂类药物的检测方法，其特征在于，在所述第一接触中，待测动物体液与乙腈或乙醇的体积比为1：1-3；优选的，所述第一接触为待测动物体液与乙醇接触，待测动物体液与乙醇的体积比为1：2。
6.根据权利要求1-3中任意一项所述的动物体液中的β-受体激动剂类药物的检测方法，其特征在于，所述第一接触为待测动物体液与多壁碳纳米管接触，第一接触的步骤包括：
将待测动物体液与多壁碳纳米管震荡混匀5-10min后以11000-12000r/min的转速离心3-5min弃去上清液获得第一沉淀，将第一沉淀与水震荡混匀1-3min后以11000-12000r/min的转速离心3-5min弃去上清液获得第二沉淀，将第二沉淀与5％氨水甲醇震荡混匀后以11000-12000r/min的转速离心3-5min，吸取上清液获得样品提取液；
其中，所述多壁碳纳米管的表面进行了羧基化修饰、外径大于50nm，长度为20-30μm；所述5％氨水甲醇是将氨水与甲醇按照1:19的体积比混合获得的混合溶液；
其中，相对于1mL的动物体液，多壁碳纳米管的用量为5-10mg、水的用量为0.5-1mL、5％氨水甲醇的用量为0.5-1mL。
7.根据权利要求1-3和5中任意一项所述的β-受体激动剂类药物的检测方法，其特征在于，所述β-受体激动剂类药物选自莱克多巴胺、克伦特罗、沙丁胺醇、西马特罗、西布特罗、马布特罗、溴布特罗、班布特罗、非诺特罗、奥西那林、异克舒令、异丙肾上腺素、克伦普罗、氯丙那林、特布他林、妥布特罗、齐帕特罗、苯乙醇胺A、皮布特罗、马喷特罗、拉贝特罗、喷布特罗、福莫特罗、沙美特罗、异克伦潘特中的至少一种。
8.根据权利要求7所述的β-受体激动剂类药物的检测方法，其特征在于，所述动物体液为血浆、血清、乳液、尿液。
9.根据权利要求1-3、5和8中任意一项所述的β-受体激动剂类药物的检测方法，其特征在于，观察反应混合液的颜色变化，当反应混合液显淡红色或红色时，表明动物体液中存在β-受体激动剂类药物；当反应混合液不显色时，则表明动物体液中不含有β-受体激动剂类药物或β-受体激动剂类药物的总含量低于2ng/mL。
10.一种β-受体激动剂类药物检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括，
乙腈、乙醇或多壁碳纳米管；
氯金酸溶液；
十六烷基三甲基溴化铵溶液；
PBS缓冲液；
阳性对照品和/或阴性对照品。
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