CN104293742B - 同时提取白腐真菌复合吸附剂中sod、cat、nadh氧化酶和atp的方法 - Google Patents

同时提取白腐真菌复合吸附剂中sod、cat、nadh氧化酶和atp的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种同时提取白腐真菌复合吸附剂中SOD、CAT、NADH氧化酶和ATP的方法，包括以下步骤：将白腐真菌复合吸附剂加入CaCl2溶液中制成包埋白腐真菌的小球，将包埋白腐真菌的小球进行恒温振荡培养得到培养液；向培养液中加入Cd2+进行胁迫培养，然后取出包埋白腐真菌的小球，进行液氮研磨得到研磨样品；将研磨样品中加入磷酸缓冲液，冰浴下超声处理，离心得到SOD、CAT、NADH氧化酶和ATP的复合物；本发明采用重金属胁迫提高SOD、CAT、NADH氧化酶的酶活力和ATP的含量，具有细胞破碎效果好，提取效率高等优势。

Description

同时提取白腐真菌复合吸附剂中SOD、CAT、NADH氧化酶和ATP 的方法
技术领域
本发明涉及环境微生物技术领域，尤其涉及一种同时提取白腐真菌复合吸附剂中SOD、CAT、NADH氧化酶和ATP的方法。
背景技术
水中重金属离子的污染备受关注，生物吸附是一种有效去除水中重金属离子的方法。包埋白腐真菌的复合吸附剂对水中重金属离子，例如Cd2+、Pb2+、Cr6+等有很强的去除效果，重金属离子对复合吸附剂微生物有毒害作用，同时微生物对重金属离子有一定的耐受性，这与复合吸附剂的微生物的抗氧化机制和磷酸氧化机制有关。
SOD和CAT是生物体内内源性抗氧化防御系统中的主要酶，它们与自由基之间处于一种动态平衡，当细胞处于应激状态下，体内氧化磷酸化作用增强，从而产生足够的能量维持生命需要，但同时也导致了自由基的产生增多，导致脂质出现氧化损伤。如果测定的SOD和CAT活性升高，说明它们清除氧自由基的能力增强，即减少自由基带来的氧化损伤。
NADH氧化酶是细胞中重要的氧代谢酶，它能够清除细胞内氧毒性，帮助细胞抗击外界氧压力，对于维持细胞内氧平衡具有重要作用。ATP用于储存能量，当细胞需要能量时，ATP分解释放能量。当ATP的含量增大时，说明细胞需要的能量增多，此时通过调节呼吸链和氧化磷酸化反应来增加ATP的含量，满足细胞的供能需要。
目前有用粉碎-浸提-离心分离-超滤-浓缩-离心喷雾干燥的方法提取植物中SOD，用CO2超临界萃取法提取动物肝脏中CAT，用离心、超声破碎法和渗透压冲击法破碎细胞提取细菌中FMN-NADH氧化还原酶，几种传统的微生物体内ATP的提取方法有加热、超声、酸、氯仿等。由于提取SOD、CAT、NADH氧化酶和ATP的方法不尽相同，而且提取的方法复杂，要同时提取复合吸附剂的微生物SOD、CAT、NADH氧化酶和ATP就有困难。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种重金属胁迫下同时提取白腐真菌复合吸附剂中SOD、CAT、NADH氧化酶和ATP的方法，具有简单、便捷、有效、可靠等优势，其中SOD、CAT、NADH氧化酶的酶活力和ATP含量随重金属离子浓度的变化，可应用于废水中重金属的处理。
为解决上述技术问题，本发明提供一种同时提取白腐真菌复合吸附剂中SOD、CAT、NADH氧化酶和ATP的方法，包括以下步骤：
S1、将白腐真菌复合吸附剂加入CaCl2溶液中制成包埋白腐真菌的小球，将包埋白腐真菌的小球进行恒温振荡培养得到培养液；
S2、向培养液中加入Cd2+进行胁迫培养，然后取出包埋白腐真菌的小球，进行液氮研磨得到研磨样品；
S3、将研磨样品中加入磷酸缓冲液，冰浴下超声处理，离心得到SOD、CAT、NADH氧化酶和ATP的复合物。
进一步的，前述白腐真菌复合吸附剂包括氮修饰的二氧化钛、海藻酸钠溶液、白腐真菌孢子悬浮液。
进一步的，前述白腐真菌孢子悬浮液为为黄孢原毛平革菌孢子液，每mL黄孢原毛平革菌孢子悬浮液含孢子1.0×106个，前述海藻酸钠溶液中海藻酸钠的含量为2wt％。
进一步的，前述氮修饰的二氧化钛与前述2wt％的海藻酸钠、黄孢原毛平革菌孢子液的质量体积比为2g∶100ml∶100ml。
进一步的，前述S1步骤具体为：制备包埋包腐真菌的小球，然后将小球加到Kirk无机培养基中进行恒温振荡培养。
进一步的，前述振荡速度为150rpm，前述培养温度为37℃，前述培养时间为72h。
进一步的，前述S2步骤中前述Cd2+在前述培养液中的浓度为0.1～0.7mmol/L。
进一步的，前述S2步骤中前述胁迫培养的时间为12～14h。
进一步的，前述S3步骤中前述超声处理的功率为400w～600w，总时间3min～5min，单次超声持续时间为2s～4s，单次超声间隔时间为8s～12s。
本发明的创新点在于：
本发明采用重金属胁迫提取白腐真菌复合吸附剂中的SOD、CAT、NADH氧化酶和ATP，重金属镉的存在，可以增强白腐真菌复合吸附剂中的SOD、CAT、NADH氧化酶的活性，同时ATP的含量也显著提高。但是由于白腐真菌复合吸附剂的破碎难度大，这三种酶和ATP存在于细胞组织中，常规的提取方法并不能同时提取SOD、CAT、NADH氧化酶和ATP；同时提取得到的SOD、CAT、NADH氧化酶的酶活性也不高。
本发明采用液氮研磨、磷酸缓冲液提取和超声方法联合提取白腐真菌复合吸附剂中的SOD、CAT、NADH氧化酶和ATP，其中磷酸缓冲液里能发挥这三种酶活力，而液氮研磨和冰浴超声处理使细胞破碎更充分，都在低温条件下进行，能保持酶活性。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明采用液氮研磨法初步提取酶和ATP，研磨速度快，细胞破碎效果好，提取效率高。
(2)本发明将液氮研磨后的初提取物再用磷酸缓冲液提取，同时使用冰浴超声和二次离心处理，能保证提取过程中是低温环境，酶和ATP处于抑制状态，不影响酶活力测定和ATP含量的计算，且提取充分、完全。
附图说明
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
图1为本发明实施例1中白腐真菌复合吸附剂经0～0.7mmol/L的Cd2+的胁迫培养所得的体内SOD、CAT和NADH氧化酶活力变化图。
图2为本发明实施例2中白腐真菌复合吸附剂经0～0.7mmol/L的Cd2+的胁迫培养所得的体内ATP含量变化图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。其中白腐真菌采用黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)BKMF-1767，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC AF96007。
实施例1
一种重金属胁迫下同时提取白腐真菌复合吸附剂中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和还原型辅酶I氧化酶(NADH氧化酶)和ATP的方法，包括以下步骤：
(1)把2g氮修饰二氧化钛加入100mL质量分数为2％的海藻酸钠溶液中得到混合溶液，将100mL孢子数为1.0×106个/mL的黄孢原毛平革菌孢子悬液加入到上述混合溶液中，搅拌均匀得到白腐真菌复合吸附剂。用注射器将白腐真菌复合吸附剂滴加到200mL质量分数为3％的CaCl2溶液中制成包埋黄孢原毛平革菌的小球。把包埋有黄孢原毛平革菌的小球加到Kirk无机培养基(Kirk无机培养基的组分为1.2mmol/L的酒石酸铵，56mmol/L的葡萄糖，20mmol/L的无水乙酸钠，0.2g/L的KH2PO4，0.05g/L的MgSO4·7H2O，0.01g/L的CaCl2，1ml/L的无机溶液，0.5ml/L的维生素溶液)中进行恒温振荡培养72h，振荡培养的温度是37℃，振荡速度150rpm，得到培养液。
(2)将步骤(1)制备得到的培养液平均分为6组，向每组培养液中分别加入Cd2+，使最终溶液的Cd2+的浓度分别为0、0.1mM、0.25mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM；然后将培养液进行胁迫培养12h(胁迫培养的时间为12～14h均能达到相同或相似的技术效果)，取出包埋小球过滤分离并用蒸馏水清洗3次，将水分去掉测定湿重(每组中取3个出来测定干重)，用液氮将其研磨得到研磨样品。
(3)将步骤(2)中制备得到的研磨样品加入0～4℃预冷的浓度为0.2mol/L pH 7.8的磷酸缓冲液定容至40mL，转移到离心管中，冰浴下超声处理(超声处理的功率为500w，总时间3min，单次超声持续时间为3s，单次超声间隔时间为9s)，然后8000r/min离心15min，取上清液为提取液于0～4℃保存备用。
实施例1仅为本发明的优选实施例，在本发明中超声处理的功率为400w～600w，总时间3min～5min，单次超声持续时间为2s～4s，单次超声间隔时间为8s～12s均能达到相同或相似的技术效果。
测定提取液中SOD、CAT、NADH氧化酶的酶活力：
测定SOD酶活力：
取10mL提取液于4℃下以8000r/min离心15min，取离心后的上清液作为酶液，将酶液采用硝基四唑氮蓝法测定SOD酶活力。
酶促反应体系包括1.5mL的0.05mol/L pH 7.8的磷酸缓冲液；0.3mL的0.013mol/L甲硫氨基酸溶液；0.3mL的75μmol/L硝基四唑氮蓝溶液；0.3mL的10μmol/L EDTA-Na2；0.3mL的2μmol/L核黄素溶液；0.05mL酶液。
对照反应体系：不加实施例1的提取液(相当于酶促反应体系中的酶液)，其余成分与酶促反应体系相同的的反应体系。
将上述酶促反应体系装于透光性好的容器中并混合均匀，然后置于4000lx，将上述对照反应体系装于另一容器中混合均匀后置于暗处放置相同时间(20min)。反应结束后以不照光的对照管作为空白，在波长560nm下测定各管吸光度。以抑制硝基四唑氮蓝光化反应为蓝色的甲腙的50％为一个酶活单位计算SOD活性。
其中，Ack表示对照管的吸光度，AE表示样品管的吸光度，V表示样品液总体积(mL)，Vt表示测定时样品用量(mL)，W表示样品鲜重。
测定CAT酶活力：
取10mL提取液于4℃下离心15min，离心转速4000r/min，取离心后的上清液作为酶液，将酶液采用紫外吸收法测定CAT酶活力。
酶促反应体系包括1.5mL的0.2mol/L pH 7.0的磷酸缓冲液，0.3mL的0.01mol/LH2O2，1.0mL的蒸馏水，0.2mL的酶液。
将上述酶促反应体系于240nm下测定吸光度的变化量，以每分钟吸光度减少0.1为一个酶活单位计算CAT酶活性。
其中，V1表示样品液总体积(mL)，Vt表示测定时样品用量(mL)，Fw表示样品鲜重,t表示反应时间。
测定NADH酶活力：
取10mL的提取液加入3mL 0.2mol/L的NaOH溶液萃取NADH，50℃水浴10min，然后迅速放入冰中冷却至0℃，接着加入1.5mL浓度为0.2mol/L HCl溶液，于4℃下离心15min，离心转速8000r/min，取离心后的上清液作为酶液，将酶液采用酶循环法测定NADH氧化酶活力。
酶促反应体系包括150μL的酶液，0.9mL的纯水，0.6mL的1.0mol/L(pH 8.0)Bicinebuffer，0.3mL的乙醇，0.3mL的40mmol/L EDTA，0.3mL的4.2mmol/L MTT，0.6mL的16.6mmol/L PES，150的μL乙醇脱氢酶。
将上述酶促反应体系在570nm条件下测定吸光度的变化量，以每分钟吸光度增加0.1为一个酶活单位计算NADH酶活性。
其中，V1表示样品液总体积(mL)，Vt表示测定时样品用量(mL)，Fw表示样品鲜重,t表示反应时间。
如图1所示，实施例1中测定的复合吸附剂体内的SOD、CAT和NADH氧化酶活力随镉胁迫浓度的变化图。从图1可以看出，随着镉浓度的增长，复合吸附剂体内的SOD、CAT和NADH氧化酶活力呈先升高后下降的趋势，说明SOD、CAT和NADH氧化酶是抗氧化系统的重要组成部分，其能清除细胞内的活性自由基，降低细胞内的氧化压力。但高浓度镉离子胁迫，抗氧化系统的酶活性降低，酶的功能受到损伤，对细胞生长不利。
测定ATP含量：
将步骤(3)的提取液经滤膜过滤，用HPLC法测定ATP含量，以ATP标准品为标准曲线计算ATP含量。
ATP测定的色谱条件：流动相：0.2mol/L磷酸盐缓冲液(取磷酸氢二钠35.8g，磷酸二氢钾13.6g，加水900mL溶解，用1mol/L氢氧化钠调pH至7.0，加入四丁基溴化铵1.61g，加水至1000mL)-甲醇95∶5比例混合；流速1m/min，检测波长259nm，柱温35℃，进样量10uL。
如图2所示，是实施例1测定的复合吸附剂体内ATP含量随镉胁迫浓度的变化图。从图2可以看出，随着镉浓度的增长，复合吸附剂体内的ATP含量呈先升高后下降的趋势，说明镉胁迫会促使细胞发生磷酸化反应产生ATP，以供细胞消耗能量，但高浓度镉离子胁迫下，ATP产生量减少，此时细胞趋于死亡。
综合实施例1的检测结果可知，当镉浓度为0.6mM时，白腐真菌复合吸附剂中SOD酶的活性最高；当镉浓度为0.25mM时，白腐真菌复合吸附剂中CAT和NADH氧化酶活力、ATP的含量最高，同时SOD酶的活性也具有较高的水平。
对比例1
在重金属胁迫下，采用液氮研磨法和磷酸缓冲液提取白腐真菌复合吸附剂中SOD、CAT、NADH氧化酶和ATP的方法。
(1)把2g氮修饰二氧化钛加入100mL质量分数为2％的海藻酸钠溶液中得到混合溶液，将100mL孢子数为1.0×106个/mL的黄孢原毛平革菌孢子悬液加入到上述混合溶液中，搅拌均匀得到白腐真菌复合吸附剂。用注射器将白腐真菌复合吸附剂滴加到200mL质量分数为3％的CaCl2溶液中制成包埋黄孢原毛平革菌的小球。把包埋有黄孢原毛平革菌的小球加到Kirk无机培养基(Kirk无机培养基的组分为1.2mmol/L的酒石酸铵，56mmol/L的葡萄糖，20mmol/L的无水乙酸钠，0.2g/L的KH2PO4，0.05g/L的MgSO4·7H2O，0.01g/L的CaCl2，1ml/L的无机溶液，0.5ml/L的维生素溶液)中进行恒温振荡培养72h，振荡培养的温度是37℃，振荡速度150rpm，得到培养液。
(2)将步骤(1)制备得到的培养液加入Cd2+，使最终溶液的Cd2+的浓度为0.25mM，然后将培养液培养12h，取出包埋小球过滤分离并用蒸馏水清洗3次，将水分去掉测定湿重(每组中取3个出来测定干重)，用液氮将其研磨得到研磨样品。
(3)将步骤(2)中制备得到的研磨样品加入0～4℃预冷的浓度为0.2mol/L pH 7.8的磷酸缓冲液定容至40mL，转移到离心管中，8000r/min离心15min得到上清液，取上清液作为提取液用于测定SOD、CAT、NADH氧化酶活力和ATP含量。
对比例2
在重金属胁迫下，采用超声破碎法提取白腐真菌复合吸附剂中SOD、CAT、NADH氧化酶和ATP的方法。
(1)把2g氮修饰二氧化钛加入100mL质量分数为2％的海藻酸钠溶液中得到混合溶液，将100mL孢子数为1.0×106个/mL的黄孢原毛平革菌孢子悬液加入到上述混合溶液中，搅拌均匀得到白腐真菌复合吸附剂。用注射器将白腐真菌复合吸附剂滴加到200mL质量分数为3％的CaCl2溶液中制成包埋黄孢原毛平革菌的小球。把包埋有黄孢原毛平革菌的小球加到Kirk无机培养基(Kirk无机培养基的组分为1.2mmol/L的酒石酸铵，56mmol/L的葡萄糖，20mmol/L的无水乙酸钠，0.2g/L的KH2PO4，0.05g/L的MgSO4·7H2O，0.01g/L的CaCl2，1ml/L的无机溶液，0.5ml/L的维生素溶液)中进行恒温振荡培养72h，振荡培养的温度是37℃，振荡速度150rpm，得到培养液。
(2)将步骤(1)制备得到的培养液加入Cd2+，使最终溶液的Cd2+的浓度为0.25mM，然后将培养液培养12h，取出包埋小球过滤分离并用蒸馏水清洗3次，将水分去掉测定湿重(每组中取3个出来测定干重)，用冰浴超声破碎包埋小球(超声破碎的功率为500w，总时间3min，单次超声持续时间为3s，单次超声间隔时间为9s)，然后用蒸馏水定容至40mL，转移到离心管中，以8000r/min离心15min得到上清液，取上清液作为提取液用于测定SOD、CAT、NADH氧化酶活力和ATP含量。
测定对比例1和对比例2中，镉浓度为0.25mM时，提取液中SOD、CAT和NADH氧化酶活力、ATP的含量，并与实施例1中同一镉浓度的下SOD、CAT和NADH氧化酶活力、ATP的含量进行对比，对比结果列于表1中。
表1：提取液中SOD、CAT、NADH氧化酶的酶活力及ATP含量检测结果表
从表1的结果可知：采用液氮研磨、磷酸缓冲液和超声处理联合提取的方法测得的酶活和ATP含量比单独采用液氮研磨和缓冲液提取和单独采用超声提取的提取率高，说明在本发明中，液氮研磨、磷酸缓冲液提取、和超声提取之间具有相互作用，从而进一步提高了提取液中SOD、CAT和NADH氧化酶活力、ATP的含量，效果更好。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims (5)

1.一种同时提取白腐真菌复合吸附剂中SOD、CAT、NADH氧化酶和ATP的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将白腐真菌复合吸附剂加入CaCl2溶液中，制成包埋白腐真菌的小球，将包埋白腐真菌的小球进行恒温振荡培养得到培养液；所述白腐真菌复合吸附剂包括氮修饰的二氧化钛、海藻酸钠溶液、白腐真菌孢子悬浮液；
S2、向所述培养液中加入Cd2+进行胁迫培养，然后取出所述包埋白腐真菌的小球，进行液氮研磨得到研磨样品；
S3、将所述研磨样品中加入磷酸缓冲液，冰浴下超声处理，离心得到SOD、CAT、NADH氧化酶和ATP的复合物；
所述S2步骤中所述Cd2+ 在所述培养液中的浓度为0.1～0.7 mmol/L；所述胁迫培养的时间为12～14h；
所述S3步骤中所述超声处理的功率为400 w～600 w，总时间3 min～5 min，单次超声持续时间为2 s～4 s，单次超声间隔时间为8 s～12 s。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述白腐真菌孢子悬浮液为黄孢原毛平革菌孢子液，每mL黄孢原毛平革菌孢子悬浮液含孢子1.0×106个，所述海藻酸钠溶液中海藻酸钠的含量为2wt%。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述氮修饰的二氧化钛与所述2wt%的海藻酸钠、黄孢原毛平革菌孢子液的质量体积比为2 g∶100 ml∶100 ml。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述S1步骤中所述恒温振荡培养具体为：将包埋白腐真菌的小球加到Kirk无机培养基中进行恒温振荡培养。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述振荡速度为150 rpm，所述培养温度为37℃，所述培养时间为72 h。
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